Schnelle und vereinfachte Verfahren für Hochdurchsatz-Isolierung von miRNA aus Highly Purified High Density Lipoprotein

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, einen vereinfachten Ansatz zur schnellen Isolierung gereinigter hochdichter Lipoproteine aus menschlichem Blutplasma für die Analyse von Mikro-RNA zu entwickeln. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Hepatologie und Kardiologie zu beantworten, beispielsweise das Verständnis der molekularen Mechanismen und schützenden Funktionen hochdichter Lipoproteine. Zu den wichtigsten Vorteilen dieser Technik gehört, dass gereinigte HDL-Mikro-RNA innerhalb kurzer Zeit aus geringeren Probenvolumina präisoliert vorliegen.

In diesem Protokoll wird Plasma aus nüchternen peripheren venösen Blutproben durch mehrere Zentrifugationsschritte gemäß dem Protokolltext gewonnen. Überführen Sie das Plasma in ein neues Gefäß und messen Sie die Dichte des Plasmas mit einem Dichtemessgerät bei Raumtemperatur gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Um die zirkulierenden Exosome zu entfernen, die eine Quelle der mikro-RNA-Kontamination darstellen, geben Sie 252 Mikroliter Exosomen-Fällungslösung zu einem Milliliter Plasma hinzu und inkubieren die Probe 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Zentrifugieren Sie anschließend die Mischung 30 Minuten lang, um die Exosome als Pellet abzutrennen.

Überführen Sie ein Milliliter des resultierenden Überstandes in ein Polycarbonat-Ultrazentrifugenröhrchen mit dicker Wandung zur weiteren Verarbeitung, wie im nächsten Videosegment gezeigt. Die Isolierung von hochdichten Lipoproteinen, oder HDL, erfolgt mittels eines dreistufigen Dichtegradienten-Ultrazentrifugationsverfahrens, das die sequenzielle Isolierung von sehr niedrigdichten Lipoproteinen, oder VLDL, niedrigdichten Lipoproteinen, oder LDL, und HDL umfasst. Die drei unterschiedlichen Dichtelösungen A, B und C müssen frisch hergestellt werden, gemäß dem im Protokolltext beschriebenen Verfahren.

In einem 6,5-Milliliter-Polycarbonat-Ultrazentrifugenröhrchen mit dicken Wänden mischen Sie ein Milliliter Plasma mit 200 Mikrolitern nukleasefreiem Fat Red 7B. Schichten Sie anschließend vorsichtig fünf Milliliter Lösung A auf die Mischung. Falls erforderlich, geben Sie zusätzliches Fat Red 7B auf die Lösung A, um das Gewicht der einzelnen Röhrchen auszugleichen.

Die Röhrchen in einen vorab gekühlten Rotor geben. Den Rotor in eine Standzentrifuge einsetzen und zwei Stunden lang zentrifugieren. Am Ende des Laufs sollten zwei Schichten sichtbar sein.

Entfernen Sie 1,5 Milliliter der oberen Schicht, die die VLDL-Fraktion darstellt, und lagern Sie diese bei vier Grad Celsius. Überführen Sie mithilfe einer Pipette vier Milliliter vom Boden des Reaktionsgefäßes in ein neues 50-Milliliter-Gefäß.

Darin enthalten sind die LDL- und HDL-Fraktion. Der nächste Schritt ist die Isolierung von LDL. Geben Sie zwei Milliliter Lösung B und 100 Mikroliter nukleasefreies Fat Red 7B in das Röhrchen, das die LDL- und HDL-Fraktion enthält.

Legen Sie die Probe für fünf bis zehn Minuten auf Eis. Überführen Sie 6,5 Milliliter der gemischten Probe in ein dickwandiges Polycarbonat-Ultrazentrifugenröhrchen. Platzieren Sie das Röhrchen in einem vorab gekühlten Rotor und zentrifugieren Sie drei Stunden lang.

Wenn die Zentrifugation abgeschlossen ist, entfernen Sie 1,5 Milliliter der oberen Schicht, die die LDL-Fraktion darstellt, und lagern Sie diese bei vier Grad Celsius. Überführen Sie vier Milliliter vom Boden des Röhrchens, die die HDL-Fraktion enthalten, in ein steriles 50-Milliliter-Röhrchen. Der dritte Schritt ist die Isolierung von HDL.

Mischen Sie zwei Milliliter der Lösung C, 100 Mikroliter nukleasefreies Fat Red 7B und 15 Mikroliter 98 % Beta-Mercaptoethanol in das Röhrchen, das die HDL-Fraktion enthält. Überprüfen Sie die Dichte des Gemischs. Geben Sie das Röhrchen in einen vorab gekühlten Rotor und zentrifugieren Sie drei Stunden lang.

Anschließend zwei Milliliter der oberen Schicht, die die HDL-Fraktion darstellt, abnehmen und bei vier Grad Celsius aufbewahren. Überschüssiges Salz muss aus den Lipoprotein-Fraktionen entfernt werden, um Störungen bei der nachfolgenden Agarose-Gelelektrophorese und PCR zu vermeiden. In diesem Video werden Entsalzung und Konzentrierung ausschließlich für die HDL-Fraktion demonstriert.

Geben Sie 13 Milliliter kaltes PBS zur HDL-Fraktion hinzu und überführen Sie diese in ein Zentrifugalfiltergerät mit einer Molekulargewichts-Cutoff-Grenze von 10K. Zentrifugieren Sie im Schwenkkorbrotor bei 4000 × g und vier Grad Celsius für 30 Minuten. Desalzieren Sie die HDL-Fraktion ein zweites Mal unter Verwendung von 13 Millilitern kaltem PBS und Zentrifugation wie zuvor.

Nach der Zentrifugation werden die lipoproteinhaltigen Lösungen entfernt und bei vier Grad Celsius aufbewahrt. Um Qualität und Reinheit der isolierten Lipoproteine zu beurteilen, wurde eine Agarose-Gelelektrophorese mit menschlichen Lipoprotein-Standards durchgeführt, die als Größenreferenz mitaufgetragen wurden. Repräsentative Ergebnisse einer Isolation ohne Beta-Mercaptoethanol zeigten, dass der HDL-Fraktion jegliche Kontamination mit VLDL fehlt und eine typische Alpha-Mobilität aufweist.

Jedoch weist die HDL-Fraktion aufgrund einer Kontamination mit Lipoproteinen auch Spuren einer Beta-Mobilität auf. Durch die Zugabe von Beta-Mercaptoethanol zur Lösung C während des letzten Zentrifugationsschritts werden alle kontaminierenden Lipoproteine effektiv aus der HDL-Fraktion entfernt. Um die Durchführbarkeit der Quantifizierung von in menschlichem HDL enthaltenen Mikro-RNAs nachzuweisen, die mit dieser Methode gereinigt wurden, wurden zwei verschiedene Mikro-RNAs mittels Echtzeit-quantitativer PCR amplifiziert.

In diesen Verstärkungsdiagrammen stellen die horizontalen Linien die Nachweisgrenze dar. Repräsentative Echtzeit-PCR-Daten von isoliertem HDL, gewonnen aus sechs Proben, zeigten einen konsistenten Nachweis beider Mikro-RNAs. Schließlich zeigen die Schmelzkurvenanalysen deutlich einen jeweils einzelnen, ausgeprägten Peak für beide Mikro-RNAs, was mit einer spezifischen Amplifikation in der vorangegangenen PCR übereinstimmt.

Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie inklusive der Entsalzungsverfahren in neun Stunden durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es stets wichtig, bei vier bis acht Grad Celsius zu arbeiten und die Dichte jeder Lipoproteinfraktion vor der Ultrazentrifugation einzustellen.

Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie die Elektronenmikroskopie angewendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise bezüglich der Reinheit von HDL. Nach ihrer Entwicklung ermöglicht diese Technik es Forschern im Bereich des metabolischen Syndroms, HDL-assoziierte mikro-RNAs als Biomarker bei Menschen mit Verdacht auf Fettlebererkrankung zu untersuchen. Sie könnte außerdem genutzt werden, um die Funktion von HDL und die molekularen Mechanismen, durch die es die Zellbiologie verändert, besser zu verstehen.