Isolierung und Analyse von Zellen des Pankreas Mesenchyme durch Durchflusszytometrie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mesenchymale Zellen der Bauchspeicheldrüse für ihre Gen- und Oberflächenmarker-Expressionsanalyse zu isolieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Pankreasentwicklung zu beantworten, z. B. welche Signale von mesenchymalen Zellen exprimiert werden und wie sie die Epithelentwicklung beeinflussen. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie relativ einfach und schnell ist und dass sie eine gute Ausbeute an sortierten Zellen ermöglicht.

Beginnen Sie damit, die inneren Organe in eine Kulturschale zu legen, die HBSS enthält, und legen Sie die Schale unter ein Stereomikroskop. Löse die Leber und die Nieren, um die Bauchspeicheldrüse freizulegen, und entferne die Bauchspeicheldrüse mit einer feinen Pinzette aus dem Magen, dem Zwölffingerdarm und der Milz. Wenn jede Bauchspeicheldrüse entnommen ist, geben Sie das Gewebe in ein konisches Röhrchen mit frisch zubereitetem Verdauungspuffer und legen Sie das Röhrchen auf Eis.

Wenn alle Pankreaten entnommen wurden, geben Sie das Gewebe für 30 Minuten unter Rühren bei 700 U/min in einen 37 Grad Celsius heißen Block und drehen Sie die Röhren nach 15 Minuten drei- bis viermal manuell um. Wenn nach der ersten Hälfte der Verdauung noch große Pankreasstücke vorhanden sind, drehen Sie den Schlauch in den letzten 15 Minuten alle fünf Minuten um und inkubieren Sie das Gewebe bei Bedarf weitere fünf bis 10 Minuten. Am Ende des Aufschlusses legen Sie die Röhrchen auf Eis und fügen Sie jeder Probe 10 Milliliter kaltes HBSS hinzu.

Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie die Pellets in zwei Millilitern frischem PBS. Als nächstes filtrieren Sie die Zellen durch 35-Mikron-Siebe in fünf Milliliter-Sammelröhrchen aus Polystyrol mit rundem Boden und waschen Sie die Aufschlussröhrchen mit zwei Millilitern frischem PBS, indem Sie die Waschungen in die entsprechenden Sammelröhrchen abseihen. Zentrifugieren Sie dann die Zellen erneut und saugen Sie die Überstände vorsichtig an, ohne die Pellets zu stören.

Resuspendieren Sie die Zellen in Sortierpuffer entsprechend dem Alter der Tiere und filtrieren Sie sie durch neue 35-Mikron-Zellsiebe in neue Fünf-Milliliter-Sammelröhrchen. Aliquotieren Sie 50 bis 100 Mikroliter Zellvolumina in neue FACS-Röhrchen für die Färbekontrollen, einschließlich eines Röhrchens für jedes Fluorophor, des Viabilitätsfarbstoffs, der fluoreszierenden Proteine und einer ungefärbten Kontrolle. Waschen Sie jedes Röhrchen mit bis zu vier Millilitern Sortierpuffer und zentrifugieren Sie dann.

Anschließend werden die Pellets je nach Alter der Tiere in frischem Sortierpuffer resuspendiert. Färben Sie dann die Zellen mit dem Viabilitätsfarbstoff. Für die Zellsortierung vor der RNA-Extraktion, unmittelbar vor Beginn der Sortierung, wird ein steriles 1,5-Milliliter-Sammelröhrchen mit einem Milliliter Sortierpuffer beschichtet, der den RNASE-Inhibitor enthält.

Nach fünf Minuten das Auffangröhrchen durchwirbeln und die Flüssigkeit entfernen. Drehen Sie die erste Färbesteuerung vor und laden Sie das Rohr in das Durchflusszytometer, um mit der Bestimmung der Sortierparameter zu beginnen. Wenn alle Sortierparameter eingestellt sind, laden Sie die Proben und sortieren Sie die Zellen in 1,5-Milliliter-Sammelröhrchen.

Anschließend werden die sortierten Zellen durch Zentrifugation gesammelt. Aspirieren Sie den Überstand bis zum Pellet und extrahieren Sie die RNA gemäß den Standard-RNA-Extraktionsprotokollen. Hier ist der isolierte gesamte Magen-Darm-Trakt einschließlich Magen, Milz, Darm und Bauchspeicheldrüse eines embryonalen Embryos am Tag 15,5 und eines postnatalen Welpen am vierten Tag dargestellt.

Die durchflusszytometrische Analyse von Einzelzellen aus embryonalen, neonatalen und adulten Pankreasgeweben, die wie gerade gezeigt wurden, zeigt, dass transgenes Pankreasgewebe aller analysierten Altersgruppen unterschiedliche YFP-markierte Zellpopulationen enthält. Nach der Sortierung können diese mesenchymalen Zellen kultiviert werden, um eine Zelllinie für mindestens fünf Passagen zu etablieren. Man beachte die fibrotische Morphologie der kultivierten Zellen, die für mesenchymale Zellen typisch ist.

Die sortierten Zellen exprimieren den panmesenchymalen Marker Vementin, der durch qPCR nach RNA-Extraktion und cDNA-Synthese analysiert wurde. Darüber hinaus deutet die isolierte Expression von Pankreaszelloberflächenmarkern darauf hin, dass alle fluoreszenzmarkierten Zellen in der transgenen YFP-Bauchspeicheldrüse CD9 exprimieren, ein Zelloberflächenglykoprotein, das Berichten zufolge von Fibroblasten exprimiert wird. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die RNA-Sequenzierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Genexpression mesenchymaler Zellen zu beantworten.