Murine Hind Gliedmaßen langen Knochen Dissection und Knochenmark-Isolation

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens zur Dissektion und Isolierung des Knochenmarks besteht darin, die langen Knochen schnell und systematisch zu entfernen und das Knochenmark für die weitere nachgelagerte Analyse zu gewinnen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Zusammenhang mit der Knochenmarkbiologie, der Krebsmetastasierung und der Immunologie zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass der Dissektionsprozess schnell und standardisiert ist, das Verfahren zur Isolierung des Knochenmarks ziemlich steril ist. Beginnen Sie damit, die Maus in Rückenlage zu positionieren.

Stecke dann alle vier Pfotenballen unterhalb des Sprunggelenks fest und besprühe die Maus mit 70%igem Ethanol, wobei du die Beine gründlich übergießt. Machen Sie als Nächstes einen kleinen Schnitt rechts von der Mittellinie im Unterbauch direkt über der Hüfte und verlängern Sie den Schnitt über das Bein und über das Sprunggelenk hinaus. Ziehen Sie die Haut zurück.

Schneiden Sie dann den Quadrizepsmuskel ab, der am proximalen Ende des Oberschenkelknochens verankert ist, um die vordere Seite des Oberschenkelknochens freizulegen, und stecken Sie den Muskel mit dem Stift in einem 45-Grad-Winkel vom Brett aus dem Bein heraus. Schneiden Sie mit der Schere gegen die hintere Seite des Oberschenkelknochens die Kniesehnen vom Kniegelenk weg. Ziehen Sie dann die Haut- und Kniesehnenmuskulatur zurück, die am proximalen Ende des Oberschenkelknochens verankert ist, um die hintere Seite des Knochens freizulegen, und stecken Sie die Oberschenkelmuskulatur aus dem Bein heraus, wobei Sie den Stift in einem 45-Grad-Winkel platzieren.

Fassen Sie mit der Pinzette das distale Ende des Oberschenkelknochens knapp über dem Kniegelenk. Führen Sie dann die Scherenklingen auf beiden Seiten des Oberschenkelschafts in Richtung Hüftgelenk. Nachdem Sie den Hüftkopf erreicht haben, drehen Sie die Schere und bewegen Sie die obere Klinge direkt über den Hüftkopf, um den Oberschenkelknochen auszurenken.

Fassen Sie nun mit der Pinzette die Oberseite des Oberschenkelschafts und schneiden Sie das Weichgewebe vom Hüftkopf ab, um den Oberschenkelknochen aus der Hüftpfanne zu lösen. Ziehen Sie dann den gesamten Beinknochen, einschließlich des Oberschenkelknochens, des Knies und des Schienbeins, nach oben und vom Körper weg und schneiden Sie vorsichtig das Bindegewebe und den Muskel ab, mit denen das Bein an der Haut befestigt ist. Wenn das gesamte Bindegewebe entfernt wurde, überdehnen Sie das Sprunggelenk und drehen Sie die Schere, wie gerade gezeigt, um das Schienbein zu verrenken.

Fassen Sie das distale Ende der Tibia und achten Sie darauf, die Sehnen nicht zu durchtrennen, und ziehen Sie die Tibia nach oben und vom Körper und der Pinnwand weg. Entfernen Sie dann das restliche Bindegewebe, das am langen Knochen am Knie befestigt ist, sowie alle zusätzlichen Muskeln oder Bindegewebs, die am Oberschenkelknochen und am Schienbein befestigt sind. Um den Röhrenknochen für die Knochenmarkisolierung vorzubereiten, fassen Sie den Oberschenkelknochen mit der Patella nach unten und dem Hüftkopf nach unten.

Überdehnen Sie das Kniegelenk und drehen Sie die Schere, um das Schienbein vom Oberschenkelknochen zu verrenken. Entfernen Sie dann das Bindegewebe, das den Oberschenkelknochen und das Schienbein zusammenhält. Fassen Sie dann den Oberschenkelknochen mit der vorderen Seite nach weg und dem Hüftkopf nach unten und führen Sie die Schere den Oberschenkelschaft hinauf zu den Kondylen.

Drehen Sie die Schere vorsichtig hin und her, um die Kondylen, die Patella und die Epiphyse zu entfernen und die Metaphyse freizulegen. Verwenden Sie dann die Pinzette, die Schere und die Kimwipes, um zusätzliche Muskeln oder Bindegewebe zu entfernen, die am Oberschenkelknochen haften. Fassen Sie als Nächstes das Schienbein mit der vorderen Seite weg und dem Knöchelende nach unten.

Wenn die Tibiaepiphyse intakt ist, führen Sie die Schere den Tibiaschaft hinauf zu den Kondylen und drehen Sie die Schere vorsichtig hin und her, um die Kondylen und die Epiphyse zu entfernen und die Tibiametaphyse freizulegen. Entfernen Sie dann alle zusätzlichen Muskeln oder Bindegewebe, die an der Tibia befestigt sind, wie gerade gezeigt. Um das Knochenmark zu entnehmen, schieben Sie zunächst eine 18-Gauge-Nadel durch den Boden eines 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchens.

Legen Sie dann die langen Knochen mit dem Knieende nach unten in die Röhre und schließen Sie den Deckel. Verschachteln Sie das 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie die Röhrchen 15 Sekunden lang bei mindestens 10.000 g in einer Mikrozentrifuge. Vergewissern Sie sich, dass das Knochenmark durch Sichtprüfung aus den Knochen herausgeschleudert wurde.

Die Knochen sollten weiß erscheinen, und in der größeren Röhre sollte ein großes Kügelchen sichtbar sein. Entsorgen Sie dann die Knochen in das 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und suspendieren Sie das Knochenmark in der entsprechenden Lösung für die gewünschte nachgelagerte Analyse. Diese Schnelldissektionstechnik eignet sich für eine Reihe von nachgelagerten Analysen, einschließlich Histomorphometrie und Histologie.

Wie diese repräsentative histomorphometrische Mikro-CT-3D-Rekonstruktion zeigt, bleiben sowohl der spongiöse Knochen als auch die kortikale Hülle erhalten, was eine genaue Quantifizierung der standardisierten strukturellen Parameter für die Knochenhistomorphometrie ermöglicht. In diesem repräsentativen histologischen Schnitt einer H- und E-gefärbten formalen und fixierten und entkalkten Tibia kann die Aufrechterhaltung der Integrität sowohl des verkalkten Knochens als auch des zellulären Knochenmarks für die histologische Analyse beobachtet werden. Darüber hinaus ist das durch dieses Verfahren isolierte Knochenmark für viele nachgeschaltete Anwendungen geeignet, einschließlich der primären Zellkultur von Osteoklasten oder Osteoblasten.

Einmal gemeistert, kann die Technik in etwa sieben Minuten abgeschlossen werden, von der Dissektion langer Knochen bis zur Knochenmarkisolierung, wenn sie richtig durchgeführt wird. Wenn Sie den Eingriff versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Maus zu positionieren, um das Sezieren zu erleichtern. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie FACS oder andere Einzelzellprozesse durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu Veränderungen in den Knochenmarkzellpopulationen zu beantworten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die langen Knochen von Mäusen schnell präpariert und das Knochenmark durch Zentrifugation isoliert