G2-Seq: Ein hoher Durchsatz Sequenzierung-basierten Methode zur Identifizierung von spät repliziert Regionen des Genoms

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens zur Tiefensequenzierung von DNA aus Zellen, die nach Zellzyklusphasen flusssortiert wurden, besteht darin, Regionen des Genoms zu identifizieren, die sich extrem spät im Zellzyklus replizieren. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der DNA-Replikation zu beantworten, z. B. welche Regionen des Genoms Schwierigkeiten haben, die DNA-Replikation abzuschließen und daher besonders anfällig für Genomumlagerungen sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie, obwohl sie vom experimentellen Standpunkt aus sehr einfach ist, einen überraschend umfassenden Einblick in die Dynamik der genomischen Replikation bietet.

Beimpfen Sie zunächst 15 Milliliter Reagenzgläser mit acht Millilitern YEPD mit Hefezellen von Interesse. Synthetisches oder reichhaltiges Medium ist akzeptabel. Kultivieren Sie die Zellen über Nacht für mindestens 12 Stunden, um sie während ihrer tatsächlichen logarithmischen Phasenverteilung zu sammeln.

Am nächsten Tag, wenn die Kulturen eine Dichte von fünf bis 15 Millionen Zellen pro Milliliter haben, schleudern Sie die Zellen herunter und resuspendieren Sie sie in 1,5 Millilitern 70%igem Ethanol. Dann geben Sie die Suspension in ein 1,6-Milliliter-Mikrofugenröhrchen und lassen die Zellen eine Stunde lang oder mindestens drei Stunden auf Eis bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inokulation schleudern Sie die Zellen herunter und resuspendieren sie in einem Milliliter Natriumcitrat.

Zum Schluss beschallen Sie die Zellen zweimal kurz. Wiederholen Sie dann den Zentrifugationszyklus und resuspendieren Sie die Hefe in einem Milliliter Natriumcitrat, das RNase enthält. Lassen Sie die RNase eine Stunde lang oder über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Wärmeblock oder einem Wasserbad bei 50 Grad Celsius mit der Hefe reagieren.

Nach der RNase-Behandlung fügen Sie der Mischung 50 Mikroliter Proteinase-K-Lösung hinzu und setzen Sie die Reaktion eine Stunde lang bei 50 Grad Celsius fort. Schleudern Sie dann die Zellen herunter und resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter Natriumcitrat. Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellen und saugen den Überstand mit einem Vakuum an.

Dann bei schwachem Licht die Zellen in einem Milliliter Natriumcitrat mit grüner Nukleinsäurefärbung resuspendieren. Nun in der Hefe im Dunkeln eine Stunde bei Zimmertemperatur inkubieren. Um fortzufahren, zählen Sie die Zellen mit einem Zellsortierer unter Verwendung von 530-Nanometer-Emissionsdaten.

Sortieren Sie sie nach ihrem DNA-Gehalt in ihre Zellzyklusphasen, G1 S, frühes G2 und spätes G2. Sammeln Sie mindestens 1,6 Millionen haploide Zellen aus jeder Phase. Unmittelbar nach dem Sortieren der Zellen schleudern Sie sie 20 Minuten lang herunter. Saugen Sie den Überstand an und frieren Sie das Pellet zur Lagerung bei minus 20 Grad Celsius ein.

Wir haben festgestellt, dass der wichtigste Schritt für dieses Verfahren darin besteht, die Zellen sofort nach der Entnahme zu schleudern, längstens eine Stunde nach dem Sortieren. Diese Extraktion basiert auf einem genomischen DNA-Extraktionskit für Hefe. Beginnen Sie mit der Zugabe von 120 Mikrolitern Verdauungspuffer und fünf Mikrolitern Hefelytischem Enzym.

Anschließend mischen Sie die Zellen mit einem Wirbel in das Reaktionsgemisch und inkubieren das Gemisch bei 37 Grad Celsius für 40 bis 60 Minuten. Fügen Sie anschließend 120 Mikroliter Lysepuffer hinzu und wirbeln Sie die Mischung 10 bis 20 Sekunden lang bei hoher Geschwindigkeit ein. Fügen Sie dann 250 Mikroliter Chloroform hinzu und mischen Sie den Röhrcheninhalt eine Minute lang gründlich.

Drehen Sie dann das Rohr zwei Minuten lang mit maximaler Geschwindigkeit nach unten. Übertragen Sie dann den Überstand auf die DNA-bindende Säule. Den Überstand wird mit einem einminütigen Zentrifugationszyklus mit maximaler Geschwindigkeit durch die Säule geschleudert.

Um die DNA auf der Säulenmembran zu waschen, übertragen Sie die Säule in ein neues Entnahmeröhrchen und tragen Sie 300 Mikroliter DNA-Waschpuffer auf. Wiederholen Sie dann die Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit für eine Minute. Wiederholen Sie diesen Waschschritt noch einmal.

Um die DNA zu sammeln, übertragen Sie die Spin-Säule in ein frisches Röhrchen. Fügen Sie 60 Mikroliter Wasser hinzu und warten Sie ein bis drei Minuten. Zentrifugieren Sie dann die Säule 10 Sekunden lang bei maximaler Geschwindigkeit, um das Wasser mit der eluierten DNA zu isolieren.

Geben Sie nun zwischen fünf und 195 Mikroliter doppelsträngigen DNA-Puffer mit hochempfindlichem Reagenz in einer Konzentration von eins bis 200 hinzu. Messen Sie dann die Fluoreszenz der Probe, um die Ausbeute zu berechnen. Rechnen Sie damit, zwischen 10 und 50 Nanogramm DNA zu sammeln.

Verwende nun die Beschallung, um die DNA in Fragmente aufzubrechen, die zwischen 250 und 350 Basenpaare groß sind. Verwenden Sie dann ein Standardkit, um eine DNA-Bibliothek vorzubereiten und sie mit mindestens 10 Millionen Single-End-Lesevorgängen mit 50 Basenpaaren zu sequenzieren. Das beschriebene Verfahren wurde verwendet, um spät replizierende Stellen in knospenden Hefen zu identifizieren.

Normale Zellen wurden mit solchen verglichen, denen Sir2, ein Deacetylase-Protein, fehlte. Die Rohdaten enthielten große Spitzen, die hauptsächlich auf das Vorhandensein von TY-Elementen zurückzuführen waren. Diese Spitzen wurden entfernt, indem die Lesetiefen für jede Probe auf das 2,5-fache der mittleren roten Tiefe begrenzt wurden.

Die de-spiked Daten wurden dann mit einem 20 kb Schiebefenster geglättet. Schließlich wurden die Daten normalisiert und als Verhältnisse zu den Niveaus in G1 dargestellt. Eine vollständig nicht replizierte Zelle würde bei 0,5 erscheinen und eine vollständig replizierte Zelle würde bei eins erscheinen. In diesen Daten von Chromosom sieben gab es Hinweise auf eine bekannte spät replizierende Region in der Sir2-Mutante.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Regionen des Genoms identifizieren können, die als letzte die DNA-Replikation abschließen und daher besonders anfällig für DNA-Brüche und andere Probleme sind, die mit einer späten Replikation verbunden sind.