Schnelle und vereinfachte Verfahren für Hochdurchsatz-Isolierung von miRNA aus Highly Purified High Density Lipoprotein

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, einen vereinfachten Ansatz zur schnellen Isolierung von gereinigten Lipoproteinen hoher Dichte aus menschlichem Blutplasma für die Mikro-RNA-Analyse zu entwickeln. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in der Hepatologie und Kardiologie zu beantworten, wie z. B. das Verständnis der molekularen Mechanismen und Schutzfunktionen von Lipoproteinen hoher Dichte. Zu den Hauptvorteilen dieser Technik gehört, dass gereinigte HDL-Mikro-RNA innerhalb kurzer Zeit aus weniger Probenvolumen vorisoliert werden kann.

In diesem Protokoll wird Plasma aus nüchternen peripheren venösen Blutproben durch mehrere Zentrifugationsschritte gewonnen, wie im Protokolltext beschrieben. Übertragen Sie das Plasma in ein neues Röhrchen. Und messen Sie die Dichte des Plasmas mit einem Densitometer bei Raumtemperatur gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Um die zirkulierenden Exosomen zu entfernen, die eine Quelle für eine Mikro-RNA-Kontamination darstellen, fügen Sie 252 Mikroliter Exosom-Fällungslösung zu einem Milliliter Plasma hinzu. Und 30 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren. Zentrifugieren Sie dann die Mischung 30 Minuten lang, um die Exosomen herauszupelletieren.

Übertragen Sie einen Milliliter des resultierenden Überstands zur weiteren Verarbeitung in ein dickwandiges Ultrazentrifugenröhrchen aus Polycarbonat, wie im nächsten Videosegment gezeigt. Die Isolierung von Lipoproteinen hoher Dichte (HDL) wird durch ein dreistufiges Dichtegradienten-Ultrazentrifugationsprotokoll erreicht, das eine sequentielle Isolierung von Lipoproteinen mit sehr niedriger Dichte (VLDL), Lipoproteinen niedriger Dichte (LDL) und HDL umfasst. Die drei Lösungen mit unterschiedlicher Dichte, A, B und C, müssen frisch zubereitet werden, wobei das im Protokolltext beschriebene Verfahren zu befolgen ist.

Mischen Sie in einem 6,5 Milliliter dickwandigen Ultrazentrifugenröhrchen aus Polycarbonat einen Milliliter Plasma und 200 Mikroliter nukleasefreies Fat Red 7B. Schichten Sie dann vorsichtig fünf Milliliter Lösung A auf die Mischung. Fügen Sie bei Bedarf zusätzliches Fat Red 7B auf Lösung A hinzu, um das Gewicht jedes Röhrchens auszugleichen.

Laden Sie die Rohre in einen vorgekühlten Rotor. Setzen Sie den Rotor in eine Bodenzentrifuge ein und zentrifugieren Sie ihn zwei Stunden lang. Am Ende des Laufs sollten zwei Schichten sichtbar sein.

Entfernen Sie 1,5 Milliliter der obersten Schicht, die der VLDL-Fraktion entspricht. Und lagern Sie es bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie mit einer Pipette vier Milliliter vom Boden des Röhrchens in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen.

Diese enthält die LDL- und HDL-Fraktion. Der nächste Schritt ist die Isolierung von LDL. Mischen Sie zwei Milliliter Lösung B und 100 Mikroliter nukleasefreies Fettrot 7B in das Röhrchen mit der LDL- und HDL-Fraktion.

Fünf bis zehn Minuten auf Eis legen. Übertragen Sie 6,5 Milliliter der gemischten Probe in ein dickwandiges Ultrazentrifugenröhrchen aus Polycarbonat. Laden Sie das Röhrchen in einen vorgekühlten Rotor und zentrifugieren Sie es drei Stunden lang.

Wenn die Zentrifugation abgeschlossen ist, entfernen Sie 1,5 Milliliter der obersten Schicht, die die LDL-Fraktion darstellt, und halten Sie sie bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie vier Milliliter vom Boden des Röhrchens, das die HDL-Fraktion enthält, in ein steriles 50-Milliliter-Röhrchen. Der dritte Schritt ist die Isolierung von HDL.

Mischen Sie zwei Milliliter Lösung C, 100 Mikroliter nukleasefreies Fettrot 7B und 15 Mikroliter 98%iges Beta-Mercaptoethanol in das Röhrchen, das die HDL-Fraktion enthält. Überprüfen Sie die Dichte der Mischung. Laden Sie das Röhrchen in einen vorgekühlten Rotor und zentrifugieren Sie es drei Stunden lang.

Entfernen Sie danach zwei Milliliter der obersten Schicht, die die HDL-Fraktion darstellt, und halten Sie sie bei vier Grad Celsius. Überschüssiges Salz muss aus den Lipoproteinfraktionen entfernt werden, um Interferenzen mit der nachfolgenden Agarosegelelektrophorese und PCR zu vermeiden. In diesem Video wird die Entsalzung und Konzentration nur für die HDL-Fraktion demonstriert.

13 Milliliter kaltes PBS zur HDL-Fraktion geben und in eine Zentrifugalfiltervorrichtung mit einem Molekulargewichts-Cutoff von 10 K überführen. In einem schwingenden Schaufelrotor bei 4000 mal g und vier Grad Celsius 30 Minuten lang zentrifugieren. Die HDL-Fraktion wird ein zweites Mal mit 13 Millilitern kaltem PBS entsalzt und wie zuvor zentrifugiert.

Entfernen Sie nach der Zentrifugation das Lipoprotein, das gelöste Stoffe enthält, und halten Sie es bei vier Grad Celsius. Um die Qualität und Reinheit der isolierten Lipoproteine zu beurteilen, wurde eine Agarose-Gelelektrophorese mit humanen Lipoproteinstandards durchgeführt, die als Größenreferenz einbezogen wurden. Repräsentative Ergebnisse aus einer Isolierung ohne Beta-Mercaptoethanol zeigten, dass die HDL-Fraktion frei von jeglicher Kontamination mit VLDL ist und eine typische Alpha-Mobilität aufweist.

Allerdings zeigt auch die HDL-Fraktion aufgrund der Kontamination mit Lipoproteinen Spuren von Beta-Mobilität. Durch die Zugabe von Beta-Mercaptoethanol zu Lösung C während des letzten Zentrifugationsschritts werden alle kontaminierenden Lipoproteine effektiv aus der HDL-Fraktion entfernt. Um die Machbarkeit der Quantifizierung von microRNAs zu demonstrieren, die in humanem HDL transportiert und mit dieser Methode gereinigt wurden, wurden zwei verschiedene microRNAs durch quantitative Echtzeit-PCR amplifiziert.

In diesen Amplifikationsdiagrammen stellen die horizontalen Linien die Nachweisschwelle dar. Repräsentative real-time PCR-Daten von isoliertem HDL, die aus sechs Proben gewonnen wurden, zeigten den konsistenten Nachweis beider microRNAs. Schließlich zeigen die Analysen der Schmelzkurve deutlich einen deutlichen Einzelpeak für beide microRNAs, was mit der spezifischen Amplifikation in der vorangegangenen PCR übereinstimmt.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in neun Stunden durchgeführt werden, zusammen mit den Entsalzungsverfahren, wenn sie richtig durchgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, immer bei vier bis acht Grad Celsius zu arbeiten. Und um die Dichte jeder Lipoproteinfraktion vor der Ultrazentrifugation einzustellen.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. die Elektronenmikroskopie, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Reinheit von HDL. Nach ihrer Entwicklung wird diese Technik es Forschern auf dem Gebiet des metabolischen Syndroms ermöglichen, HDL-assoziierte Mikro-RNAs als Biomarker bei Menschen mit Verdacht auf Fettlebererkrankung zu erforschen. Es kann auch verwendet werden, um die Funktion von HDL und die molekularen Mechanismen, durch die es die Zellbiologie verändert, besser zu verstehen.