G2-Seq: Ein hoher Durchsatz Sequenzierung-basierten Methode zur Identifizierung von spät repliziert Regionen des Genoms

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens zur Tiefensequenzierung von DNA aus Zellen, die entsprechend der Zellzyklusphase per Flusszytometrie sortiert wurden, besteht darin, Genomregionen zu identifizieren, die äußerst spät im Zellzyklus repliziert werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der DNA-Replikation zu beantworten, beispielsweise, welche Genomabschnitte Schwierigkeiten haben, die DNA-Replikation abzuschließen und daher besonders anfällig für genomische Umstrukturierungen sind. Der wesentliche Vorteil dieser Technik liegt darin, dass sie, obwohl sie experimentell sehr einfach ist, einen überraschend detaillierten Einblick in die Dynamik der genomischen Replikation ermöglicht.

Beginnen Sie damit, 15-Milliliter-Reagenzgläser, die acht Milliliter YEPD enthalten, mit den gewünschten Hefe-Zellen zu beimpfen. Sowohl synthetisches als auch reichhaltiges Medium ist geeignet. Kultivieren Sie die Zellen über Nacht für mindestens 12 Stunden, um sie während ihrer eigentlichen logarithmischen Wachstumsphase zu gewinnen.

Am folgenden Tag, wenn die Kulturen eine Dichte von fünf bis 15 Millionen Zellen pro Milliliter aufweisen, die Zellen abzentrifugieren und in 1,5 Milliliter 70%igem Ethanol resuspendieren. Anschließend die Suspension in ein 1,6-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen und die Zellen eine Stunde bei Raumtemperatur oder mindestens drei Stunden auf Eis inkubieren lassen. Nach der Inokulation die Zellen erneut abzentrifugieren und in einem Milliliter Natriumcitrat resuspendieren.

Schließlich die Zellen zweimal kurz ultraschallen. Anschließend den Zentrifugierzyklus wiederholen und die Hefe in einem Milliliter Natriumcitrat, das RNase enthält, resuspendieren. Die RNase eine Stunde lang bei 50 Grad Celsius oder über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Wärmeblock oder einem Wasserbad mit der Hefe reagieren lassen.

Nach der RNase-Behandlung 50 Mikroliter Proteinase-K-Lösung zur Mischung hinzufügen und die Reaktion eine Stunde lang bei 50 Grad Celsius fortsetzen. Anschließend die Zellen abzentrifugieren und in einem Milliliter Natriumcitrat resuspendieren. Danach die Zellen erneut zentrifugieren und den Überstand mit Vakuum abpipettieren.

Dann die Zellen im abgedunkelten Licht in einem Milliliter Natriumcitrat mit grünem Nukleinsäurefarbstoff resuspendieren. Anschließend die Hefe eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Zum Fortfahren die Zellen mit einem Zellsortierer unter Verwendung von Emissionsdaten bei 530 Nanometer zählen.

Sortieren Sie sie entsprechend ihres DNA-Gehalts in ihre Zellzyklusphasen, G1, S, frühes G2 und spätes G2. Sammeln Sie mindestens 1,6 Millionen haploide Zellen aus jeder Phase. Unmittelbar nach dem Sortieren der Zellen zentrifugieren Sie diese 20 Minuten lang. Aspirieren Sie den Überstand und frieren Sie das Pellet zur Lagerung bei minus 20 Grad Celsius ein.

Wir haben festgestellt, dass der einzige entscheidende Schritt für dieses Verfahren darin besteht, die Zellen unmittelbar nach der Sammlung, spätestens jedoch eine Stunde nach dem Sortieren, rasch abzuzentrifugieren. Diese Extraktion basiert auf einem Kit zur Extraktion genomischer DNA aus Hefe. Beginnen Sie damit, 120 Mikroliter Digestionspuffer und fünf Mikroliter lytisches Hefe-Enzym hinzuzufügen.

Anschließend die Zellen durch Vortexen in das Reaktionsgemisch einmischen und das Gemisch 40 bis 60 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Danach 120 Mikroliter Lysepuffer hinzufügen und das Gemisch 10 bis 20 Sekunden bei hoher Geschwindigkeit vortexen. Anschließend 250 Mikroliter Chloroform hinzufügen und den Inhalt des Reaktionsrohrs eine Minute lang gründlich mischen.

Als Nächstes zentrifugieren Sie das Gefäß zwei Minuten lang mit maximaler Geschwindigkeit. Überführen Sie dann den Überstand auf die DNA-Bindungssäule. Zentrifugieren Sie den Überstand mit einer Zentrifugationsphase von einer Minute bei maximaler Geschwindigkeit durch die Säule.

Um die DNA auf der Säulenmembran zu waschen, überführen Sie die Säule in ein neues Sammelröhrchen und geben Sie 300 Mikroliter DNA-Waschpuffer hinzu. Anschließend erneutes Zentrifugieren bei maximaler Geschwindigkeit für eine Minute. Wiederholen Sie diesen Waschschritt noch einmal.

Um die DNA zu sammeln, überführen Sie die Säule in ein frisches Gefäß. Geben Sie 60 Mikroliter Wasser hinzu und warten Sie eine bis drei Minuten. Zentrifugieren Sie anschließend die Säule für 10 Sekunden mit maximaler Geschwindigkeit, um das Wasser mit der eluierten DNA zu isolieren.

Fügen Sie nun 5 bis 195 Mikroliter Puffer für doppelsträngige DNA mit hoher Empfindlichkeit hinzu, der das Reagenz in einer Konzentration von 1 zu 200 enthält. Anschließend messen Sie die Fluoreszenz der Probe, um die Ausbeute zu berechnen. Mit einer DNA-Menge zwischen 10 und 50 Nanogramm ist zu rechnen.

Verwenden Sie nun die Sonifikation, um die DNA in Fragmente zwischen 250 und 350 Basenpaaren zu zerlegen. Anschließend verwenden Sie ein Standard-Kit, um eine DNA-Bibliothek herzustellen, und sequenzieren diese mit mindestens 10 Millionen 50 Basenpaaren langen Einzelstrang-Lesungen. Das beschriebene Verfahren wurde verwendet, um spät replizierende Stellen in Bäckerhefe zu identifizieren.

Normale Zellen wurden mit Zellen verglichen, die Sir2, ein Deacetylasen-Protein, fehlte. Die Rohdaten enthielten große Spitzen, die hauptsächlich auf das Vorhandensein von TY-Elementen zurückzuführen waren. Diese Spitzen wurden entfernt, indem die Read-Tiefen auf das 2,5-fache der medianen Read-Tiefe pro Probe begrenzt wurden.

Die entstörten Daten wurden anschließend mit einem 20-kb-Gleitfenster geglättet. Schließlich wurden die Daten normalisiert und als Verhältnisse zu den Werten in G1 dargestellt. Eine vollständig nicht replizierte Zelle würde bei 0,5 liegen, eine vollständig replizierte Zelle bei eins. In diesen Daten von Chromosom sieben war ein Hinweis auf eine bekannte spät replizierende Region im Sir2-Mutanten zu erkennen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man jene Genomregionen identifiziert, die als letzte die DNA-Replikation abschließen und die deshalb besonders anfällig für DNA-Brüche und andere Probleme sind, die mit einer späten Replikation assoziiert sind.