Name: G2-Seq: Ein hoher Durchsatz Sequenzierung-basierten Methode zur Identifizierung von spät repliziert Regionen des Genoms (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Lernen Sie G2-Seq zur Identifizierung spät replizierender Genomregionen mittels Durchflusszytometrie und Hochdurchsatzsequenzierung. Diese Methode liefert Einblicke in die Dynamik der DNA-Replikation.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschuss NIH GM117446 an A.B

1. Vorbereitung der Zellen für Flow Cytometry sortieren
<ol><li>15 mL Reagenzgläsern, 8 mL YEPD Brühe enthält, so dass die Kulturen eine Dichte von 5 x 106 bis 1,5 x 107 Zellen pro mL nach Übernachtung Wachstum erreichen zu impfen (siehe Diskussion Hinweis 1).</li>
	<li>Spin-down Hefezellen (1.400 x g, bei Raumtemperatur oder 4 ° C) in eine Schraubkappe Zentrifugenröhrchen 15 mL für 5 min, Zellen in 1,5 mL 70 % igem Ethanol und Transfer nach einem 1,6 mL Microfuge Rohr, lassen diese Sit für 1 h bei Raumtemperatur oder mindestens 3 h auf Eis (Aufschwemmen können gespeichert werden auf unbestimmte Zeit bei 4 ° C) (siehe Diskussionspunkt (2)).</li>
	<li>Spin-down Hefezellen in die Microfuge (14.000 x g, 4 ° C) für 1 min in 1 mL 50 mM Natriumcitrat, pH 7,2, Spin-down (14.000 x g, 4 ° C) für 1 min aufzuwirbeln, Aspirieren überstand, Aufschwemmen in 1 mL 50 mM Natriumcitrat, pH 7,2 , mit 0,25 mg/mL RNAse-Lösung für 1 h bei 50 ° C oder über Nacht bei 37 ° C in Hitze Block oder Wasserbad.</li>
	<li>Fügen Sie 50 µL Proteinase K-Lösung (20 mg/mL Nukleinsäuretablette in 10 mM Tris pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50 % Gewicht, Volumen Glycerin) und 1 h bei 50 ° c inkubieren</li>
	<li>Spin-down Zellen (14.000 x g, 4 ° C), Aufschwemmen Zellen in 1 mL 50 mM Natriumcitrat, pH 7,2, spin-down (14.000 x g, 4 ° C), überstand mit Vakuum anzusaugen, Aufschwemmen in 1 mL 1 µM grün Nukleinsäure-Stamm Nukleinsäuretablette in 50 mM Natriumcitrat , pH 7,2 und in der Dunkelheit für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren, beschallen 2 X für 2 s (Ausgangsleistung 2 Watt).</li>
</ol>(2) Zellsortierung
<ol><li>Mit einer Zelle Sorter, sortieren Zellen nach DNA-Gehalt in Phasen G1, S, "frühen G2" und "späten G2", sammeln von mindestens 1,6 Millionen haploiden Zellen von jedem Zellzyklus-Phase wie in Abbildung 1 (siehe Diskussionspunkt (3)).</li>
	<li>Zellen auf Microfuge Röhren übertragen und spin-down Zellen für 20 min bei 14.000 x g bei 4 ° C in der Microfuge und aspirieren überstand mit Vakuum (das Pellet kann bei-20 ° C eingefroren auf unbestimmte Zeit gespeichert werden, siehe Diskussion Punkt (4)).</li>
</ol>3. DNA-Extraktion und die Vorbereitung der Sequenzierung Bibliotheken
Hinweis: Die folgenden Schritte basieren auf "Protokoll I" in der Hefe Genomic DNA Extraktion Kit (siehe Tabelle der Materialien).
<ol><li>Fügen Sie 120 µL "Verdauung Puffer," eine proprietäre Puffer, der Hefe lytische Enzyme verdauen die Zellwand und 5 µL Hefe lytische Enzym, Aufschwemmen durch aufschütteln und Inkubation bei 37 ° C für 40-60 min ermöglicht.</li>
	<li>Fügen Sie 120 µL "Lysis Buffer," eine proprietäre Puffer, Waschmittel und hart für 10-20 s Wirbel enthält.</li>
	<li>Fügen Sie 250 µL Chloroform - mischen für 1 min.</li>
	<li>Mit Höchstgeschwindigkeit in einem Microfuge für 2 min drehen.</li>
	<li>Laden Sie den Überstand auf der DNA-Bindung Spalte und Zentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit in eine Microfuge für 1 min.</li>
	<li>Fügen Sie 300 µL "DNA waschen Puffer", ein proprietäres Puffer, Ethanol und Zentrifuge für 1 min bei maximaler Geschwindigkeit in eine Microfuge enthält. Verwerfen der Durchströmung, 300 µL Waschpuffer DNA hinzufügen und wiederholen Sie den Waschvorgang zu.</li>
	<li>Die Spin-Spalte auf ein frisches Microfuge Rohr übertragen, fügen 60 µL Wasser (nicht TE) - 1-3 min warten und dann Zentrifugieren für 10 s, um die DNA zu eluieren.</li>
	<li>Konzentration durch Zugabe von 5 µL DNA zu 195 µL DsDNA-hohe Empfindlichkeit-Reagenz, das verdünnt 1: 200 in DsDNA-hohe Empfindlichkeit-Puffer und dann Fluoreszenz-Maßnahme in einem Fluorometer, mit 10 µL der mitgelieferten Standards für die Kalibrierung wurde zu messen; zwischen 10 und 50 ng der DNA Gesamtausbeute erwarten.</li>
	<li>Beschallen (Peak Vorfall macht 450, Einschaltdauer 30 % Zyklen pro Burst 200, Behandlung Zeit 60 s, Wasserstand 6) DNA in 250-350 bp Fragmente aufzubrechen.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Bibliothek mit DNA-Probe Vorbereitungssatz und es (mindestens 10 Millionen 50 bp Einend-gelesen) auf die DNA-Sequenzierung Instrument im Schnellmodus-Sequenz (vgl. Diskussion (5)).</li>
</ol>4. Analyse der Daten und Erstellung von Replikation Sequenzierung Profile
<ol><li>Ausrichten von Saccharomyces Cerevisiae sacCer3 Genom mit Gsnap12 -Sequenzen (siehe Diskussionspapier (6)).</li>
	<li>Bestimmen Sie, dass pro Basenpaar tiefen mit Bedtools "GenomeCoverageBed" Software13lesen.</li>
	<li>Artifizielle Spikes in Lesen Sie tiefen zu entfernen, falls vorhanden (siehe Diskussionspapier (7)).</li>
	<li>Glatten Tiefen von Chromosom mit Mittelstreifen in eine 20 kb Schiebefenster mit "RunMean" Funktion in R Paket "CaTools" gelesen (siehe Diskussionspapier (8)).</li>
	<li>Plot gelesen tiefen in S Phase Anfang G2 und späten G2 als prozentualer Anteil vollständig replizierten lesen Sie tiefen (siehe Diskussionspapier (9)).</li>
</ol>

<ol><li>Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+origin+activation+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA replication origin activation in space and time.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 360-374 (2015).</li>
<li>Santocanale, C., Diffley, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mec1-+and+Rad53-dependent+checkpoint+controls+late-firing+origins+of+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Mec1- and Rad53-dependent checkpoint controls late-firing origins of DNA replication.</a> Nature. 395, 615-618 (1998).</li>
<li>Brewer, B. J., Fangman, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+replication+fork+barrier+at+the+3%27+end+of+yeast+ribosomal+RNA+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A replication fork barrier at the 3' end of yeast ribosomal RNA genes.</a> Cell. 55, 637-643 (1988).</li>
<li>Raghuraman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+dynamics+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication dynamics of the yeast genome.</a> Science. 294, 115-121 (2001).</li>
<li>Muller, C. A., Nieduszynski, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+replication+timing+reveals+global+and+local+regulation+of+replication+origin+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Conservation of replication timing reveals global and local regulation of replication origin activity.</a> Genome Res. 22, 1953-1962 (2012).</li>
<li>Koren, A., Soifer, I., Barkai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRC1-dependent+scaling+of+the+budding+yeast+DNA+replication+timing+program%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">MRC1-dependent scaling of the budding yeast DNA replication timing program.</a> Genome Res. 20, 781-790 (2010).</li>
<li>Lang, G. I., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+rates+across+budding+yeast+chromosome+VI+are+correlated+with+replication+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Mutation rates across budding yeast chromosome VI are correlated with replication timing.</a> Genome Biol Evol. 3, 799-811 (2011).</li>
<li>Durkin, S. G., Glover, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+fragile+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromosome fragile sites.</a> Annu Rev Genet. 41, 169-192 (2007).</li>
<li>Dillon, L. W., Burrow, A. A., Wang, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+instability+at+chromosomal+fragile+sites+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genomics%22%5BJournal%5D)">DNA instability at chromosomal fragile sites in cancer.</a> Curr Genomics. 11, 326-337 (2010).</li>
<li>Widrow, R. J., Hansen, R. S., Kawame, H., Gartler, S. M., Laird, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Very+late+DNA+replication+in+the+human+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Very late DNA replication in the human cell cycle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 11246-11250 (1998).</li>
<li>Foss, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIR2+suppresses+replication+gaps+and+genome+instability+by+balancing+replication+between+repetitive+and+unique+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">SIR2 suppresses replication gaps and genome instability by balancing replication between repetitive and unique sequences.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 552-557 (2017).</li>
<li>Wu, T. D., Reeder, J., Lawrence, M., Becker, G., Brauer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GMAP+and+GSNAP+for+Genomic+Sequence+Alignment%3A+Enhancements+to+Speed%2C+Accuracy%2C+and+Functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">GMAP and GSNAP for Genomic Sequence Alignment: Enhancements to Speed, Accuracy, and Functionality.</a> Methods Mol Biol. 1418, 283-334 (2016).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).</li>
<li>Langmead, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aligning+short+sequencing+reads+with+Bowtie%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Aligning short sequencing reads with Bowtie.</a> Curr Protoc Bioinformatics. , Chapter 11, Unit 11 17(2010).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).</li>
<li>Kellis, M., Birren, B. W., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proof+and+evolutionary+analysis+of+ancient+genome+duplication+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 428, 617-624 (2004).</li>
<li>Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coming+of+age%3A+ten+years+of+next-generation+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies.</a> Nat Rev Genet. 17, 333-351 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Während diese Technik robust ist und relativ geradlinig, besondere Aufmerksamkeit werden, an folgende gewidmet sollte:
(1) Wir empfehlen, mindestens 12 h Kulturen wachsen, bevor sie Log-Phase erreichen, da Unterschiede im Zellzyklus Distributionen zu manifestieren, wenn Kulturen geerntet werden, nach dem Erreichen der gewünschten Dichte nur 4 h nach der Inokulation. Unsere Annahme ist, dass eine Zellzyklus-Distribution, die ein relativ stabiles Gleichgewicht erreicht hat besser als eine Vertei...

Eukaryotische Genom Replikation wird eingeleitet, an mehreren diskreten Standorten, genannt Ursprünge der Replikation, von welchen Replikation Gabeln in beide Richtungen (rezensiert in Fragkos Et Al., 20151) gehen. Ursprünge variieren in ihren Zeitplan und die Effizienz der Zündung und verschiedene Techniken wurden entwickelt, um Replikation Herkunft Aktivitäten überwachen und die Ursachen dieser Unterschiede zu erhellen. Die Aktivität der einzelnen Ursprünge kann aus einsträngiger DNA2, welche Formulare rund um aktive Ursprung abgeleitet werden oder mithilfe von 2D Gelelektrophorese, um spezielle Replikations Zwischenprodukte3zu überwachen, können beide mit erkannt werden radioaktiven Sonden. Beide Techniken sind leichter in S. Cerevisiae als in Säugerzellen, angewendet, da Ursprünge auf bestimmten bekannten Sequenzen in der ehemaligen beschränkt sind. Mit dem Aufkommen von Microarrays wurde es möglich, die Herkunft weltweit brennen zu beurteilen. Dies geschah zunächst durch Kennzeichnung DNA mit schweren Isotopen, Freisetzung von Zellen aus einem G1 in mittlerer mit leichten Isotope und dann die Bildung von schwer-leicht-Hybrid DNA in das Genom4Überwachung. Die Einführung von Hochdurchsatz-Sequenzierung erlaubt ähnliche genomweite Überwachung der Herkunft Aktivität ohne das Erfordernis einer teuren Isotopen Kennzeichnung. Zellen wurden in einem Durchflusszytometer laut DNA-Gehalt und ihre DNA ausgesetzt Tiefe Sequenzierung sortiert. Da Sequenz Abdeckung von 1 X bis 2 X im Laufe der S-Phase verläuft, kann relative Replikation Timing durch Vergleich lesen Sie Tiefen der Zellen in der S-Phase, die in G1 oder G25,6bewertet werden. Diese Techniken, vor allem Hefe, führte zu einem tieferen Verständnis der wie DNA-Sequenz, Chromatinstruktur und DNA-Replikation Proteine Herkunft Timing und Effizienz regulieren.
Treue Übertragung der genetischen Information während der Zellproliferation erfordert nicht nur erfolgreiche Initiation der DNA-Replikation, die stattfindet am Ursprung, sondern auch erfolgreichen Abschluss der Replikation, die auftritt, wo Replikations-Gabeln treffen. Wie die Initiation der Replikation variiert der Zeitpunkt der Fertigstellung der Replikation des Genoms mit bestimmten Regionen bleiben bis spät in den Zellzyklus Langzeittransaktionen. Solche Regionen enthalten Sequenzen oder Chromatin Strukturen, die DNA-Polymerasen behindern oder möglicherweise besonders aktive Replikation Ursprünge fern. Spät repliziert Regionen kann als fragile Sites, manifestieren sich die chromosomalen Bruch und höhere Mutationsraten zugeordnet sind, und haben bei Krebs und Altern7,8,9in Verbindung gebracht. Allerdings hat unser Verständnis von wo und wie dies geschieht trotz der Bedeutung der ordnungsgemäßen Abschluss der DNA-Replikation in der Instandhaltung der Genomstabilität weit hinter der Initiation der Replikation hinterher. Und während einzelner Gene, deren späte Replikation mit Krankheit assoziiert wurde, mit z. B. qPCR10, globale Studien zur Aufklärung der Standorte und die zugrunde liegenden Ursachen der letzten Replikation gefehlt untersucht worden. Hier beschreiben wir eine Technik, die wir uns beziehen, um als "G2 Seq" Wir Durchflusszytometrie mit Hochdurchsatz-Sequenzierung verbinden Aufschluss über die Vollendung des Genoms Replikation in Hefe-11. Mit geringfügigen Änderungen kann dieses Protokoll auf alle Zellen angepasst werden, die Strömung nach DNA-Gehalt sortiert werden können.

<table><tbody><tr><td>YeaStar Genomic DNA Kit</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-323</td><td></td></tr><tr><td>1 &micro; M SYTOX Green</td><td>ThermoFisher</td><td>57020</td><td>resuspendiert in 50 mM Natriumcitrat, pH 7,2</td></tr><tr><td>50 mM Natriumcitrat, pH 7,2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase-Lösung (0,25 mg / ml)</td><td>Sigma</td><td>R6513</td><td>0,25 mg / mL RNaseA resuspendiert in 50 mM Natriumcitrat, pH 7,2, RNase-Lösung nur 10 Minuten vor dem ersten Gebrauch kochen und von da an bei -20 ° C lagern;</td></tr><tr><td>Proteinase K Lösung (20 mg / ml)</td><td>ThermoFisher / Invitrogen</td><td>25530-015</td><td>resuspendiert in 10 mM Tris, pH 7,5, 2 mM CaCl2, 50% Glycerin, lagern bei -20&deg; C</td></tr><tr><td>Model 50 Sonic Dismembrator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB50A220</td><td></td></tr><tr><td>BD Biosciences FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td>644832</td><td></td></tr><tr><td>Zymo-Spin III Säulen</td><td>Zymo Research</td><td>C1005</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorometer</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Covaris Modell LE220 Fokussierter Ultraschallgerät</td><td>Covaris</td><td>500219</td><td></td></tr><tr><td>Illumina TruSeq DNA LT Probenvorbereitungskit</td><td>Illumina</td><td>15026486</td><td></td></tr><tr><td>Illumina HiSeq 2500 Instrument</td><td>Illumina</td><td>SY&ndash; 401&ndash; 2501</td><td></td></tr><tr><td>Gsnap Ausrichtungssoftware</td><td>Open Source Software / Genentech</td><td></td><td>http://research-pub.gene.com/gmap</td></tr></tbody></table>

g2-seq: ein hoher durchsatz sequenzierung-basierten methode zur identifizierung von spät repliziert regionen des genoms

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

Zahlreiche Techniken wurden entwickelt, um den Fortschritt der DNA-Replikation durch die S-Phase des Zellzyklus folgen. Die meisten dieser Techniken sind in Richtung Aufklärung des Standortes und der Zeitpunkt der Einleitung des Genoms Vervielfältigung, anstatt seine Vollendung verwiesen worden. Es ist jedoch wichtig, dass wir Regionen des Genoms, die letzten Replikation abgeschlossen sind verstehen, weil diese Regionen erhöhten chromosomalen Bruch und Mutation leiden, und sie im Zusammenhang mit Krankheit und Alterung wurden. Hier beschreiben wir, wie wir eine Technik, die verwendet wurde, um die Replikation Einleitung um stattdessen diesen Regionen des Genoms letzte vollständige Replikation identifizieren überwachen ausgedehnt haben. Dieser Ansatz basiert auf einer Kombination der Durchflusszytometrie und Hochdurchsatz-Sequenzierung. Obwohl dieser Bericht konzentriert sich auf die Anwendung dieser Technik auf Hefe, kann der Ansatz mit beliebigen Zellen verwendet werden, die in einem Durchflusszytometer laut DNA-Gehalt sortiert werden können.

Wir haben wie oben beschrieben vor spät replizierenden Standorte in der angehenden Hefe verwendet. Tests dieser Ansatz mit einer bekannten späten replizierende Region auf ein künstliches Chromosom erwies sich die Technik präzise und zuverlässig sein. Unsere Ergebnisse haben auch gezeigt, die biologische Bedeutung der rechtzeitigen Abschluss der Replikation zeigen, dass eine spätere replizierende Region auf Chromosom 7, die wir identifiziert als späte Replikation auf der Grundlage unserer ...

Wir beschreiben eine Technik Durchflusszytometrie und Hochdurchsatz-Sequenzierung zu spätere replizierende Regionen des Genoms zu identifizieren, zu kombinieren.

G2-Seq: Ein hoher Durchsatz Sequenzierung-basierten Methode zur Identifizierung von spät repliziert Regionen des Genoms

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens zur Tiefensequenzierung von DNA aus Zellen, die entsprechend der Zellzyklusphase per Flusszytometrie sortiert wurden, besteht darin, Genomregionen zu identifizieren, die äußerst spät im Zellzyklus repliziert werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der DNA-Replikation zu beantworten, beispielsweise, welche Genomabschnitte Schwierigkeiten haben, die DNA-Replikation abzuschließen und daher besonders anfällig für genomische Umstrukturierungen sind. Der wesentliche Vorteil dieser Technik liegt darin, dass sie, obwohl sie experimentell sehr einfach ist, einen überraschend detaillierten Einblick in die Dynamik der genomischen Replikation ermöglicht.Beginnen Sie damit, 15-Milliliter-Reagenzgläser, die acht Milliliter YEPD enthalten, mit den gewünschten Hefe-Zellen zu beimpfen. Sowohl synthetisches als auch reichhaltiges Medium ist geeignet. Kultivieren Sie die Zellen über Nacht für mindestens 12 Stunden, um sie während ihrer eigentlichen logarithmischen Wachstumsphase zu gewinnen.Am folgenden Tag, wenn die Kulturen eine Dichte von fünf bis 15 Millionen Zellen pro Milliliter aufweisen, die Zellen abzentrifugieren und in 1,5 Milliliter 70%igem Ethanol resuspendieren. Anschließend die Suspension in ein 1,6-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen und die Zellen eine Stunde bei Raumtemperatur oder mindestens drei Stunden auf Eis inkubieren lassen. Nach der Inokulation die Zellen erneut abzentrifugieren und in einem Milliliter Natriumcitrat resuspendieren.Schließlich die Zellen zweimal kurz ultraschallen. Anschließend den Zentrifugierzyklus wiederholen und die Hefe in einem Milliliter Natriumcitrat, das RNase enthält, resuspendieren. Die RNase eine Stunde lang bei 50 Grad Celsius oder über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Wärmeblock oder einem Wasserbad mit der Hefe reagieren lassen.Nach der RNase-Behandlung 50 Mikroliter Proteinase-K-Lösung zur Mischung hinzufügen und die Reaktion eine Stunde lang bei 50 Grad Celsius fortsetzen. Anschließend die Zellen abzentrifugieren und in einem Milliliter Natriumcitrat resuspendieren. Danach die Zellen erneut zentrifugieren und den Überstand mit Vakuum abpipettieren.Dann die Zellen im abgedunkelten Licht in einem Milliliter Natriumcitrat mit grünem Nukleinsäurefarbstoff resuspendieren. Anschließend die Hefe eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Zum Fortfahren die Zellen mit einem Zellsortierer unter Verwendung von Emissionsdaten bei 530 Nanometer zählen.Sortieren Sie sie entsprechend ihres DNA-Gehalts in ihre Zellzyklusphasen, G1, S, frühes G2 und spätes G2. Sammeln Sie mindestens 1,6 Millionen haploide Zellen aus jeder Phase. Unmittelbar nach dem Sortieren der Zellen zentrifugieren Sie diese 20 Minuten lang. Aspirieren Sie den Überstand und frieren Sie das Pellet zur Lagerung bei minus 20 Grad Celsius ein.Wir haben festgestellt, dass der einzige entscheidende Schritt für dieses Verfahren darin besteht, die Zellen unmittelbar nach der Sammlung, spätestens jedoch eine Stunde nach dem Sortieren, rasch abzuzentrifugieren. Diese Extraktion basiert auf einem Kit zur Extraktion genomischer DNA aus Hefe. Beginnen Sie damit, 120 Mikroliter Digestionspuffer und fünf Mikroliter lytisches Hefe-Enzym hinzuzufügen.Anschließend die Zellen durch Vortexen in das Reaktionsgemisch einmischen und das Gemisch 40 bis 60 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Danach 120 Mikroliter Lysepuffer hinzufügen und das Gemisch 10 bis 20 Sekunden bei hoher Geschwindigkeit vortexen. Anschließend 250 Mikroliter Chloroform hinzufügen und den Inhalt des Reaktionsrohrs eine Minute lang gründlich mischen.Als Nächstes zentrifugieren Sie das Gefäß zwei Minuten lang mit maximaler Geschwindigkeit. Überführen Sie dann den Überstand auf die DNA-Bindungssäule. Zentrifugieren Sie den Überstand mit einer Zentrifugationsphase von einer Minute bei maximaler Geschwindigkeit durch die Säule.Um die DNA auf der Säulenmembran zu waschen, überführen Sie die Säule in ein neues Sammelröhrchen und geben Sie 300 Mikroliter DNA-Waschpuffer hinzu. Anschließend erneutes Zentrifugieren bei maximaler Geschwindigkeit für eine Minute. Wiederholen Sie diesen Waschschritt noch einmal.Um die DNA zu sammeln, überführen Sie die Säule in ein frisches Gefäß. Geben Sie 60 Mikroliter Wasser hinzu und warten Sie eine bis drei Minuten. Zentrifugieren Sie anschließend die Säule für 10 Sekunden mit maximaler Geschwindigkeit, um das Wasser mit der eluierten DNA zu isolieren.Fügen Sie nun 5 bis 195 Mikroliter Puffer für doppelsträngige DNA mit hoher Empfindlichkeit hinzu, der das Reagenz in einer Konzentration von 1 zu 200 enthält. Anschließend messen Sie die Fluoreszenz der Probe, um die Ausbeute zu berechnen. Mit einer DNA-Menge zwischen 10 und 50 Nanogramm ist zu rechnen.Verwenden Sie nun die Sonifikation, um die DNA in Fragmente zwischen 250 und 350 Basenpaaren zu zerlegen. Anschließend verwenden Sie ein Standard-Kit, um eine DNA-Bibliothek herzustellen, und sequenzieren diese mit mindestens 10 Millionen 50 Basenpaaren langen Einzelstrang-Lesungen. Das beschriebene Verfahren wurde verwendet, um spät replizierende Stellen in Bäckerhefe zu identifizieren.Normale Zellen wurden mit Zellen verglichen, die Sir2, ein Deacetylasen-Protein, fehlte. Die Rohdaten enthielten große Spitzen, die hauptsächlich auf das Vorhandensein von TY-Elementen zurückzuführen waren. Diese Spitzen wurden entfernt, indem die Read-Tiefen auf das 2,5-fache der medianen Read-Tiefe pro Probe begrenzt wurden.Die entstörten Daten wurden anschließend mit einem 20-kb-Gleitfenster geglättet. Schließlich wurden die Daten normalisiert und als Verhältnisse zu den Werten in G1 dargestellt. Eine vollständig nicht replizierte Zelle würde bei 0,5 liegen, eine vollständig replizierte Zelle bei eins. In diesen Daten von Chromosom sieben war ein Hinweis auf eine bekannte spät replizierende Region im Sir2-Mutanten zu erkennen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man jene Genomregionen identifiziert, die als letzte die DNA-Replikation abschließen und die deshalb besonders anfällig für DNA-Brüche und andere Probleme sind, die mit einer späten Replikation assoziiert sind.

g2-seq-high-throughput-sequencing-based-technique-for-identifying

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

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gDNA Enrichment durch eine Transposase-basierte Technologie für NGS-Analyse der gesamten Sequenz von BRCA1, BRCA2 Und 9 Gene in der DNA-Reparatur beteiligt Schäden

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Dieses Manuskript beschreibt die experimentelle Prozedur und Softwareanalyse für einen bidirektionalen Integrationsort-Assay, der gleichzeitig stromaufwärts und nachgeschaltete Vektor-Host-Junction-DNA analysieren kann. Bidirektionale PCR-Produkte können für jede nachgeschaltete Sequenzplattform eingesetzt werden. Die resultierenden Daten sind nützlich für einen hochdurchsatzreichen, quantitativen Vergleich von integrierten DNA-Targets.

Bidirektionale Retrovirale Integrationsstelle PCR Methodik und quantitative Datenanalyse Workflow

Gel-Seq ermöglicht Forschern gleichzeitig Bibliotheken für beide DNA und RNA-Seq bei vernachlässigbaren Kosten ab 100-1000 Zellen mit einem einfachen Hydrogel-Gerät vorzubereiten. Dieser Beitrag stellt einen detaillierten Ansatz für die Herstellung des Geräts sowie das biologische Protokoll zum gekoppelte Bibliotheken zu generieren.

Gel-Seq: Eine Methode zur gleichzeitigen Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung von DNA und RNA mit Hydrogel Matrizen

Die Kennung der physikalischen Wechselwirkungen zwischen Genen und regulatorische Elemente ist anspruchsvoll aber erfassen Bezahlungsmethode Chromosom Konformation erleichtert worden. Diese Modifikation des 4C-Seq-Protokolls mildert PCR Bias durch Minimierung der Überverstärkung PCR-Vorlagen und maximiert die Mappability von Lesevorgängen durch den Einbau eines Zusatz Restriktionsenzym verdauen Schritt.

Hochdurchsatz-Identifizierung des Gens regulatorischen Sequenzen mit Next-Generation Sequenzierung der kreisförmigen Chromosom Konformation erfassen (4C-Seq)

Hier stellen wir ein Protokoll zur Anreicherung endogener RNA-Bindungsstellen oder "Footprints" von RNA:Protein(RNP)-Komplexen aus Säugetierzellen vor. Dieser Ansatz umfasst zwei Immunpräzipitationen von RNP-Untereinheiten und wird daher als RNA-Immunpräzipitation im Tandem (RIPiT) bezeichnet.

Identifizierung von Fußabdrücken von RNA:Protein-Komplexe über RNA-Immunpräzipitation im Tandem gefolgt von Sequenzierung (RIPiT-Seq)

Im Folgenden wird das Verfahren zur Analyse des Replikationsverlaufs durch pathogene, strukturanfällige Wiederholungen mittels 2-dimensionaler Gelelektrophorese skizziert.

Elektrophoretische Analyse der Replikation durch strukturanfällige DNA-Wiederholungen innerhalb des SV40-basierten humanen Episoms

Ein hoher Durchsatz, automatisierte, Tabakprotoplasten Produktion und Transformation-Methodik beschrieben. Das Robotersystem ermöglicht massiv parallele Genexpression und Entdeckung im Modell BY-2-System, das auf nicht-Modellpflanzen übersetzbar sein sollte.

Ein Roboter-Plattform für Hochdurchsatz-Isolierung von Protoplasten und Transformation

Lernen Sie G2-Seq zur Identifizierung spät replizierender Genomregionen mittels Durchflusszytometrie und Hochdurchsatzsequenzierung. Diese Methode liefert Einblicke in die Dynamik der DNA-Replikation.

G2-Seq: Ein hoher Durchsatz Sequenzierung-basierten Methode zur Identifizierung von spät repliziert Regionen des Genoms

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