Umfassendes Protokoll zur Probe und Prozess des Knochenmarks zur Messung von messbaren Resterkrankung und leukämischen Stammzellen in der akuten myeloischen Leukämie

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, eine genaue Untersuchung von Knochenmarkproben von Patienten mit akuter myeloischer Leukämie auf messbare Resterkrankungen durchzuführen, einschließlich der Quantifizierung von Leukämiestammzellen. Diese Methode kann eine genaue Beurteilung der messbaren Resterkrankung in Knochenmarkproben von Patienten mit akuter myeloischer Leukämie liefern. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass eine genaue Befolgung des Protokolls zu hochreproduzierbaren, qualitativ hochwertigen Ergebnissen führt.

Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die klinische Entscheidungsfindung, da sie als Ablesung des Ansprechens der Patienten auf die Behandlung verwendet werden kann. Jeroen Janssen, Hämatologe, Gerrit Sijm, Techniker des Labors für diagnostische Hämatologie, und Jennifer Scheick und Sander Snel, Techniker des MRD-Teams, werden die Verfahren vorführen. Wenn sich der Patient in der lateralen Dekubitusposition befindet, wird die hintere Beckenwirbelsäule mit einem Stift markiert und die Haut des vorgesehenen Biopsiebereichs mit 0,5 bis 1 % Chlorhexidin in Ethanol in einer nach außen kreisenden Bewegung nach außen desinfiziert.

Nehmen Sie nach der Verabreichung eines Lokalanästhetikums eine 15-Gauge-2,8-Zoll-Nadel mit dem proximalen Ende in der Handfläche und dem Zeigefinger gegen die Seite des Metallschafts der Nadel in der Nähe der Spitze zur Kontrolle. Führen Sie die Nadel mit sanftem, aber festem Druck mit einer schnellen, abwechselnd pronierenden, supinierenden Bewegung durch die anästhesierte Haut in Richtung der Beckenwirbelsäule ein. Wenn die Nadel mit der hinteren Beckenwirbelsäule in Berührung kommt, entfernen Sie die Stilette und befestigen Sie eine leere 10-Milliliter-Spritze an der Nadel.

Ziehen Sie den Kolben vorsichtig zurück, um einen Unterdruck in der Spritze zu erzeugen, bis bis zu 10 Milliliter Knochenmarknadeln entnommen wurden. Nehmen Sie nicht mehr als 10 mil Knochenmark pro Aspirat ein, um eine Hämodilution zu vermeiden. Entfernen Sie die Spritze und setzen Sie das Stilette wieder auf die Nadel.

Werfen Sie dann etwa zwei Milliliter des Knochenmarks in ein Uhrglas aus und stellen Sie sicher, dass genügend Probe entnommen wird, um in ein mit Heparin beschichtetes Acht-Milliliter-Röhrchen injiziert zu werden, und drehen Sie das Röhrchen sofort um. Um eine Gerinnung zu verhindern, ist es wichtig, das gerinnungshemmende Röhrchen zu investieren, sobald das Knochenmark zugesetzt wird. Für eine optimale morphologische Beurteilung übertragen Sie mit einem Kunststoffspatel die Spikulen aus dem Aspirat im Uhrglas auf einen Objektträger und schieben Sie vorsichtig einen weiteren Objektträger über das Mark.

Nach dem Trocknen färben Sie die Spikulen mit May-Grunwald Giemsa für die lichtmikroskopische Analyse. Legen Sie das Knochenmarkröhrchen in einen Kunststoffhalter und legen Sie den Halter in einen Kunststoffbehälter mit einer Umgebungsgelpackung und einem ausgefüllten Antragsformular. Bevor Sie das Knochenmark mittels Durchflusszytometrie analysieren, starten Sie das Durchflusszytometer und öffnen Sie die Durchflusszytometrie-Analysesoftware, um ein neues Experiment mit einem Vorwärtsstreu- und einem Seitenstreupunktdiagramm zu erstellen.

Um die Größe und Granularität der Zellen zu beurteilen, laden Sie unmarkierte lysierte periphere Blutzellen von einem gesunden Spender und wählen Sie die Funktion Zellen erwerben. Gatet die Lymphozyten und passen Sie die Vorwärts- und Seitenstreuspannungen an, um die entsprechenden mittleren Zielwerte für die Gated-Zellpopulation zu erreichen. Rufen Sie dann Daten für mindestens 10.000 Ereignisse ab.

Um die Photomultiplier-Röhrenspannungen des Ziel-Floreszenzkanals einzurichten, verwenden Sie zunächst Regenbogenperlen-Kalibrierungspartikel mit acht Spitzen gemäß den Anweisungen des Herstellers, um 10.000 Ereignisse mit einer niedrigen Durchflussrate zu erfassen. Gate der Singulett-Perlen im Scatter-Dot-Plot "Forward versus Side", gefolgt von einem Gating des 7. Peaks im FITC-PE-Dot-Plot. Gate die resultierenden Kügelchenpopulationen für jedes Fluorophor.

Setzen Sie die Erfassung der Regenbogenperlensuspension mit acht Peaks fort und passen Sie die PMT-Spannungen in allen Fluoreszenzkanälen an, um die MFI-Zielwerte gemäß den Anweisungen des Herstellers zu erreichen. Verwenden Sie Aufzeichnen, um Daten von etwa 2.000 Ereignissen zu sammeln, und überprüfen Sie den MFI auf die 7. Spitzenperle. Als nächstes fügen Sie ein ausreichendes Volumen jedes experimentellen Fluorochrom-konjugierten Antikörpers hinzu, um die Kügelchen in den entsprechenden Floreszenzröhrchen abzüglich einer Kontrolle zu färben und die Röhrchen gründlich zu wirbeln.

Erstellen Sie ein neues leeres Experiment mit denselben Kompensationsparametern, wobei Sie darauf achten, dass der Schwellenwert für die Vorwärtsstreuung auf 5.000 festgelegt ist und die Kompensationswerte aller Fluorochrome null sind. Um die Kompensationsregler zu erstellen, wählen Sie die Funktion Kompensationssteuerung erstellen und laden Sie das nicht gefärbte Regelrohr. Passen Sie das P1-Gate an die Singulett-Bead-Population an, und vergewissern Sie sich, dass das P1-Gate nur Singulett-Beads enthält.

Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das P1-Gate und wählen Sie Auf alle Kompensationssteuerelemente anwenden. Zeichnen Sie dann die Daten für alle einzeln markierten Fluoreszenzröhren auf und bestätigen, dass das P2-Gate die positive Population in jedem Floreszenzhistogramm umfasst. Um die Zellen für die durchflusszytometrische Analyse zu färben, transportieren Sie das Knochenmark ins Labor, überprüfen Sie das Antragsformular, um die Studiennummer und das Geburtsdatum des Patienten zu überprüfen, und bestimmen Sie, was gefärbt werden muss.

Für die MRD verwenden wir eine Färbeplatte, die aus vier Röhrchen besteht. Hier zeigen wir die Färbung der LSC-Platte, die aus einem Rohr besteht. Übertragen Sie nach der Zellzählung das entsprechende Volumen des Knochenmarks in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen.

Fügen Sie Lysepuffer mit dem 10-fachen des experimentellen Zellvolumens hinzu, um die roten Blutkörperchen zu lysieren. Drehen Sie das Röhrchen um, um die Zellen zu mischen und 10 Minuten bei Raumtemperatur zu inkubieren. Am Ende der Lysephase pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation.

Resuspendieren Sie die Zellen in 15 Millilitern Waschpuffer bei Raumtemperatur und ernten Sie das Zellpellet erneut durch Zentrifugation. In der Zwischenzeit pipettieren Sie die entsprechende Menge der Antikörper-Cocktail-Lösung in Fünf-Milliliter-FACS-Röhrchen. Hier ist das Panel für das Stammzellröhrchen zu sehen.

Resuspendieren Sie das Pellet in Waschpuffer und geben Sie die Suspension der Zelle in das FACS-Röhrchen mit der monoklonalen Antikörper-Cocktaillösung für eine 15-minütige Inkubation im Dunkeln. Waschen Sie dann die Zellen in Waschpuffer und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation. Nach der Zentrifugation resuspendieren Sie das Pellet in 400 Mikrolitern frischem Waschpuffer

Um die leukämischen Stammzellen zu analysieren, fügen Sie der Zellsuspension, die mit dem Stammzell-Antikörper-Cocktail gefärbt ist, vier Mikroliter blanke Kügelchen hinzu. Lesen Sie dann die Proben mit den zuvor eingestellten Parametern ab und erfassen Sie mindestens viermal 10 bis zum 6. Ereignis aus den experimentellen Patientenproben. Um den Leukämie-assoziierten Immunphänotyp zu identifizieren, der bei etwa 90 % der Patienten mit akuter myeloischer Leukämie beobachtet wird, ist es entscheidend, dass die Blast-Gates wie dargestellt richtig gesetzt werden.

Hier werden Beispiele für Daten von einzelnen Patienten gezeigt, die unterschiedliche Arten von Aberrantik auf den CD34-positiven primitiven Zellen aufweisen. In diesen Diagrammen sind ein Patient zu beobachten, der sich in vollständiger Remission befindet, und ein Patient, der nach dem zweiten Zyklus der Induktionstherapie messbare positive Ergebnisse bei der Resterkrankung erlitten hat, was die Notwendigkeit einer genauen Gate-Einstellung vor der Probenanalyse unterstreicht. Die Identifizierung und Quantifizierung von LSC erfordert eine zusätzliche Analyse von Aberranten, die speziell auf CD34-positiven CD38-negativen Blastenzellen zu finden sind, wie in diesen Grafiken dargestellt.

Bei der Durchführung dieses Protokolls ist es sehr wichtig, spezialisiertes und unterstützendes Personal für die Knochenmarkentnahme, den Transport, die experimentelle Arbeit und die Analyseschritte dieses Verfahrens zu haben. Dieses Verfahren kann auch zur Durchführung zytogenetischer und molekularer Analysen verwendet werden, um zusätzliche Fragen zur Korrelation zwischen spezifischen Zellpopulationen und molekularen Anomalien von Interesse zu beantworten oder um die Risikogruppe eines Patienten für die Vorhersage des klinischen Ergebnisses zu verfeinern. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Hämatologie, um die Resterkrankung von AML-Patienten nach der Behandlung zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie wir Resterkrankungen mithilfe der Durchflusszytometrie genau identifizieren und quantifizieren, einschließlich der Entnahme und des Transports von Knochenmarkproben von AML-Patienten.