Protokolle für die Visualisierung Steroidogenic Organe und deren Interactive Organe mit Immunostaining in der Fruchtfliege Drosophila melanogaster

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die steroidogenen Organe und ihre interaktiven Organe in Larven oder erwachsenen Weibchen der Fruchtfliege (Drosophila melanogaster) sichtbar zu machen. Diese Methode kann helfen, die Biosynthese von Steroidhormonen von Insekten und den neuronalen Regulationsmechanismus, der der Paarung und Metamorphose zugrunde liegt, zu verstehen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Innervation der steroidogenen Organe und der relative Anteil ihrer interaktiven Organe intakt bleibt.

Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da die steroidogenen Organe in Fliegenlarven ziemlich klein und transparent sind. Mein Labor und ich freuen uns, unsere Präparierprotokolle mit Ihnen zu teilen. Also lasst uns loslegen.

Nachdem Sie die Larven vorbereitet haben, beginnen Sie die Verlaufsdissektion in einer drei Zentimeter großen, mit PBS gefüllten Schale unter einem Präpariermikroskop. Fassen Sie zuerst den Mundhaken mit einer Pinzette. Trennen Sie dann den Körper mit einer Mikroschere auf etwa einem Drittel der Länge von der vorderen Spitze ab.

Halten Sie dann die vordere Länge mit einer Pinzette fest und drücken Sie mit einem zweiten Paar die Spitze des Kopfes sanft in den Körper, um den Larvenkörper schließlich auf links zu drehen. Bereiten Sie auf diese Weise innerhalb von 10 Minuten bis zu 20 Larven vor und geben Sie sie dann in eine Fixierlösung. Waschen Sie die Präparate nach 30 Minuten und fahren Sie mit der Immunfärbung fort.

Lassen Sie die Larven zu Beginn etwa eine Stunde lang in Wasser eintauchen, um die Larven zu ersticken und so bewegungsunfähig zu machen. Legen Sie dann eine Larve mit der Rückenseite nach oben in einen Tropfen PBS auf eine mit Silikon beschichtete Schale. Auf der dorsalen Seite befinden sich die beiden Trachealtuben.

Führen Sie unter einem Präpariermikroskop mit einer Pinzette eine Insektennadel in die vordere Spitze ein. Strecken Sie dann den Körper zur hinteren Seite und stecken Sie einen zweiten Stift in die hintere Spitze. Machen Sie als Nächstes mit einer Mikroschere einen kleinen Schnitt in der Nähe des Schwanzes.

Schneiden Sie nach dem Schnitt die dorsale Kutikula vorsichtig in Längsrichtung entlang der dorsalen Mittellinie in Richtung Kopf, ohne das Gewebe unter der Kutikula zu beschädigen. Nachdem du den Schnitt gemacht hast, dehnst du die Körperwände auseinander und befestigst sie mit Insektennadeln an den Ecken. Entfernen Sie dann mit einer Pinzette den vorderen Fettkörper und die Speicheldrüsen, wodurch der Hirnring-Drüsen-Komplex auf der Oberfläche freigelegt wird.

Aspirieren Sie nun das PBS und tauchen Sie das Präparat in Fixierlösung. Entfernen Sie nach 30 Minuten die Insektenstifte mit einer Pinzette und geben Sie das Präparat in ein Mikroröhrchen, das mit 0,3 % PBT gefüllt ist. Fahren Sie dann mit der Immunfärbung fort.

Nachdem Sie die Larven immungefärbt haben, verwenden Sie eine Einwegpipette, um die Proben in eine mit 0,3 % PBT gefüllte Schale zu überführen. Fassen Sie unter einem Präpariermikroskop die Nagelhaut oder den Mundhaken mit einer Pinzette. Verwenden Sie dann eine 27-Gauge-Nadel, die wie ein Messer an einer Ein-Milliliter-Spritze befestigt ist, um den Augenscheibenkomplex der Hirnringdrüse aus der Körperkutikula zu entfernen, indem Sie die vordere Spitze der Speiseröhre und die Augenscheiben abschneiden.

Trennen Sie anschließend mit einer Pinzette vorsichtig die Speiseröhre und den Darm vom Gehirnring-Drüsen-Augenscheiben-Komplex. Ziehen Sie den Darm zur hinteren Seite heraus, da die Speiseröhre oberhalb des ventralen Nervenstrangs durch das Gehirn verläuft. Um schließlich den Hirnring-Drüsen-Komplex zu isolieren, schneiden Sie vorsichtig mit einem Nadelmesser die Verbindungen zwischen der Hirnscheibe, den Augenscheiben und den Beinscheiben durch.

Es ist sehr wichtig, während der Dissektion eine feine Pinzette mit scharfen Kanten zu verwenden. Ich würde dringend empfehlen, die Pinzette mit einem Stück Schleifstein zu schärfen, um die Kanten lückenlos zusammenzuführen. Um die Proben zu übertragen, verwenden Sie eine Mikropipette mit einer Spitze mit breiter Bohrung.

Legen Sie die Proben in der Mitte des Objektträgers ab. Positionieren Sie die Proben dann mit einer Pinzette auf ihren ventralen Seiten, so dass die Ringdrüse, die sich auf der dorsalen Seite des Gehirns befindet, abgebildet werden kann. Kippen Sie anschließend den Schieber und wischen Sie so viel überschüssiges PBT wie möglich ab.

Geben Sie dann einen Tropfen Einbettreagenz in die Nähe der Proben und lassen Sie mit einer Pinzette langsam einen Deckglas über das Reagenz und dann über die Proben absenken. Um den adulten weiblichen Eierstock zu sezieren, betäuben Sie die Fliegen mit Kohlendioxidgas. Schneide ihnen dann die Köpfe ab und lege ihre Körper in eine drei Zentimeter große Schale, die mit PBS gefüllt ist.

Fassen Sie dann unter einem Präpariermikroskop die dorsale Seite des Brustkorbs mit einer Pinzette und fassen Sie mit einer zweiten Pinzette das Bauchsegment A-5 oder A-6 an. Dann schälen Sie die Bauchkutikula zur hinteren Seite hin ab. Bevor Sie fortfahren, reinigen Sie die klebrige Nagelhaut von der Pinzette.

Als nächstes kneifen Sie einen Eiergang ein und isolieren den Eierstock. Dann kämmen Sie die Spitzen des Eierstocks aus und spreizen Sie sie mit einer Pinzette. Tauchen Sie den Eierstock nach dem Verteilen 30 Minuten lang in Fixierlösung, um ihn für die Färbung vorzubereiten.

Um ein Präparat herzustellen, das die Innervation des Eierstocks aufrechterhält, übertragen Sie anästhesierte weibliche Fliegen in eine mit Silikon beschichtete Schale, die mit PBS gefüllt ist. Halten Sie unter dem Präpariermikroskop den Rüssel und schälen Sie die Nagelhaut des Kopfes ab, um das Gehirn freizulegen. Entfernen Sie aus dem Gehirn die anhaftende Luftröhre, so dass das Gehirn mit dem ventralen Nervenstrang verbunden bleibt.

Halten Sie dann den Brustkorb an der dorsalen Seite fest und entfernen Sie die Beine und Flügel. Als nächstes schälen Sie die ventrale Kutikula des Brustkorbs ab, beginnend an der Basis jedes Beins. Sobald das VNC freigelegt ist, entfernen Sie sehr vorsichtig die verbleibende dorsale Kutikula und die Muskeln, die an dem VNC befestigt sind, mit einer Pinzette.

Beschädigen Sie nicht die Verbindungen zwischen dem Gehirn und dem VNC. Als nächstes schälen Sie mit einer Pinzette die Bauchkutikula ab, um die Eierstöcke und ihre interaktiven Organe freizulegen, zu denen die Stütze, der Darm, der Eiergang, die Gebärmutter und die akzessorische Drüse gehören. Entfernen Sie abschließend alle Gewebereste, einschließlich der Luftröhre und des Fettkörpers.

Tauchen Sie die Proben dann 30 Minuten lang in Fixierlösung, um sie für die Immunfärbung vorzubereiten. Nach der Immunfärbung werden die Proben mit einer Mikropipette auf einen Objektträger mit 0,1 % PBT überführt. Betrachten Sie dann den Objektträger mit einem Mikroskop und trennen Sie die Fäden der Eierstöcke mit einer Pinzette voneinander.

Verletzen Sie dabei nicht die Spitzen der Eierstöcke. Sie enthalten die Germaria. Wenn Sie das Gehirn auf den Fortpflanzungsorgankomplex vorbereiten, entfernen Sie alle verbleibenden Nagelhauten und verteilen Sie die Strukturen auf dem Objektträger.

Wischen Sie anschließend den größten Teil des überschüssigen PBT ab und tragen Sie dann einen Tropfen Einbettreagenz auf die Probe auf. Legen Sie anschließend langsam mit einer Pinzette ein Deckglas auf den Objektträger und lagern Sie den Objektträger bei vier Grad Celsius im Dunkeln. Betrachten Sie später die Proben unter dem Mikroskop und bringen Sie die steroidogenen Organe ins Blickfeld.

Sobald die Ansicht fixiert ist, schalten Sie das Bildgebungssystem in den Bildaufnahmemodus. Während der Larvenstadien wurde die Prothorakaldrüse mit Antikörpern gegen ekdysteroidogene Enzyme markiert, einschließlich des Anti-Tuch-Antikörpers. Um die neuronale Verbindung zwischen der Prothorakaldrüse und dem Gehirn sichtbar zu machen, wurde der Hirnringdrüsen-Komplex präpariert.

Die Filet-Dissektionsmethode zeigt das stomatogastrische Nervensystem, bei dem eine Gruppe von serotonergen Neuronen auf die Prothorakaldrüse, den Proventriculus und die Rachenmuskulatur projiziert wird. Bei erwachsenen Frauen beeinflusst das ovarielle Ecdysteroid viele Aspekte der Ovogenese, wie z. B. die GSC-Proliferation. Die GSCs befinden sich im Germarium an der Spitze jeder Eierstöcke im Eierstock.

Innerhalb des Germariums wurden die GSCs spezifisch mit zwei Antikörpern, 1B1 und DE-Cadherin, markiert. Um die Innervation des Eierstocks sichtbar zu machen, wurde der Eierstock zusammen mit dem Gehirn, dem VNC, dem Darm, dem Propeller, der Gebärmutter und der Spermathek präpariert. Die Neuronen wurden mittels mCD8:GFP unter der Kontrolle des n-Synaptobrevin GAL4-Treibers visualisiert.

Zusätzlich wurde die Muskelstruktur mit dikonjugiertem Phalloidin gefärbt. Obwohl sich das Sezieren der steroidogenen Organe zunächst schwierig anfühlen kann, verwenden Sie diesen Film, um den Schnittpunkt des Gewebes zu erlernen, um das Organ leichter und ohne Verletzungen isolieren zu können. Wir hoffen, dass unser Protokoll nicht nur für Anfänger, sondern auch für erfahrene Forscher informativ ist.

Sobald Sie dieses Verfahren beherrschen, können Sie es auf Ihre Forschung anwenden und es an Ihre Bedürfnisse anpassen. Wir hoffen, dass dieses Protokoll zum umfassenden Verständnis der Steroidhormonbiosynthese beitragen wird. Detailliertere Schritt-für-Schritt-Protokolle sind im Manuskript verfügbar.

Bitte schauen Sie es sich an.