Name: Schnelle und vereinfachte Verfahren für Hochdurchsatz-Isolierung von miRNA aus Highly Purified High Density Lipoprotein (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Erfahren Sie eine schnelle Methode zur Isolierung von HDL aus menschlichem Blutplasma für miRNA-Analysen. Diese Technik ermöglicht Forschern die effiziente Untersuchung molekularer Schutzmechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Diese Arbeit wurde ganz oder teilweise unterstützt durch die NIH Grants R01 AA 020758-04, U01DK 061731-13 und T32 DK 007150-38 an AJS und T32 DK 007150-38 an AA. Dies ist eine Originalarbeit und wird an anderer Stelle nicht für eine Veröffentlichung in Betracht gezogen.

1. Entnahme von Blutproben <ol><li> Sammeln peripheren Fasten Blutproben in einem 10 ml-Plastikröhrchen mit Antikoagulans (EDTA) durch Standard venipuncture einer prominenten Vene in der Ellenbeuge (die mehrere Vorteile gegenüber anderen Antikoagulantien hat). </li><li> Zentrifugieren der Blutproben bei 1.600 xg für 20 min bei 4 ° C in einer Tischzentrifuge Plasma frei von roten Blutkörperchen und geringe Mengen an RNA zu erhalten. </li><li> zentrifugieren sequentielles der Überstand bei 3.000 g (4 ° C) in einem Schwingbecher-Rotor für 10 min zu entfernen WBC &amp; Platelets und dann weitere 15 min jeweils verbleibenden Zelltrümmer zu entfernen. </li><li> Messen der Dichte des Plasmas mit einem Densitometer bei RT unter Verwendung gemäss Herstellungsanweisungen. HINWEIS: Die Einstellung der Dichte (d = 1,023 g / ml) mit 0,9% Kochsalzlösung kann nach der Entfernung von Exosomen erforderlich sein, jedoch vor der Dichtegradient Ultrazentrifugation. </li></ol&gt; 2. exosome Entfernen von Plasma <ol><li> Entfernen Sie die zirkulierenden Exosomen , die eine ähnliche Dichte wie HDL und eine quantitativ signifikante Quelle von miRNA 3 darstellen. <ol><li> Dies geschieht durch Zugabe von 252 &amp; mgr; l exosome Fällungslösung zu 1 ml Plasma, gefolgt von Inkubation für 30 min bei 4 ° C. Um die Exosomen Pellet aus Zentrifugation der Mischung für 30 min bei 1500 g bei 4 ° C. </li><li> Zur Isolierung HDL, je 1 ml des resultierenden Überstand auf eine Polycarbonat-dickwandigen Ultrazentrifugenröhrchen für die weitere Verarbeitung mit Dichte-Ultrazentrifugation (siehe unten). </li></ol></li></ol> 3. Dichte-Ultrazentrifugation (Abbildung 1). <ol><li> Separater HDL verwenden, um ein 3-Stufen-Prozess einen Boden mit einem Ultrafestwinkelrotor, der bei 448.811 x G und 8 ° C, jeweils eingesetzt wird. </li><li> Bereiten Sie drei unterschiedliche Dichte Lösungen nacheinander und frisch für jede Isolation. <ol><li> Bereiten Lösung A (Isolation von VLDL, d = 1,006 g / ml) durch Auflösen von 11,4 g NaCl (NaCl: 0,195 mol), 0,1 g EDTA2Na und 1 ml 1N NaOH in 1000 ml autoklaviertem destilliertem Wasser. Dann fügen Sie eine zusätzliche 3 ml autoklaviert-destilliertes Wasser. </li><li> Vorbereitung der Lösung B (Isolierung von LDL, d = 1,182 g / ml) durch Zugabe von 25,2 g NaBr 100 ml Lösung A (NaCl 0,195 mol, NaBr 2,44 mol). </li><li> Bereiten Lösung C (Isolierung von HDL, d = 1,470 g / ml) durch Mischen von 78,8 g NaBr mit 100 ml Lösung A (NaCl 0,195 mol, NaBr 7,7 mol). Bestätigen Sie die entsprechende Dichte bei RT unter Verwendung eines Densitometers. Halten Sie alle Lösungen bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung. </li></ol></li></ol> 4. Isolierung von VLDL <ol><li> Mischen Sie 1 ml Plasma (durchschnittliche Dichte = 1,023 g / ml) und nukleasefreiem 200 ul Fat Red 7B in einem 6,5 ml Polycarbonat dickwandigen Ultrazentrifugenröhrchen. </li><li> Dann Schicht vorsichtig 5 ml der Lösung A auf die Oberseite des Gemisches. Falls erforderlich, fügen Sie zusätzliche Fat Red 7B auf der Lösung A to das Gewicht jedes Rohr balancieren. Zentrifuge für 2 h (Beschleunigung - 5), (Verzögerung - 7). HINWEIS: Während der Zentrifugation werden die Lipoproteine ​​als Band auf ihre Gleichgewichtsdichte Regionen akkumuliert. </li><li> Am Ende der Lauf beobachten 2 Schichten. Entfernen Sie 1,5 ml der VLDL-Fraktion, die die obere Schicht und lagern bei 4 ° C. </li><li> Schließlich mit einer Pipette Übertragungs 4 ml vom Boden des Röhrchens das LDL enthält, HDL, Albumin und Fettsäure-Fraktion zu einem neuen Polycarbonatrohr für LDL Isolation. </li></ol> 5. Isolierung von LDL <ol><li> Mix 2 ml Lösung B und 100 ul nukleasefreiem Fat Red 7B in das Röhrchen mit dem LDL und HDL-Fraktion (Abschnitt 4) sind. </li><li> Zentrifuge Dann aus 3 h (Beschleunigung 9, Verzögerung 7). Danach entfernen 1,5 ml der LDL-Fraktion die oberste Schicht darstellt und halten bei 4 ° C oder bei -80 ° C. Schließlich übertragen 4 ml vom Boden des Röhrchens das HDL enthaltendeFraktion auf eine neue Polycarbonatrohr. </li></ol> 6. Isolierung von HDL <ol><li> Mix 2 ml Lösung C, 100 &amp; mgr; l Nuklease frei Fat Red 7B und 15 ul 98% β-Mercaptoethanol in das Rohr die HDL-Fraktion enthält, respectively. </li><li> Zentrifuge für 3 h (Beschleunigung 9, Verzögerung 7). Danach 2 ml der HDL-Fraktion zu entfernen die oberste Schicht darstellt und entweder halten bei 4 ° C oder bei -80 ° C. </li></ol> 7. Die Entsalzung und Konzentration von Lipoprotein-Fraktionen <ol><li> Um Interferenzen mit anschließender Agarose-Gelelektrophorese und PCR zu vermeiden, entfernen übermäßige Salz während Dichtegradient Ultrazentrifugation hinzugefügt unter Verwendung von Zentrifugal-Filtervorrichtungen mit dem geeigneten Molekulargewichtsgrenze (3K Rohr für VLDL und 10K Rohr für LDL / HDL), wie durch die Anweisungen des Herstellers beschrieben ist. <ol><li> Kurz gesagt, nach 2,5 ml kaltem PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) Zugabe centrifuge der gesamte VLDL-Fraktion gesammelt während Dichtegradient Ultrazentrifugation bei 4 ° C für 60 min eine Schwingbecherrotor verwendet wird. </li><li> Desalt die LDL-Fraktion zweimal mit 10 ml eiskaltem PBS für jeweils 30 min. Verwenden Weiter wurden 13 ml eiskaltem PBS zweimal für Entsalzen der HDL-Fraktion. Je höher PBS Volumen ist notwendig, die Mobilität mit Agarose-Gelelektrophorese zu verbessern. Nach der Zentrifugation entfernen bei 4 ° C oder bei -80 ° C gelagert, die Lipoprotein enthält, gelöste Stoffe und zu halten. </li></ol></li></ol> 8. Agarose-Gelelektrophorese <ol><li> Perfrom Lipoprotein Agarosegelelektrophorese das Kit mit kleineren Modifikationen von den Anweisungen des Herstellers verwendet wird, wie folgt. HINWEIS: Dieser Schritt ist nur die Qualität und Reinheit der konzentrierten Lipoprotein Proben zu bewerten ist. <ol><li> Kurz gesagt, erhalten 6 ul des entsalzten Lipoprotein-Fraktion mit Ultrazentrifugation Dichte und laden auf einen vorgegossenen Lipoprotein-Gel. Verwenden menschlichen lipoprotein Standards für VLDL, LDL und HDL als Größenreferenz. Führen Sie die Elektrophorese bei RT bei 100 V für 60 min unter Verwendung von Rep Prep-Puffer. </li><li> Trocknen des Gels für 10 min und dann Färbung für 10 min bei RT mit Fat Red 7B. Entfärben des Gels in einem Gemisch aus Methanol-Wasser 75:25 (v / v) und trockenem erneut 5 min. </li></ol></li></ol> 9. RNA Extraktion und Reinigung <ol><li> Perfrom Isolierung von miRNA durch gereinigtes humanes HDL mit dem Serum / Plasma-miRNA Isolierung und Reinigung Kit. <ol><li> Kurz gesagt, 1 ml RNA Lysereagenz bis 200 &amp; mgr; l gereinigtem HDL, mit einem Vortexer mischen und dann für 5 min bei RT inkubiert, um die vollständige Dissoziation der Nucleoprotein-Komplexe und Inaktivierung von RNasen gewährleisten. </li><li> Dann Spike 3,5 ul synthetischer Caenorhabditis elegans microRNA (cel-miR-39, 1,6 x 10 8 Kopien / ul) in die Mischung. Führen Sie dann nach RNA-Extraktion aus den Anweisungen des Herstellers. </li></ol></li><li> Führen Sie purificatiauf der extrahierten-miRNA mit elute Spin-Säulen gemäß den Anweisungen des Herstellers. Messen Sie die Konzentration von miRNA aus gereinigtem HDL mit einem spectrophorometer. HINWEIS: Die Elution von miRNA aus den Spin-Säulen verwendet 16 &amp; mgr; l RNase-freiem Wasser. </li></ol> 10. Reverse Transkription (RT-PCR) <ol><li> Isolieren 100 ng des miRNA aus HDL gespikt mit synthetischen miRNA (cel-miR-39) und revers transkribiert in einem 20 ul Reaktionsvolumen der reversen Transkription unter Verwendung von Kits und gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Führen Sie entsprechende Kontrollen ohne Vorlage miRNA (NTC) und ohne reverse Transkriptase-Enzym-Mix (NRT). </li></ol> 11. Real-time PCR (qRT-PCR) <ol><li> Perfrom PCR in Echtzeit in einem Gesamtvolumen von 20 &amp; mgr; l mit 2 &amp; mgr; l einer 1: 2 Verdünnung der cDNA, 10 &amp; mgr; l PCR-Mix, 2 &amp; mgr; l Universal-Primer, 2 &amp; mgr; l miRNA Primern und 4 &amp; mgr; l RNase-freiem Wasser. </li><li> Führen Sie die Reaction in 96-Well-Platten bei 95 ° C für 15 min, von 45 Zyklen von 94 ° C für 15 sec und 55 ° C für 30 s und eine Verlängerungsphase bei 70 ° C für 30 s.ec alle Reaktionen in Triplikaten perfrom . </li><li> Als nächstes calcuate relativen Mengen von miRNA durch die 2 -ΔΔ Ct Methode nach der Normalisierung auf das synthetische Housekeeping - Gen unter Verwendung gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li></ol>

<ol><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+genomics%2C+biogenesis%2C+mechanism%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li>
<li>Arroyo, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Argonaute2+complexes+carry+a+population+of+circulating+microRNAs+independent+of+vesicles+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (12), 5003-5008 (2011).</li>
<li>Vickers, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+are+transported+in+plasma+and+delivered+to+recipient+cells+by+high-density+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins.</a> Nat Cell Biol. 13 (4), 423-433 (2011).</li>
<li>Wagner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+levels+and+cellular+transfer+of+circulating+lipoprotein-bound+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of levels and cellular transfer of circulating lipoprotein-bound microRNAs.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, 1392-1400 (2013).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+185%2C+96%2C+and+223+repress+selective+high-density+lipoprotein+cholesterol+uptake+through+posttranscriptional+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs 185, 96, and 223 repress selective high-density lipoprotein cholesterol uptake through posttranscriptional inhibition.</a> Mol Cell Biol. 33 (10), 1956-1964 (2013).</li>
<li>Rayner, K. J., Moore, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+control+of+high-density+lipoprotein+metabolism+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNA control of high-density lipoprotein metabolism and function.</a> Circ Res. 114 (1), 183-192 (2014).</li>
<li>Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+endosomal-derived+vesicles+shipping+extracellular+messages%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Exosomes: endosomal-derived vesicles shipping extracellular messages.</a> Curr Opin Cell Biol. 16 (4), 415-421 (2004).</li>
<li>Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+plasma+lipoproteins+by+density-gradient+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation.</a> Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).</li>
<li>Foreman, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+human+serum+lipoproteins+by+single-spin+gradient+ultracentrifugation%3A+quantification+of+apolipoproteins+B+and+A-1+and+lipid+components%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Fractionation of human serum lipoproteins by single-spin gradient ultracentrifugation: quantification of apolipoproteins B and A-1 and lipid components.</a> J Lipid Res. 18, 759-767 (1977).</li>
<li>Dong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+LDL-+and+HDL-cholesterol+determined+by+ultracentrifugation+and+HPLC%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Serum LDL- and HDL-cholesterol determined by ultracentrifugation and HPLC.</a> J Lipid Res. 52, 383-388 (2011).</li>
<li>Tong, H., Knapp, H. R., VanRollings, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((low+temperature+flotation+method+to+rapidly+isolate+lipoproteins+from+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">low temperature flotation method to rapidly isolate lipoproteins from plasma.</a> J Lipid Res. 39, 1696-1704 (1998).</li>
<li>Fless, G. M., ZumMallen, M. E., Scanu, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physicochemical+properties+of+apolipoprotein+%28a%29+and+lipoprotein+%28a-%29+derived+from+the+dissociation+of+human+plasma+lipoprotein+%28a%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Physicochemical properties of apolipoprotein (a) and lipoprotein (a-) derived from the dissociation of human plasma lipoprotein (a).</a> J Biol Chem. 261, 8712-8718 (1986).</li>
<li>Brownie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elimination+of+primer-dimer+accumulation+in+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The elimination of primer-dimer accumulation in PCR.</a> Nucleic Acids Res. 25, 3235-3241 (1997).</li>
<li>Alton, E., Inyoul, L., Leroy, H., David, G., Kai, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+microRNA%3A+a+new+source+of+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Extracellular microRNA: a new source of biomarkers.</a> Mutat Res. 717 (1-2), 85-90 (2011).</li>
<li>Stefanie, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+biomarker+profiling+with+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cancer biomarker profiling with microRNAs.</a> Nature Biotechnology. 26, 400-401 (2008).</li>
<li>Prasun, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+as+promising+biomarkers+in+cancer+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarker+Research%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs as promising biomarkers in cancer diagnostics.</a> Biomarker Research. 2 (19), (2014).</li>
<li>Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs%3A+novel+biomarkers+and+extracellular+communicators+in+cardiovascular+disease%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease?</a> Circ Res. 110, 483-495 (2012).</li>
<li>Jonathan, S., Martin, S., Eric, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJonathan%2C+S+%22miRNA+profiling+from+blood+-challenges+and+recommendations%22">miRNA profiling from blood -challenges and recommendations</a>. , 
 <a target="_blank" href="www.qiagen.com">www.qiagen.com</a> (2015).</li>
<li>Francesco, M., Paola, D. C., Anna, T., Jesper, T., Sergio, A., Riccardo, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+circulating+microRNA+expression+data+obtained+by+quantitative+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR.</a> Brief Bioinform. 3, 1-9 (2015).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs%2C+novel+biomarkers+of+acute+myocardial+infarction%3A+a+systemic+review%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Emerg+Med%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs, novel biomarkers of acute myocardial infarction: a systemic review.</a> World J Emerg Med. 3, 257-260 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Identifizierung neuer Biomarker aus Blut werden in der klinischen Diagnose und Prognose von verschiedenen Krankheiten unterstützen. MicroRNAs sind bekannt , alle Qualitäten von Biomarkern zu besitzen und haben in verschiedenen Studien 14-17 gezeigt. In dieser Studie haben wir eine schnelle und einfache einfache Methode zur Isolierung miRNA aus Plasma-HDL demonstriert. Herkömmliche Dichtegradient Ultrazentrifugation Verfahren zur Isolierung von VLDL, LDL und HDL , hängt von genauen Abtastung von Plasma, präzis...

MicroRNAs sind endogene nicht-kodierende winzige RNA-Spezies, die hochkonserviert sind und als Schlüsselakteure bei der Regulation verschiedener biologischer Prozesse gelten, indem sie spezifische Ziel-Boten-RNAs abbauen oder unterdrücken1. Da miRNAs intrazellulär wirken, wurden sie als gewebeabgeleitete Biomarker erforscht, was zur Entdeckung gewebespezifischer Funktionen dieser miRNA führte. miRNAs kommen aber auch extrazellulär vor, entweder in Verbindung mit Proteinen oder in Exosomen/Mikrovesikeln, die sie effektiv vor dem Abbau durch extrazelluläre RNasen schützen können2. Neuere Studien haben gezeigt, dass die schützende Wirkung von HDL möglicherweise nicht eng mit seiner Fähigkeit zusammenhängt, den Cholesterinausfluss zu fördern, sondern vielmehr mit seiner Nicht-Cholesterin-Fracht, insbesondere als zirkulierender miRNAs-Träger 3, 4. Diese miRNAs können nicht nur den Fettstoffwechsel modulieren, sondern sind auch mit entzündungshemmenden, antioxidativen und antithrombotischen Wirkungen des HDL-miRNA-Komplexes verbunden 5, 6.
Um die Rolle von miRNAs, die in HDL-Partikeln transportiert werden, weiter zu erforschen, muss ein einfaches und leichtes Protokoll für die miRNA-Extraktion aus isoliertem, hochgereinigtem HDL für die Verwendung in der klinischen Routine erstellt werden. Zahlreiche Methoden wurden beschrieben, um HDL zu isolieren. Diese Methoden sind entweder sehr zeitaufwändig oder erfordern ein großes Plasmavolumen, das ein Probenpooling, eine umfangreiche Dialyse zur Entsalzung isolierter Lipoproteine erfordern kann, bzw. sie entfernen Exosomen als Quelle für miRNAsnicht vollständig 3. Hier beschreiben wir eine einfache und schnelle Methode, mit der miRNA aus hochgereinigtem HDL unter Verwendung kleiner Mengen an Blutproben in größerem Maßstab isoliert werden kann. Wir glauben, dass diese Methode als gute Referenz dienen kann, um die Erforschung der Rolle zirkulierender miRNAs und insbesondere der Rolle von HDL bei der Erleichterung der Kommunikation zwischen verschiedenen Zellen und Organen zu fördern.

<table><tbody><tr><td>Kunststoff Vacutainer Lavendel K2EDTA Röhren&nbsp;</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>366643</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R&nbsp;</td><td></td><td></td>75004261</tr><tr><td>Densito 30PX Densito Densitometer</td><td>Mettler Toledo</td><td>MT51324450</td><td></td></tr><tr><td>ExoQuick Lösung&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>4484451</td><td></td></tr><tr><td>dickwandiges Ultrazentrifugenröhrchen aus Polycarbonat</td><td>Thermo Scientific</td><td>O3237</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall WX100 Ultrazentrifuge&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>46902</td><td></td></tr><tr><td>Fettrot 7B&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201618</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Zentrifugalfiltergeräte 10K</td><td>Millipore</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Amicon UltraZentrifugalfiltergeräte 3K</td><td>Millipore</td><td>UFC800308</td><td></td></tr><tr><td>QuickGel Lipo Kit&nbsp;</td><td>Helena Laboratorien&nbsp;</td><td>3344,3544T</td><td></td></tr><tr><td>Humane Lipoproteinstandards für VLDL, LDL und HDL</td><td>LipoTrol; Helena Laboratories</td><td>5069</td><td></td></tr><tr><td>Rep Vorbereitungspuffer&nbsp;</td><td>Helena Laboratorien&nbsp;</td><td>3100</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MinElute Spin-Säulen&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 Analysator</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miScript II RT Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Touch Echtzeit-PCR-Nachweissystem</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Serum/Plasma Kit</td><td>QIAGEN</td><td>217184</td><td></td></tr><tr><td>miScript Primer Assays</td><td>QIAGEN</td><td>141078139</td><td></td></tr><tr><td>miScript SYBR Green PCR Kit&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>218073</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Serum/Plasma-Spike-In-Steuerung</td><td>QIAGEN</td><td>219610</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>480878 0,20 &#181; M steriler Spritzenvorsatzfilter</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>Z227536</td><td></td></tr></tbody></table>

schnelle und vereinfachte verfahren für hochdurchsatz-isolierung von mirna aus highly purified high density lipoprotein

Fast and Simplified Method for High Through-put Isolation of miRNA from Highly Purified High Density Lipoprotein

Kleine nicht-kodierende RNAs (miRNAs) wurden mit einer Vielzahl von menschlichen Krankheiten, einschließlich metabolischer Syndrome, in Verbindung gebracht. Sie können als Biomarker für die Diagnose und Prognose verwendet werden bzw. als Ziele für die Arzneimittelentwicklung dienen. Kürzlich wurde gezeigt, dass miRNAs in Lipoproteinen, insbesondere Lipoproteinen hoher Dichte (HDL), transportiert und zur Aufnahme an die Empfängerzellen abgegeben werden. Dies wirft die Möglichkeit auf, dass miRNAs eine entscheidende und entscheidende Rolle bei der Zell- und Organfunktion spielen, indem sie die Genexpression regulieren und Botenstoff für die Zell-Zell-Kommunikation und die Kommunikation zwischen Organen sind. Aktuelle Methoden zur miRNA-Isolierung aus gereinigtem HDL sind unpraktisch, wenn kleine Proben in großem Maßstab verwendet werden. Dies ist vor allem auf die zeitaufwändigen und mühsamen Methoden zurückzuführen, die für die Isolierung von Lipoproteinen verwendet werden. Wir haben einen vereinfachten Ansatz entwickelt, um gereinigtes HDL, das für die miRNA-Analyse geeignet ist, schnell aus Plasmaproben zu isolieren. Diese Methode soll Untersuchungen zur Rolle von miRNAs bei Gesundheit und Krankheit erleichtern und insbesondere neue Erkenntnisse über die Vielfalt der biologischen Funktionen außerhalb des reversen Cholesterintransports liefern, die HDL zugeschrieben werden. Auch die miRNA-Spezies, die in HDL vorhanden sind, können wertvolle Informationen über klinische Biomarker für die Diagnose verschiedener Krankheiten liefern.

Isolierung von High Density Lipoprotein Nach Entfernen von Exosomen MiRNA aus hochgereinigtem HDL zu erhalten , ist es notwendig , Exosomen zu entfernen , die eine Quelle der Verschmutzung miRNA 7 darstellen. Dies wurde vor der Dichtegradient Ultrazentrifugation mit einem im Handel erhältlichen Kits durchgeführt. Für praktische Zwecke ein Drei - Stufen - Standarddichte - Ultrazentrifugation Protokoll , das von kommerziellen Unternehmen ...

MicroRNAs spielen eine wichtige regulatorische Rolle und werden als neue therapeutische Targets für verschiedene menschliche Krankheiten entstehen. Es hat sich gezeigt, dass miRNAs in Lipoproteinen hoher Dichte durchgeführt werden. Wir haben ein vereinfachtes Verfahren entwickelt, um schnell gereinigter HDL für miRNA-Analyse von Humanplasma geeignet isolieren.

Schnelle und vereinfachte Verfahren für Hochdurchsatz-Isolierung von miRNA aus Highly Purified High Density Lipoprotein

Small non-coding RNAs (miRNAs) have been implicated in a variety of human diseases including metabolic syndromes. They may be utilized as biomarkers for ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, einen vereinfachten Ansatz zur schnellen Isolierung gereinigter hochdichter Lipoproteine aus menschlichem Blutplasma für die Analyse von Mikro-RNA zu entwickeln. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Hepatologie und Kardiologie zu beantworten, beispielsweise das Verständnis der molekularen Mechanismen und schützenden Funktionen hochdichter Lipoproteine. Zu den wichtigsten Vorteilen dieser Technik gehört, dass gereinigte HDL-Mikro-RNA innerhalb kurzer Zeit aus geringeren Probenvolumina präisoliert vorliegen. In diesem Protokoll wird Plasma aus nüchternen peripheren venösen Blutproben durch mehrere Zentrifugationsschritte gemäß dem Protokolltext gewonnen. Überführen Sie das Plasma in ein neues Gefäß und messen Sie die Dichte des Plasmas mit einem Dichtemessgerät bei Raumtemperatur gemäß den Anweisungen des Herstellers.Um die zirkulierenden Exosome zu entfernen, die eine Quelle der mikro-RNA-Kontamination darstellen, geben Sie 252 Mikroliter Exosomen-Fällungslösung zu einem Milliliter Plasma hinzu und inkubieren die Probe 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Zentrifugieren Sie anschließend die Mischung 30 Minuten lang, um d

fast-simplified-method-for-high-through-put-isolation-mirna-from

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschreiben wir eine optimierte Multiplex-Reverse-Transkriptase-quantitative PCR (qRT-PCR)-Protokoll in Kombination mit einer mikrofluidischen Plattform als zeit-und kosteneffektiver High-Throughput-Screening-Tool für microRNA (miRNA) Expression, besonders beim Arbeiten mit geringen Mengen der Probe.

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimierte Multiplex qRT-PCR in Nanoliter-Maßstab auf dem Fluidigm Dynamische ArrayTM IFCs

Dieses Video beschreibt die Extraktion von zirkulierender microRNA aus Plasmaproben von Darmkrebspatienten mittels organischer Extraktion, gefolgt von einer Glasfasersäulenanreicherung. miRNAs sind in biologischen Flüssigkeiten wie Serum und Plasma stabil, was sie zu idealen zirkulierenden Biomarkern für die Krebsdiagnose, Prognose und Behandlungsentscheidung und -überwachung macht. Diese Methode wird dazu beitragen, neue zirkulierende Biomarker zu identifizieren, die in der Lage sind,...

Zirkulierende miRNA-Extraktion: Eine Methode zur Isolierung von miRNA aus Plasmaproben durch organische Extraktion und Anreicherung kleiner RNA

Das Vorhandensein von stabilen microRNAs (miRNAs) in exosomes hat immense Interesse als neue Art der interzellulären Kommunikation erzeugt, für ihre potenziellen Nutzen als Biomarker und als Weg für eine therapeutische Intervention. Hier zeigen wir exosome Reinigung von Blut und Kulturmedien durch quantitative PCR gefolgt, um miRNAs transportiert identifizieren.

Reinigung und microRNA Profiling von Exosomen aus Blut und Kultur Medien Abgeleitet

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Extraktion von kleinen RNAs aus menschlichem Serum. Wir haben diese Methode verwendet, um microRNAs von Krebsserum für den Einsatz in DNA-Arrays isolieren und auch Singleplex quantitative PCR. Das Protokoll nutzt Phenol und Guanidiniumthiocyanat Reagenzien mit Modifikationen, um qualitativ hochwertige RNA ergeben.

Isolierung von Kleine-kodierenden RNAs von Human Serum

MicroRNAs (miRNAs) sind eine weit verbreitete Klasse von regulatorischen Molekülen. Hier beschreiben wir eine miRNA-Klonierungsmethode, die auf zwei potenten Ligationsschritten beruht, gefolgt von einer Hochdurchsatz-Sequenzierung. Unsere Methode ermöglicht eine genaue genomweite Quantifizierung von miRNAs.

Hoch effiziente Ligation kleine RNA-Moleküle für MicroRNA Quantifizierung von Hochdurchsatz-Sequenzierung

Gallenflüssigkeit ist eine wertvolle Quelle für extrazelluläre Vesikel/Exosomen, die potenziell wichtige Biomarker enthalten. Dieses Protokoll stellt eine robuste Methode zur Isolierung von Exosomen aus menschlicher Galle für weitere Analysen, einschließlich miRNA-Profiling, dar.

Isolation und Profilierung von microRNA-haltigen Exosomen von Human Bile

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und Quantifizierung von kleinen RNAs mit hohem Dichtheits-Lipoprotein.

Isolierung von Lipoproteinen hoher Dichte für Non-coding Small RNA Quantification

Dieses Protokoll stellt eine neuartige Methode der Lipid Droplet Isolation und Reinigung von Maus Lebern, mit einem etablierten endoplasmatische Retikulum Isolierung-Kit.

Rasche Lipid Droplet Isolation Protokoll verwendet eine gut etablierte Organell-Isolierungskit

Hier wird ein quantitatives Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktionsprotokoll zur Bestimmung des nativen Mikro-RNA-Gehalts (absolute/relativ) von Lipoprotein-Partikeln vorgestellt. Darüber hinaus wird eine Methode zur Erhöhung des Mikro-RNA-Niveaus sowie eine Methode zur Bestimmung der zellulären Aufnahmevorrate von Lipoprotein-Partikeln demonstriert.

Anreicherung von Ureinium Lipoprotein-Partikeln mit Mikro-RNA und anschließender Bestimmung ihrer Absolute/Relative MicroRNA-Inhalte und ihrer Celluläre Transferquote

Hier beschreiben wir eine schrittweise Strategie zur Isolierung kleiner RNAs, zur Anreicherung von microRNAs und zur Vorbereitung von Proben für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz. Anschließend wird beschrieben, wie Sequenzlesevorgänge verarbeitet und mithilfe von Open-Source-Tools an microRNAs ausgerichtet werden.

Eine vollständige Pipeline zum Isolieren und Sequenzieren von MicroRNAs und deren Analyse mithilfe von Open Source Tools

Mehrere Methoden wurden zur Analyse von Plasma-Lipoproteinen verwendet; Ultrazentrifugation ist jedoch nach wie vor eine der beliebtesten und zuverlässigsten Methoden. Hier beschreiben wir eine Methode, wie Lipoproteine aus Plasma mit sequenzieller Dichte-Ultrazentrifugation isoliert werden und wie die Apolipoproteine sowohl für diagnostische als auch für Forschungszwecke analysiert werden können.

Isolierung und Analyse von Plasmalipoproteinen durch Ultrazentrifugation

Erfahren Sie eine schnelle Methode zur Isolierung von HDL aus menschlichem Blutplasma für miRNA-Analysen. Diese Technik ermöglicht Forschern die effiziente Untersuchung molekularer Schutzmechanismen.

Schnelle und vereinfachte Verfahren für Hochdurchsatz-Isolierung von miRNA aus Highly Purified High Density Lipoprotein

Weitere Videos entdecken