Name: Murine Hind Gliedmaßen langen Knochen Dissection und Knochenmark-Isolation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Lernen Sie die schnelle Präparation von Femur und Tibia bei Labormäusen und die sterile Knochenmarkisolation durch Zentrifugation. Diese standardisierte Methode ermöglicht reproduzierbare Analysen in der Knochenmarkbiologie und Immunologie.

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Diese Arbeit wurde durch die NCI-Zuschüsse Nr. U54CA143803, CA163124, CA093900 und CA143055 an K.J.P. unterstützt. Die Autoren danken den aktuellen und ehemaligen Mitgliedern des Weilbaecher-Labors, insbesondere Katherine Weilbaecher, Michelle Hurchla und Hongju Deng, sowie den Mitgliedern des Brady Urological Institute, insbesondere den Mitgliedern des Pienta-Labors, für die kritische Lektüre des Manuskripts.

Alle tierischen Arbeit wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee in Übereinstimmung mit den Empfehlungen in dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health skizzierte genehmigt. 1. Hind Gliedmaßen langen Knochen Dissection <ol><li> Euthanize die Maus gemäß den Richtlinien des Instituts. </li><li> Bewegen Sie die Maus in Rückenlage und bringen durch alle vier Beine durch die Maus Fußballen unter dem Sprunggelenk feststecken. </li><li> Sprühen Sie die Maus mit 70% Ethanol, gründlich die Beine Begießen. </li><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt auf der rechten Seite der Mittellinie in den Unterbauch, knapp oberhalb der Hüfte. </li><li> Ziehen Sie den Einschnitt in den Beinen und vorbei am Sprunggelenk. </li><li> Ziehen Sie die Haut zurück und schneiden Sie die Quadrizeps-Muskel proximalen Ende des Oberschenkelknochens verankert die Vorderseite des Oberschenkels zu entlarven und Stift aus dem Bein aus, um den Stift in einem 45-Grad-Winkel von der Platine platzieren. </li><li> Mit dem blade der Schere gegen die hintere Seite des Oberschenkels, schneiden Sie die Beinbeuger aus dem Kniegelenk entfernt. </li><li> Ziehen Sie die Haut zurück, und die hinteren Oberschenkelmuskeln zu proximalen Ende des Oberschenkelknochens verankert die hintere Seite des Oberschenkels zu entlarven und Stift aus dem Bein aus, um den Stift in einem 45-Grad-Winkel von der Platine platzieren. </li><li> Mit der Zange, halten das distale Ende des Femurs, direkt über dem Kniegelenk. Führen Sie die Klingen der Schere auf beiden Seiten der Femurschaft in Richtung des Hüftgelenks, wobei darauf geachtet, nicht zu schneiden, in den Oberschenkelknochen selbst. </li><li> Nach dem Hüftkopf zu erreichen, durch die Schere leicht zu öffnen angezeigt, drehen Sie die Schere mit der oberen Klinge der Schere direkt über dem Hüftkopf Bewegen des Oberschenkels zu verrücken, man aufpassen, nicht die Knochen unterhalb des Hüftkopfes zu schnappen. </li><li> Fassen Sie den oberen Teil des Oberschenkelschaft mit der Zange, schneiden Sie das Weichgewebe aus dem Hüftkopf entfernt es aus der Hüftpfanne zu lösen. </li><li> Ziehen Sie die gesamte Beinknochen, einschließlichFemur, Knie und Schienbein, nach oben und weg vom Körper, Schneiden sorgfältig das Bindegewebe und Muskulatur verbindet das Bein auf die Haut entfernt. </li><li> Vorwagt das Sprunggelenk und wieder die Schere in einer Drehbewegung verwenden, um die Tibia zu verrücken. </li><li> Greifen die distale Ende der Tibia, dabei nicht die Sehnen zu trennen, ziehen Sie die Tibia nach oben und weg vom Körper und dem Stift Bord. </li><li> Schneiden jegliches verbleibende Bindegewebe den langen Knochen am Knie an der Maus befestigt. </li><li> Entfernen Sie alle zusätzlichen Muskel oder Binde am Femur befestigt Gewebe und der Tibia. </li><li> Für alle Anwendungen , die den Knochen erfordern intakt (Histologie, Histomorphometrie, biomechanische Tests, etc.) Zu bleiben, mit Standard-Haus Protokolle (wie in 4-7) um fortzufahren. Um Knochenmark zu isolieren, gehen Sie zu Abschnitt 2. </li></ol> 2. Lange Knochenpräparation für Knochenmark-Isolation <ol><li> Mit Hilfe der Pinzette fassen Sie den Oberschenkelknochen mit der Patella abgewandten einnd das proximale Ende (Hüftkopf) nach unten. </li><li> Vorwagt, das Kniegelenk und die Schere in einer Drehbewegung der Tibia zu verrücken und Femur. </li><li> Schneiden Sie Bindegewebe zusammen, um den Oberschenkel und Schienbein zu halten. </li><li> Mit Hilfe der Pinzette fassen Sie den Oberschenkelknochen mit dem vorderen abgewandten Seite und dem proximalen Ende (Hüftkopf Ende) nach unten. </li><li> Führen Sie die Schere, um die Femurschaft zu den Kondylen nach oben. </li><li> Vorsichtig drehen die Schere hin und her die Kondylen, die Patella zu entfernen, und die Epiphyse die Metaphyse zu belichten. </li><li> Entfernen Sie alle zusätzlichen Muskel oder Binde am Femur befestigt Gewebe mit einer Pinzette, Schere und Kimwipes. </li><li> Mit Hilfe der Pinzette greifen die Tibia mit der vorderen Seite abgewandten und dem distalen Ende (Knöchel Ende) nach unten. </li><li> Wenn die Tibiaepiphyse intakt ist, führen die Schere der Tibia Welle auf die Kondylen. </li><li> Drehen Sie vorsichtig die Schere hin und her die Kondylen zu entfernen und Epiphyse die Metaph aussetzenlyse. </li><li> Entfernen Sie alle Muskeln oder Binde an der Tibia befestigt Gewebe mit einer Pinzette, Schere und Kimwipes. </li></ol> 3. Bone Marrow Isolation <ol><li> Drücken eine 18 G Nadel durch den Boden eines 0,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Legen Sie die langen Knochen (maximal 2 Oberschenkel- und 2 tibiae) in das Rohr, Knie-Ende nach unten am Ende nach unten und den Deckel schließen. </li><li> Nest der 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Zentrifugiere die Röhrchen bei nested ≥10,000 xg in einer Mikrozentrifuge für 15 Sekunden. </li><li> Stellen Sie sicher, dass das Knochenmark wurde aus den Knochen durch visuelle Inspektion gesponnen worden. Die Knochen sollte erscheinen weiß und es sollte eine große visuelle Pellet in dem größeren Rohr sein. </li><li> Entsorgen Sie die 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit den Knochen. </li><li> Hängen Sie das Knochenmark in geeigneten Lösung (zB PBS, Kulturmedien, FACS - Puffer) und fahren Sie mit experimentellen Protokoll (DNA, RNA oder Proteinisolierung,FACS-Analyse oder primäre Zellkultur). </li></ol>

<ol><li>McHayleh, W. M., Ellerman, J., Roodman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ch.+80%5BTitle%5D)+AND+%22Primer+on+the+Metabolic+Bone+Diseases+and+Disorders+of+Mineral+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Ch. 80.</a> Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism. , American Socieyt for Bone and Mineral Research. 379-381 (2008).</li>
<li>Weilbaecher, K. N., Guise, T. A., McCauley, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+to+bone%3A+a+fatal+attraction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer to bone: a fatal attraction.</a> Nat Rev Cancer. 11 (6), 411-425 (2011).</li>
<li>Pedersen, E. A., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prostate+cancer+bone+marrow+niche%3A+more+than+just+%27fertile+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J+Androl%22%5BJournal%5D)">The prostate cancer bone marrow niche: more than just 'fertile soil.</a> Asian J Androl. 14 (3), 423-427 (2012).</li>
<li>Amend, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondin-1+regulates+bone+homeostasis+through+effects+on+bone+matrix+integrity+and+nitric+oxide+signaling+in+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Thrombospondin-1 regulates bone homeostasis through effects on bone matrix integrity and nitric oxide signaling in osteoclasts.</a> J Bone Miner Res. 30 (1), 106-115 (2015).</li>
<li>Hurchla, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epoxyketone-based+proteasome+inhibitors+carfilzomib+and+orally+bioavailable+oprozomib+have+anti-resorptive+and+bone-anabolic+activity+in+addition+to+anti-myeloma+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The epoxyketone-based proteasome inhibitors carfilzomib and orally bioavailable oprozomib have anti-resorptive and bone-anabolic activity in addition to anti-myeloma effects.</a> Leukemia. 27 (2), 430-440 (2013).</li>
<li>Rauch, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ARF+tumor+suppressor+regulates+bone+remodeling+and+osteosarcoma+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The ARF tumor suppressor regulates bone remodeling and osteosarcoma development in mice.</a> PLoS One. 5 (12), e15755(2010).</li>
<li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ADP+receptor+P2RY12+regulates+osteoclast+function+and+pathologic+bone+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The ADP receptor P2RY12 regulates osteoclast function and pathologic bone remodeling.</a> J Clin Invest. 122 (10), 3579-3592 (2012).</li>
<li>Dempster, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+nomenclature%2C+symbols%2C+and+units+for+bone+histomorphometry%3A+a+2012+update+of+the+report+of+the+ASBMR+Histomorphometry+Nomenclature+Committee%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Standardized nomenclature, symbols, and units for bone histomorphometry: a 2012 update of the report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee.</a> J Bone Miner Res. 28 (1), 2-17 (2013).</li>
<li>Begley, C. G., Ellis, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+development%3A+Raise+standards+for+preclinical+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drug development: Raise standards for preclinical cancer research.</a> Nature. 483 (7391), 531-533 (2012).</li>
<li>Festing, M. F., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+design+and+statistical+analysis+of+experiments+using+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the design and statistical analysis of experiments using laboratory animals.</a> ILAR J. 43 (4), 244-258 (2002).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Wir stellen eine einfache und effiziente Methode zur Entnahme von langen Knochen der Maus und der anschließenden Knochenmarkisolierung vor. Diese Methode erhält die hohe strukturelle und zelluläre Integrität der Knochen und des Knochenmarks und hat eine geringe Bearbeitungszeit, wodurch die Wahrscheinlichkeit von benutzerinduzierten Frakturen oder Knochenbewertungen, die nachgelagerte Analysen beeinflussen können, minimiert wird. Darüber hinaus erfordert die Zentrifugationsmethode zur Isolierung des Knochenmarks kein Schneiden des Knochenmarks, um den Knochenmarkraum freizulegen, oder Flüssigkeit, um das Knochenmark zu spülen, wodurch potenzielle Kontaminationspunkte reduziert werden. Darüber hinaus hat die Zentrifugentechnik einen relativ hohen Durchsatz mit geringerem Arbeitsaufwand als andere Methoden, wodurch die Verarbeitungszeit verkürzt wird.
Eine hohe Variation ist In-vivo-Mausstudien aufgrund der hohen phänotypischen Variation von Maus zu Maus inhärent. Um den Forschungseffekt teurer und arbeitsintensiver Mausstudien zu maximieren, ist es entscheidend, technische experimentelle Fehler zu minimieren9,10. Die Zeit von der Tiertötung bis zur nachgelagerten Analyse oder Gewebefixierung führt zu experimentellen Variationen, die subtile Veränderungen überwinden und große Unterschiede zwischen den Gruppen verringern können. Daher ist eine schnelle Verarbeitung der Proben für eine genaue Datenanalyse unerlässlich. Die hier beschriebenen Techniken zur Dissektion langer Knochenknochen und zur Isolierung des Knochenmarks sind für die schnelle Verarbeitung von Tieren und Proben optimiert, um technische Abweichungen zu reduzieren.
Dieses Protokoll kann in vielen Forschungsbereichen angewendet werden, einschließlich der Untersuchung des Knochengewebes selbst oder der Befragung der Zellen des Knochenmarks. Darüber hinaus wird dieser unkomplizierte Ansatz zur Dissektion langer Knochen es Forschern in verwandten Bereichen ermöglichen, Knochenbeiträge direkt zu befragen, um unser Wissen über Knochenmarkfunktionsstörungen bei bisher wenig untersuchten Pathologien zu erweitern.

Das Studium der langen Knochen und der Zellen des Knochenmarks ist zentral für eine Vielzahl von Forschungsdisziplinen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Knochenbiologie, Krebsbiologie, Immunologie, Hämatologie und Biomechanik. Der Knochen ist ein hochdynamisches Organ, das zusammen mit dem Knorpel das Skelett bildet, um die inneren Organe mechanisch gegen Belastungen zu stützen und zu schützen. Darüber hinaus sind die mineralischen Bestandteile des Knochens eine Speichersenke für die kritischen Signalmoleküle Kalzium und Phosphor sowie andere Faktoren1. Schließlich beherbergen Knochen das Knochenmark und bilden zusammen mit stoffwechselaktiven knochenbildenden Osteoblasten und knochenresorbierenden Osteoklasten die Stammzellnische, die für die Aufrechterhaltung hämatopoetischer und lymphatischer Zellpopulationen notwendig ist.
Knochen und Knochenmark sind bei vielen Erkrankungen betroffen, was oft zu Knochenmarkfunktionsstörungen, starken Knochenschmerzen und pathologischen Frakturen führt. Knochen ist eine häufige Metastasierungsstelle bei vielen soliden Tumoren, vor allem bei Brustkrebs und Prostatakrebs, wo Tumorzellen direkt in die Knochenmarknische eingreifen, um den Teufelskreis der Knochenmetastasierung einzuleiten und hämatopoetische Stammzellen zu verdrängen2,3. Hämatopoetische Malignome wie Myelom und Leukämie sind gekennzeichnet durch eine Dysfunktion des Knochenmarks sowie eine Deregulierung des gesunden Knochenumbaus1. Auch andere nicht-maligne Skeletterkrankungen sind aktive Forschungsgebiete wie Arthrose, Osteoporose, Skoliose und Rachitis. Selbst bei einem ansonsten gesunden Menschen führt ein biomechanisches Versagen eines Knochens zu einer schmerzhaften Fraktur. Alle diese Erkrankungen stellen aktive Forschungsbereiche dar, mit dem Ziel, neue Präventionsmaßnahmen und Behandlungsschemata zu identifizieren, um Morbidität und Mortalität zu reduzieren.
Um die Fülle der Rollen des Knochens und des Knochenmarks zu erforschen, sowohl unter physiologischen als auch unter pathologischen Bedingungen, ist es für Forscher von entscheidender Bedeutung, eine einfache und effiziente standardisierte Methode zum Sezieren der langen Knochen der Maus für die schnelle Verarbeitung großer in vivo Experimente zu haben. Das hier skizzierte Dissektionsprotokoll eignet sich für alle Analysen langer Knochen, einschließlich Ex-vivo-Bildgebung, Histologie, Histomorphometrie und Krafttests. In ähnlicher Weise ist eine standardisierte Knochenmarkisolierungsmethode mit hoher Knochenmarkzellrückgewinnung und geringer Variabilität zwischen den Anwendern wichtig für experimentelle Analysen wie die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) oder quantitative PCR (qPCR) sowie für nachgelagerte Anwendungen wie die primäre Zellkultur von Knochenmarkzellen.

<table><tbody><tr><td>Pinboard</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pins</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissektionschere&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Präparierzange</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>16 G Nadel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen Mikrozentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

murine hind gliedmaßen langen knochen dissection und knochenmark-isolation

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Die Untersuchung des Knochens und des Knochenmarks ist in vielen Forschungsbereichen von entscheidender Bedeutung, einschließlich der grundlegenden Knochenbiologie, Immunologie, Hämatologie, Krebsmetastasierung, Biomechanik und Stammzellbiologie. Trotz der Bedeutung des Knochens in einem gesunden und pathologischen Zustand ist er jedoch ein weitgehend untererforschtes Organ, da es an Fachkenntnissen über die Knochendissektion und die Isolierung des Knochenmarks mangelt. Mäuse sind ein gängiger Modellorganismus zur Untersuchung von Auswirkungen auf Knochen und Knochenmark, was eine standardisierte und effiziente Methode zur Dissektion langer Knochen und zur Isolierung des Knochenmarks für die Verarbeitung großer experimenteller Kohorten erforderlich macht. Wir beschreiben ein einfaches Dissektionsverfahren zur Entfernung des Femurs und der Tibia, das für Downstream-Anwendungen geeignet ist, einschließlich, aber nicht beschränkt auf histomorphologische Analysen und Krafttests. Darüber hinaus skizzieren wir ein schnelles Verfahren zur Isolierung von Knochenmark aus den langen Knochen durch Zentrifugation mit begrenzter Handhabungszeit, ideal für die Zellsortierung, primäre Zellkultur oder DNA-, RNA- und Proteinextraktion. Das Protokoll ist für eine schnelle Verarbeitung von Proben optimiert, um experimentelle Fehler zu begrenzen, und ist standardisiert, um die Variabilität von Benutzer zu Benutzer zu minimieren.

Das hier beschriebene Protokoll ist für eine schnelle Präparation der Maus Femur und Tibia mit einem Minimum an Beschädigung des Knochengewebes optimiert. Diese Technik ist für eine Anzahl von Downstream - Analysen geeignet, einschließlich Biomechanik Studien Histomorphometrie (1A - B) und Histologie (1C) 4,7. Der Vertreter histomophometric micoCT 3D - Rekonstruktion (1A - B) zeigt , dass sowohl die Spongiosa und kortikalen Schale aufrechterhalten werden, die für eine genaue Quantifizierung der standardisierten Strukturparameter für Knochenhistomorphometrie ermöglicht, einschließlich trabekulären Anzahl, Dicke und Beabstandung; Knochenvolumen; und kortikalen Dicke unter anderem Maßnahmen 8. Der Vertreter histologischen Schnitt zeigt eine H &amp; E - gefärbten Formalin-fixierten und entkalkt Tibia (1C). Das Bild zeigt die Integrität sowohl des verkalkten bein und zelluläre Knochenmark für die histologische Analyse. Das Knochenmark Isolierungsverfahren bewahrt die Sterilität des Knochenmarks Raum, hat eine geringe Handhabung Kontamination zu reduzieren, und nicht das Schneiden des langen Knochens erfordert, wodurch Verlust von Knochenmark-Ausbeute. Das Knochenmark ist geeignet für viele Downstream - Anwendungen, einschließlich Durchflusszytometrie 5 und PCR - Analysen. Darüber hinaus kann dieses Verfahren verwendet werden , um Knochenmark für die primäre Zellkultur von Knochenmarkzellen zu isolieren, einschließlich der Osteoklasten und Osteoblasten (2A - B) 4,6. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53936/53936fig1.jpg" /> Abbildung 1. Histomorphologische und histologische Analysen der Maus langen Knochen. Dreidimensionale microCT Rekonstruktion einer Maus Tibia (A) , um die äußere Rindenschale zeigt und (B </s<html> trong&gt;) Spongiosa (Maßstab = 0,5 mm). (C) Histologische H &amp; E-Färbung eines entkalkt und schnittene Tibia (4x). Bilder mit freundlicher Genehmigung von Katherine Weilbaecher, Washington University School of Medicine, USA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53936/53936fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53936/53936fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53936/53936fig2.jpg" /> Abbildung 2. Primäre Knochenmarkzellkultur für die Differenzierung von Osteoklasten und Osteoblasten. (A) TRAP - Färbung für mehrkernige Osteoklasten nach 7 Tagen in osteoclastogenic Medien (4x). (B) Die alkalische Phosphatase (violette Farbe) für Osteoblasten und Alizarin rot (rote Farbe) Fleck für die Mineralisierung nach 21 Tagen in osteogenen Medien. Bilder mit freundlicher Genehmigung von Katherine Weilbaecher, Washington University School of Medicine, USA.iles / ftp_upload / 53936 / 53936fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Dissektion von langen Knochen der Hintergliedmaßen (Femure und Tibiae) von der Labormaus. Des Weiteren beschreiben wir eine schnelle Technik zur Knochenmarkisolierung aus diesen Knochen, bei der Zentrifugation zur Entnahme von Knochenmark aus dem Knochenmarkraum eingesetzt wird.

Murine Hind Gliedmaßen langen Knochen Dissection und Knochenmark-Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Das übergeordnete Ziel dieser Dissektion langer Knochen und der Isolierung von Knochenmark besteht darin, die langen Knochen schnell und systematisch zu entfernen und das Knochenmark für weitere nachgeschaltete Analysen zu gewinnen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Knochenmarkbiologie, Krebsmetastasierung und Immunologie zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass der Dissektionsprozess schnell und standardisiert ist und die Knochenmarkisolierung relativ steril erfolgt. Beginnen Sie damit, die Maus in Rückenlage zu positionieren.Dann fixieren Sie alle vier Ballen unterhalb des Sprunggelenks und besprühen die Maus mit 70 % Ethanol, wobei die Beine gründlich benetzt werden. Als Nächstes führen Sie einen kleinen Schnitt rechts der Mittellinie im unteren Bauchbereich knapp oberhalb der Hüfte durch und verlängern den Schnitt entlang des Beins über das Sprunggelenk hinaus. Ziehen Sie die Haut zurück.Danach den am proximalen Ende des Femurs befestigten Quadrizepsmuskel durchtrennen, um die vordere Seite des Oberschenkelknochens freizulegen, und den Muskel mit einer Nadel im 45-Grad-Winkel zur Unterlage vom Bein weg fixieren. Mit der Schere an der Rückseite des Femurs die Hamstringmuskeln vom Kniegelenk abschneiden. Anschließend die Haut und die am proximalen Ende des Femurs befestigten Hamstringmuskeln zurückziehen, um die hintere Seite des Knochens freizulegen, und die Hamstringmuskeln mit einer Nadel im 45-Grad-Winkel vom Bein weg fixieren.Mit der Pinzette wird das distale Ende des Femurs knapp oberhalb des Kniegelenks erfasst. Anschließend werden die Scherenklingen beidseits des Femurschafts in Richtung Hüftgelenk geführt. Nach Erreichen des Femurkopfs werden die Schere verdreht, wobei die obere Klinge direkt über den Femurkopf bewegt wird, um den Femur zu luxieren.Fassen Sie nun die Spitze des Femurschafts mit der Pinzette und schneiden Sie das Weichgewebe vom Femurkopf ab, um den Femur aus dem Acetabulum zu lösen. Ziehen Sie dann den gesamten Beinknochen, einschließlich Femur, Knie und Tibia, nach oben und vom Körper weg und schneiden Sie vorsichtig das Bindegewebe und die Muskulatur ab, die das Bein mit der Haut verbinden. Wenn das gesamte Bindegewebe entfernt ist, überstrecken Sie das Sprunggelenk und drehen Sie die Schere wie zuvor gezeigt, um die Tibia zu luxieren.Greifen Sie das distale Ende der Tibia und achten Sie darauf, die Sehnen nicht zu durchtrennen. Ziehen Sie die Tibia dann nach oben und weg vom Körper und vom Pin-Board. Entfernen Sie anschließend das restliche Bindegewebe, das am langen Knochen am Knie haftet, sowie jegliche zusätzliche Muskulatur oder Bindegewebsanteile, die am Femur und an der Tibia anhängen. Um den langen Knochen für die Isolierung des Knochenmarks vorzubereiten, halten Sie den Femur mit der Patella nach außen gerichtet und dem Femurkopf nach unten zeigend.Überstrecken Sie das Kniegelenk und drehen Sie die Schere, um die Tibia vom Femur zu lösen. Entfernen Sie anschließend das Bindegewebe, das Femur und Tibia verbindet. Fassen Sie danach den Femur mit der ventralen Seite nach außen und dem Femurkopf nach unten gerichtet und führen Sie die Schere entlang des Femurschafts bis zu den Condylus.Drehen Sie die Schere vorsichtig hin und her, um die Condyle, die Kniescheibe und die Epiphyse zu entfernen und so die Metaphyse freizulegen. Verwenden Sie dann Pinzette, Schere und Kimwipes, um zusätzliches Muskel- oder Bindegewebe, das am Femur anhaftet, zu entfernen. Fassen Sie anschließend die Tibia mit der vorderen Seite nach außen und dem Knöchelende nach unten gerichtet. Falls die tibiale Epiphyse intakt ist, führen Sie die Schere entlang des Tibiadiaphysen bis zu den Condylus und drehen die Schere vorsichtig hin und her, um die Condyle und Epiphyse zu entfernen, wodurch die tibiale Metaphyse freigelegt wird. Entfernen Sie anschließend jegliches zusätzliche Muskel- oder Bindegewebe, das an der Tibia anhängt, wie zuvor gezeigt. Um das Knochenmark zu gewinnen, schieben Sie zunächst eine 18-Gauge-Nadel durch den Boden eines 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchens.Bringen Sie dann die langen Knochen mit dem Knieende nach unten in das Röhrchen ein und schließen Sie den Deckel. Stellen Sie das 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie die Röhrchen für 15 Sekunden mit mindestens 10.000 × g in einer Mikrozentrifuge. Überprüfen Sie visuell, ob das Knochenmark aus den Knochen herauszentrifugiert wurde.Die Knochen sollten weiß erscheinen, und ein großes Pellet sollte im größeren Röhrchen sichtbar sein. Entsorgen Sie anschließend die Knochen im 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und suspendieren Sie das Knochenmark in der geeigneten Lösung für die gewünschte nachgeschaltete Analyse. Diese schnelle Dissektionstechnik eignet sich für eine Reihe nachgeschalteter Analysen, einschließlich der Histomorphometrie und der Histologie.Tatsächlich, wie durch diese repräsentative histomorphometrische Mikro-CT-3D-Rekonstruktion gezeigt wird, bleiben sowohl der trabekuläre Knochen als auch die kortikale Schale erhalten, wodurch eine genaue Quantifizierung der standardisierten strukturellen Parameter für die Knochenhistomorphometrie ermöglicht wird. In diesem repräsentativen histologischen Schnitt eines H-und-E-gefärbten, formalinfixierten und entkalkten Tibias kann die Erhaltung der Integrität sowohl des verkalkten Knochens als auch des zellulären Knochenmarks für die histologische Analyse beobachtet werden. Darüber hinaus ist das mittels dieses Verfahrens isolierte Knochenmark für zahlreiche nachgeschaltete Anwendungen geeignet, einschließlich der Primärzellkultur von Osteoklasten oder Osteoblasten.Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie in etwa sieben Minuten von der Dissektion des langen Knochens bis zur Isolierung des Knochenmarks abgeschlossen werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Während des Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Maus so zu positionieren, dass die Dissektion erleichtert wird. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie FACS oder andere Einzelzellverfahren angewendet werden, um zusätzliche Fragen bezüglich Veränderungen in den Zellpopulationen des Knochenmarks zu beantworten.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die langen Knochen von Mäusen schnell dissezieren und das Knochenmark durch Zentrifugation isolieren kann.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Isolierung von frischem ganzem Knochenmark aus den Hintergliedmaßen der Maus, um ganze BM-Defekte bei Patienten mit Blutkrankheiten wie Leukämie zu untersuchen.

Knochenmarkentnahme aus der Hintergliedmaße der Maus

In diesem Video demonstrieren wir die Isolierung und Kultivierung von Knochenmark-Stromazellen aus den langen Knochen von Mäusen. Die isolierten adhärenten BMSCs können für die weitere Analyse verwendet werden.

Isolierung und Kultivierung von Knochenmark-Stromazellen aus einem Schienbein der Maus

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur seriellen Probenahme von Femurknochenmark (BM), ohne dass Mäuse getötet werden müssen. Dieses Verfahren ermöglicht Längsschnittstudien der BM-Zusammensetzung von Mäusen im Zeitverlauf und ermöglicht den seriellen Zugang zu Zellen innerhalb des BM für ex vivo- und Transplantationsstudien.

Oberschenkelknochenmark-Aspiration im Live-Mäuse

Osteoklasten sind die Haupt knochenresorbierenden Zellen im Körper. Eine Fähigkeit, die Osteoklasten in großer Zahl zu isolieren hat erhebliche Fortschritte im Verständnis der Osteoklasten Biologie geführt. In diesem Protokoll beschreiben wir ein Verfahren zur Isolierung, Kultivierung und Quantifizierung der Osteoklastenaktivität in vitro.

Osteoklasten Ableitung aus Knochenmark der Maus

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das große Mengen an murinen Monozyten aus heterogenem Knochenmark für translationale Anwendungen erzeugt. Im Vergleich zu anderen trägt diese neue Methode dazu bei, die Anzahl der getöteten Tiere zu reduzieren und die Kosten zu senken, indem teure Methoden wie die magnetische Zelltrennung mit hohem Gradienten (MACS) vermieden werden.

Isolierung und intravenöse Injektion von Maus-Knochenmark stammenden Monozyten

In diesem Artikel präsentieren wir Methoden zum isolieren und Stromazellen Knochenmarkzellen und Blutstammzellen von Röhrenknochen Maus unterscheiden. Zwei verschiedene Protokolle sind nachgiebig unterschiedliche Zellpopulationen geeignet für Erweiterung und Differenzierung in Adipozyten, Osteoblasten und Osteoklasten vorgestellt.

Isolation, Kultur und Differenzierung von Stromazellen Knochenmarkzellen und Osteoklasten-Vorläufer von Mäusen

Hier bieten wir eine Methode zum Identifizieren und isolieren große Zahlen von GM-CSF myeloische Zellen unter Verwendung von high-Speed Zellsortierung angetrieben. Fünf verschiedene Populationen (gemeinsame myeloischen Vorläuferzellen, Vorläuferzellen der Granulozyten/Makrophagen, Monozyten, Monocyte abgeleitet Makrophagen und Monocyte abgeleitet DCs) können identifiziert werden, basierend auf Ly6C und CD115 Ausdruck.

Erzeugung einer großen Zahl von myeloischen Vorläuferzellen und dendritischen Zellen Vorstufen aus murinen Knochenmark mit einer neuartigen Zelle Sortieren Strategie

Dieses Protokoll enthält Dissektion der murinen langen Knochen und Knochenmark isoliert, Knochenmark Makrophagen zu generieren und produzieren Osteoklasten mit Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (M-CSF) und Rezeptor Aktivator des nuklearen Faktor Kappa B Ligand (RANKL) oder Tumor-Nekrose-Faktor Alpha (TNF-α) und ihre Verhaftung durch Anti-c-Fms Antikörper, M-CSF Rezeptor.

Wirkung von Anti-c-Fms-Antikörper auf Osteoklasten Bildung und Verbreitung von Osteoklasten-Vorläufer In-vitro-

Diese Methode beschreibt die durch Durchflusszytometrie gereinigte Reinigung von MEP und MKp von Mäuse femuren, Tibias und Beckenknochen.

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