Name: Umfassendes Protokoll zur Probe und Prozess des Knochenmarks zur Messung von messbaren Resterkrankung und leukämischen Stammzellen in der akuten myeloischen Leukämie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Lernen Sie ein standardisiertes Protokoll zur Knochenmarkaspiration und Durchflusszytometrie für die MRD-Detektion bei akuter myeloischer Leukämie. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Quantifizierung leukämischer Stammzellen.

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Diese Forschung wurde von niederländischen Krebsgesellschaft (ALPE 2013-6371) und Egbers Stiftung für VONK unterstützt. Wir danken der niederländischen AML-MRD-Arbeitsgruppe für die Zusammenarbeit und fruchtbaren Diskussionen zur kontinuierlichen Verbesserung und Standardisierung der AML-MRD.

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<li>Feller, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRD+parameters+using+immunophenotypic+detection+methods+are+highly+reliable+in+predicting+survival+in+acute+myeloid+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">MRD parameters using immunophenotypic detection methods are highly reliable in predicting survival in acute myeloid leukaemia.</a> Leukemia. 18 (8), 1380-1390 (2004).</li>
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<li>Ravandi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+minimal+residual+disease+assessed+by+multiparameter+flow+cytometry+is+highly+prognostic+in+younger+patients+with+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Persistence of minimal residual disease assessed by multiparameter flow cytometry is highly prognostic in younger patients with acute myeloid leukemia.</a> Cancer. 123 (3), 426-435 (2017).</li>
<li>Hourigan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurable+residual+disease+testing+in+acute+myeloid+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Measurable residual disease testing in acute myeloid leukaemia.</a> Leukemia. 31 (7), 1482-1490 (2017).</li>
</ol>

Die Antikörper-Cocktails verwendet für die Validierung der Stammzell-Röhre in mehrere unabhängige Institute wurden freundlicherweise zur Verfügung gestellt von BD. Die Autoren haben nichts in Bezug auf diese Handschrift offenzulegen.

Sind genügende Daten zur Verfügung, die den Beweis für MRD-Positivität mit Armen überleben assoziiert wird, und daher kann MRD Bewertung Patienten-Outcome verbessern, indem Sie zusätzliche prognostische Informationen auf dem klinischen Entscheidungen getroffen werden können. Daher unbedingt eine konsistente und abgestimmte Methode für Immuno-phänotypische Beurteilung der MRD letztlich Patient Therapie zu verbessern. Dies ist auch wichtig, beim Vergleich von klinischer Studies in verschiedenen Studienzentren, und kann letztlich Hilfe in klinischen Entscheidung machen und dient als ein Surrogat klinischen Endpunkt für die Gesamtüberlebenszeit. Die Vorstellung, dass solide Richtlinien für genaue und konsistente MRD-Messungen gerechtfertigt sind führte zu einer konzertierten Aktion der Europäischen Leukämie Netzwerk (ELN), State-Of-The-Art-Design-Richtlinien. Dieses umfassende Dokument veröffentlichte Ende 2017 werden, und werden für viele Studiengruppen und Labors voran.
Wichtige Schritte im Rahmen des Protokolls
Ein wichtige und oft übersehener Aspekt der MRD-Analyse ist die Auswirkung der Sample-Qualität über die genaue Bestimmung der MRD. Dies wird deutlicher, wenn Material muss transportiert werden, an anderen Instituten in weltweiten klinischen Studien gegeben, die zusätzliche betriebliche Aspekte, die in diesem Rahmen berücksichtigt werden müssen. Um das Risiko der Verwechslung von Patienten ist Informationen und pünktliche Lieferung der Proben angemessene Verwaltung entscheidend. Auch in diesem Stadium des Transports ist die richtigen Formen und/oder Import in elektronischen Krankenhaussysteme mit klaren Zuordnungen der gewünschten Analyse erforderlich. Kenntnis nehmend von der Bühne Therapie MRD Sampling ist auch entscheidend, da es möglicherweise relevant für die klinische Entscheidungsfindung (zum Beispiel nach dem zweiten Kurs der Therapie) und sollte daher klar definiert werden. Die Verwendung von simulierten Daten (wie zum Beispiel 1. Januar pro Geburtsjahr) erhöht das Risiko der Verwechslung von Patienten oder Analysen. Sofern dies gesetzlich vorgeschrieben ist, sollte eine alternative anonymisierte Form der Identifizierung verwendet werden.
Alle Proben für die Immunphänotypisierung sollte vorzugsweise innerhalb von 24 h Kollektion verarbeitet werden. Obwohl nicht zu empfehlen, können bei bis zu 72 h bei Raumtemperatur aufbewahrt dem Knochenmark und peripherem Blutproben noch verarbeitet und analysiert werden. Darüber hinaus alle Handhabungen mit dem Material können am besten durchgeführt werden unter sterilen Bedingungen, so dass weitere Kryokonservierung von Zellen in (lokalen) Biobanken relevant bleibt: zahlreiche klinische Studien haben zusätzliche Analysen, Leukämie-Zellen mit weiter zu untersuchen in Bezug auf molekularer, Immuno-phänotypische und funktionelle Eigenschaften zu einem späteren Zeitpunkt durchgeführt werden. Details des Biobanking sind jedoch nicht in den Anwendungsbereich dieser Handschrift.
Mit MRD als Diagnosewerkzeug impliziert, dass es ein akkreditiertes Labor nicht nur für Durchflusszytometrie, aber auch zur Qualitätskontrolle von MRD Bewertung braucht. Dies erfordert möglicherweise Muster zu bestimmten Referenzlaboratorien oder (wieder-) analysieren Flow-Dateien mit der MRD-Messungen von Referenz-Teams zu verteilen.
Dieser Artikel beschreibt die wichtigsten Aktionen aus dem Knochenmark Aspirat Sammlung zur Bestimmung der MRD in klinischen Proben - erfordern ein ganzes Team von Experten mit spezifischen Aufgaben, Zuständigkeiten, und häufige Kommunikation für eine effektive Charakterisierung und Analyse. Da jede Aufgabe entscheidend für das Verfahren ist, empfiehlt es sich, haben solide Logistik einschließlich der Protokolle bei jedem Labor und ausreichend speziell dafür geschultem Personal sichern. Darüber hinaus gibt es einige relativ subjektive Schritte Teil der Verfahren (vor allem LAIP und LSC aberranten Marker-Identifikation), gilt es, Diskussionen über das Endergebnis vom Team, und haben den Abschlussbericht autorisiert durch ein Team von Aufsichtsbehörden. Aktuelle Bemühungen verfolgen Computer-Software-Entwicklung, die hilft, die (LAIP und LSC) MRD-Analyse zu standardisieren.
Modifikation und Fehlerbehebung
Jede Übungseinheit haben einen eigenen Satz von Antikörpern, die verwendet werden können, die verschiedenen Subpopulationen zu definieren, obwohl mit einem standardisierten Rückgrat der Marker essentiell für vergleichbare Ergebnisse wie in den ELN-Stand der Technik-Leitlinien für MRD Messungen Dokument beschrieben oben genannten. Unabhängig von der gewählten Marker gibt es einige Probleme, die die Analyse der Ergebnisse erschweren und müssen berücksichtigt werden können.
Grenzen der Technik
Die Identifizierung von LAIP und LSC aberranten Marker Ausdruck ist zuerst bei der Diagnose bewertet und überwacht im Laufe der Zeit (während und nach der Therapie) für die genaue Charakterisierung des Phänotyps MRD. Während mehr als 95 % der Patienten über LAIP LSC (oder beides) ausgewertet werden kann, noch einige Patienten haben keine definierte LAIP oder keine CD34 + CD38-LSC mit CD34 negative Blasten zu präsentieren oder haben eine fehlende Diagnose Probe. In diesen Fällen lohnt sich immer noch versuchen zu messen MRD mit einem Panel von Antikörpern so breit wie die Anzahl der verfügbaren Zellen ermöglicht und wählen Sie dann die zuverlässigste (was der stärkste Unterscheidung der leukämischen Zellen) LAIP. Wenn man bedenkt, dass ein Teil der Patienten, die letztlich Rückfall nicht vollständig Diagnose Immunophenotype, aufgrund der Heterogenität der AML Krankheit ähneln messen eine breite Gruppe von Antikörper bei MRD wird jedenfalls empfohlen. Diese Immunophenotypic Verschiebungen gehören Blasten und LSC und haben gezeigt, dass während der Therapie16 auftreten und messbare Erkrankung auf diese sogenannten kommende Populationen beruhen kann. Zu diesem Zeitpunkt wurde jedoch es nicht bestimmt, ob alle Immunophenotypic Sub-Populationen zum Rückfall der Erkrankung führt, und daher nicht allgemein üblich, MRD zugeschnitten-Therapie Berichten auf diese Zellen in klinischen Studien basiert. Es ist wichtig zu beachten, dass das Risiko der fehlenden LSC wegen der Bevölkerung Verschiebungen durch eine Röhre Ansatz reduziert wird, in dem die wichtigsten Aberrancy definierenden Marker in einem Durchflusszytometrie (PE) Kanal14 sind.
Bedeutung im Hinblick auf bestehende Methoden
In diesem Protokoll beschriebene Methode stützt sich auf die Definition von einem oder mehreren LAIP, welche Zellen während der Therapie gefolgt sind. Ein Nachteil dieser Methode ist, dass es vor kurzem gezeigt hat, dass LAIP während der Therapie ändern kann. Auf diese Weise können einige kommende Populationen mit verschiedenen aberranten Marker übersehen werden. Um dies zu umgehen, wäre es am besten, alle aberranten Marker anstatt nur diejenigen, die zum Zeitpunkt der Diagnose gefunden zu messen. Dies dann wäre ähnlich wie bei der "unterscheidet sich von normalen" Ansatz, die von mehreren Labors17verwendet wird.
Zukünftige Anwendungen
Vor kurzem erhielt MRD zusätzliche Aufmerksamkeit für neue klinische Studien-Entwurf. In der Ära der spezialisierten Behandlungsmöglichkeiten und gezielte medikamentöse Therapie wird die Verwendung von MRD als Ergebnis Maßnahme reduzieren den Zeitaufwand für die klinischen Wirksamkeit von neuen Behandlungsmethoden, letztlich so, dass die schnellere Einführung von therapeutischen dringend zu etablieren Optionen in der Klinik. Die Bedeutung der entsprechenden Logistik und praktische Ausführung einer harmonisierten MRD-Bewertung sind entscheidend für den zukünftigen Erfolg der AML-Behandlung, da die FDA untersucht derzeit die Machbarkeit der Verwendung MRD als Surrogat Endpunkt anstelle des Gesamtüberlebens misst18.

Akuter myeloischer Leukämie (AML) ist, dass eine Bösartigkeit des Knochenmarks durch defekte Reifung mit im Programm, abnorme Proliferation und Anhäufung von myeloischen Vorläuferzellen, Hemmung der normalen Hämatopoese und letztlich Knochenmarkinsuffizienz gekennzeichnet . Die Krankheit ist sehr heterogen hinsichtlich Morphologie, Immunophenotype, Zytogenetik, molekulare Aberrationen und gen Ausdruck Signaturen sowie Behandlungserfolg und Behandlung Ergebnis1,2. Aktuelle Management umfasst Induktions-Chemotherapie mit dem Ziel zu erreichen, kompletten Remission (CR), gefolgt von der Post-Remission Behandlung, sich weitgehend an die Ergebnisse der molekularen, zytogenetische orientiert und Immunophenotypic Studien und besteht aus entweder mehrere Studiengänge zusätzliche Chemotherapie oder (autologen oder allogenen) Stammzellen Transplantation3. Trotz hohen Remissionsraten nach intensiver Chemotherapie von bis zu 90 % 5-Jahres-Überlebensrate bei Erwachsenen nur ca. 30-40 %, überwiegend aufgrund der Entwicklung der Rückfall häufig resistent gegen Chemotherapie und dadurch sehr schwer zu behandeln sind. Ergebnis bei Kindern ist besser, obwohl etwa ein Drittel auch Rückfall. Daher, Früherkennung von drohenden Rückfall füllt einen ungedeckten medizinischen Bedarf und führe nach Remission Therapie4.
Resterkrankung nach Therapie die Summe aller Diagnose und Post-Diagnose Mechanismen/Resistenzfaktoren wiedergibt; Daher kann seine Messung prognostische und Instrumentalmusik für die Führung der Behandlung sein. Die Möglichkeit der Deﬁnition Resterkrankung (ehemals minimaler Resterkrankung und jetzt bezeichnet als messbare Resterkrankung oder MRD) weit unter dem morphologischen Kriterium der 5 % Blasten wandelt sich die Landschaft des Risiko gehört. Derzeit sind die beiden Methoden meist verwendet, um MRD erkennen Flow Cytometry und molekular-basierten, letzteres durch Reverse Transkriptase PCR (RT-qPCR)5 bewertet wird oder, obwohl in einem frühzeitigen Stadium von next Generation sequencing (NGS). Viele Studien bei Erwachsenen sowie bei Kindern zeigten bereits, dass verschiedene MRD Ansätze starke prognostische Informationen in AML sowohl nach Induktion und Konsolidierung Therapie6,7, und eine neue Definition der Krankheit Belastung ( besser als morphologische CR) entsteht nun8. Dies deutet darauf hin, dass MRD durch Strömung beurteilt und/oder molekulare Techniken werden sollte, und in der Tat werden bereits, standard in jeder klinischen Prüfung AML.
Dieses Manuskript beschreibt das detaillierte Flow Cytometry Verfahren um eine genaue und reproduzierbare Immunophenotypic Charakterisierung von MRD in Knochenmarkproben, einschließlich das Knochenmark-Sampling und Verarbeitungsverfahren vor Durchflusszytometrie zu erhalten. Die Verfügbarkeit von guter Qualität des Knochenmarkproben bei Diagnose und Nachsorge ist entscheidend für den Erfolg dieser Messung über klinische und klinische Studien. In der Tat sind diese Pre-analytischen Überlegungen auch von entscheidender Bedeutung für molekulare (PCR und NGS) MRD Ansätze. Zur Immunophenotypic Charakterisierung von MRD werden akzessorisch zum Ausdruck gebrachten Marker kombiniert mit Normal myeloischen und Stammvater Marker zu identifizieren, eine Leukämie-assoziierten Immunophenotype (LAIP)9. MRD misst die Resultante viele Einflussfaktoren Ansprechen auf die Therapie, wie intrinsischen oder erworbene Leukämie Resistenzen, Pharmakodynamik und Kinetik-Therapie, Immunüberwachung und Compliance. MRD ist daher ein sehr stark nach Diagnose prognostische Parameter zugeordnete klinische Outcome als dichotome auf ein Abkürzungniveau von Empfänger-Betrieb Merkmal (ROC) Analyse bestimmt. Für unsere Erwachsenen AML-Kohorte der HOVON 42a Studie, die Abkürzungniveau befindet sich bei 0,1 % LAIP positive Zellen/Gesamtzahl weißer Blutkörperchen. Verwenden dieses Kriterium zur Bestimmung negativ Vs positive MRD Status, kann eine Gruppe von Patienten identifiziert werden, die haben eine deutlich schlechtere Rückfall auftreten, Rückfall-freie und allgemeine überleben6. Darüber hinaus beschreiben wir die Messung von unreifen, resistente Leukämiezellen mit Stammzell-ähnliche Funktionen (CD34 + CD38-Leukämie-Stammzellen oder LSC), bietet einen starken Prädiktor des Patienten-Outcome-10. Zusammen LAIP und LSC nähert sich Form der Strömung durchflusszytometrischen MRD Ansatz. LAIP Ansatz eignet sich für etwa 90 % der Patienten, während der LSC-Ansatz in etwa 80 % der Patienten angewendet werden kann. Zusammen mehr als 95 % der Patienten auswertbar für einen Parameter oder beide.
Zu guter Letzt bietet diese Publikation eine detaillierte operative Beschreibung um MRD durch Durchflusszytometrie zu beurteilen. Dazu gehören: (1) Harmonisierung und/oder Standardisierung von Knochenmark Stichprobenverfahren, 2) Probe Transport Beratung (3) detaillierte Beschreibung der leukämischen Zellen Erkennung mit FACS durch mehrere Antikörper-Platten einschließlich Einzelzelle Rohr Ansätze zur Charakterisierung der LSC, 4) Aufbau der FACS Maschinen für standardisierte Messungen, 5) analytische Programme für MRD-Messungen und 6) analytische Programme für LSC-Erkennung.
Wir wollen zeigen alle Facetten des Verfahrens einschließlich der Probenvorbereitung, da, die selten diskutiert wird, während es ein wichtiges Thema für die Qualität der das Endergebnis ist. Knochenmarkaspiration und Biopsie sind klinische Verfahren verwendet, um die blutbildenden Zellen im Knochenmark zu bewerten. Diese werden zusammen mit ein komplettes Blutbild (CBC) und Blutausstrich durchgeführt. Die optimale Methode für die Knochenmarkaspiration ist entscheidend für die genaue Diagnose und Nachbereitung für MRD Messung. Darüber hinaus sollte eine erfolgreiche Knochenmark Aspirat genügend Zellen ausführen LAIP und LSC Strömungsanalyse (mindestens 10 Millionen lebensfähige Zellen) enthalten. Hier beschreiben wir die Methode zum Durchführen einer Knochenmarkaspiration und Leitlinien, die angemessene Zelle Probenahme (und begrenzt das Potenzial für Polopiryna) benötigt für präzise Diagnostik und zusätzliche Forschung führen sollte. Diese Pre-analytischen Überlegungen sind auch von entscheidender Bedeutung für molekulare (PCR und NGS) MRD Ansätze. Alle Proben für die Immunphänotypisierung sollte vorzugsweise innerhalb von 24 h Kollektion verarbeitet werden. Obwohl nicht zu empfehlen, können bei bis zu 72 h bei Raumtemperatur aufbewahrt dem Knochenmark und peripherem Blutproben noch verarbeitet und analysiert werden. Darüber hinaus sollten alle Handhabungen mit dem Material unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden, um die Kryokonservierung von sterilen Zellen zur späteren Forschung/Qualitätsbewertung etc. zu ermöglichen.

<table><tbody><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>120995496,060996589 und 013729</td><td>FACS Canto II&nbsp;</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>555360</td><td>CD7 FITC</td></tr><tr><td></td><td>DAKO</td><td>F076701</td><td>CD2 FITC</td></tr><tr><td></td><td>Sanquin</td><td>M1613</td><td>CD36 FITC</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>332778</td><td>CD15 FITC</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>335039</td><td>CD45RA FITC</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>345810</td><td>CD56 PE</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>337899</td><td>CD22 PE</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>345785</td><td>CD14 PE</td></tr><tr><td></td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-080-801</td><td>CD133 PE</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>562566</td><td>Clec12a PE</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>565568</td><td>Tim-3 PE</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>332774</td><td>CD7 PE</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>333142</td><td>CD11b PE</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>337899</td><td>CD22 PE</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>345810</td><td>CD56 PE</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>347222</td><td>CD34 PERCP-CY5.5</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>558714</td><td>CD123 PERCP-CY5.5</td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>B49221</td><td>CD117 PE-CY7</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>562854</td><td>CD33 BV421</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>345791</td><td>CD19 APC</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>333143</td><td>CD11b APC</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>345800</td><td>CD33 APC</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>345807</td><td>CD38 APC</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>641411</td><td>HLA-DR APC-H7</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>560532</td><td>CD44 APC-H7</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>562596</td><td>CD13 BV421</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>348811</td><td>CD34 PE-CY7</td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>A96416</td><td>CD45 Krome Orange</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>655873</td><td>CD45 HV500c</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>655051</td><td>CST Beads&nbsp;</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td>Pharm Lyselösung</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>644204</td><td>Multicolor CompBeads</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>655051</td><td>CST beads</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>FACSDiva software</td></tr><tr><td></td><td>Cytognos</td><td></td><td>Infinicyt&nbsp;</td></tr><tr><td></td><td>Spherotech</td><td>Euroflow RCP-30-5a</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Tuerk Lösung</td></tr><tr><td></td><td>Spherotech</td><td>BCP-100-5</td><td>Blank Calibration Particles</td></tr> <tr><td>Beads&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>HSA</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Azid</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>ddH2O</td></tr></tbody></table>

umfassendes protokoll zur probe und prozess des knochenmarks zur messung von messbaren resterkrankung und leukämischen stammzellen in der akuten myeloischen leukämie

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Ansprechkriterien in akute myeloische Leukämie (AML) wurde vor kurzem wieder hergestellt, mit morphologische Untersuchung genutzt, um festzustellen, ob Patienten eine kompletten Remission (CR) erreicht haben. Etwa wird die Hälfte der erwachsenen Patienten, die CR eingegeben innerhalb von 12 Monaten wegen der Auswuchs der verbleibenden AML-Zellen im Knochenmark Rückfall. Die Quantifizierung dieser verbliebenen Leukämiezellen, bekannt als minimal oder messbare Resterkrankung (MRD), kann ein robustes Biomarker für die Vorhersage der diese Schübe. Darüber hinaus hat die Retrospektive Analyse mehrerer Studien gezeigt, dass die Anwesenheit von MRD im Knochenmark von AML-Patienten mit schlechten Überleben korreliert. Nicht nur ist die Gesamtbevölkerung der leukämischen, reflektiert von Zellen beherbergen eine Leukämie associated Immune-Phänotyp (LAIP), verbunden mit klinischen Ergebnis, aber so ist die unreifen Niederfrequenz-Subpopulation von Leukämie-Stammzellen (LSC), die beide werden können überwacht durch Durchflusszytometrie MRD oder MRD-ähnliche Ansätze. Die Verfügbarkeit von sensiblen Assays, die Erkennung der restlichen Leukämiezellen (Stem) auf der Grundlage von krankheitsspezifischen oder krankheitsassoziierten Features (abnorme molekulare Marker oder abweichende Immunophenotypes) aktivieren haben drastisch verbesserte MRD-Bewertung in AML. Allerdings sollte angesichts der inhärenten Heterogenität und Komplexität der AML als Krankheit, Methoden zur Probenahme Knochenmark und MRD und LSC Analyse wenn möglich harmonisiert werden. In diesem Manuskript beschreiben wir eine detaillierte Methode für angemessene Knochenmark Aspirat Probenahme, transport, probieren Sie processing für optimale Multi-Color Flow Cytometry Bewertung und gating Strategien zur Beurteilung MRD und LSC in therapeutischen Entscheidungsfindung helfen für AML-Patienten.

In 90 % der AML-Patienten kann mindestens eine LAIP identifiziert werden. Um die genauen Prozentsätze LAIP + Zellen des primitiven Blasten bei der Diagnose zu generieren, die entsprechende Einstellung des Tores Blast ist entscheidend und braucht Kontrolle als in Abbildung 3visualisiert. Ein Beispiel für jeden Patienten eine bestimmte Art von Aberrancy auf die primitiven CD34 + Zellen beherbergen ist in Abbildung 5dargestellt. Zur Messung von MRD bei Follow-Up, die zuvor definierten LAIP + Zellen sind eingezäunt und definiert als Anteil der LAIP + Zellen des WBC. Die Einstellung dieses Tores ist daher entscheidend für die richtige MRD-Ergebnisse zu erzielen. Abbildung 6 zeigt ein Patient, der Rückfall nach MRD positiv (≥ 0,1 %) und Patienten in kompletter Remission bleibt nach dem zweiten Zyklus der Induktions-Therapie.
Das aktuelle Protokoll eignet sich nur Stammzellen im CD34 + Zellen, hinterlegen, da umfassende Charakterisierung von diesem Fach gezeigt hat, dass die CD38-Bevölkerung die potentesten Stammzelle wie Bruchteil birgt. Um die LSC vom HSC innerhalb dieser Fraktion zu trennen, werden weitere Symbole verwendet. Am häufigsten ausgewählten Marker, LSC zu unterscheiden sind CD45RA und der Combi-Kanal beherbergen 6 spezifische LSC-Marker mit PE gekennzeichnet. Basierend auf weitere klinische Auswertungen, ein Abkürzungniveau von ≥ 0,004 % wurde definiert als LSC-positiv und war verbunden mit schlechter überleben bei der Diagnose, während ein Abkürzungniveau von 0,0001 % bei hohen bis10verwendet wurde.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig1.jpg"> Abbildung 1 : Knochenmark Abstrich. (A) gesunden Spendern und (B) AML Patienten (FAB 5 Subtyp). Giemsa Fleck auf 100 X Vergrößerung gezeigt. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig2.jpg"> Abbildung 2 : Verpackungsmaterial für biologische Flüssigkeiten zu korrigieren. Weitere Details zu den Regeln und Vorschriften für den Transport von biologischen Flüssigkeiten finden Sie auf der Webseite15 Zentren für Krankheitskontrolle und Prävention. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig3.jpg"> Abbildung 3 : Strategie für die Definition von Blasten gating. (A) CD45dim, B Gating) Gating CD34 + sprengt.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig4.jpg"> Abbildung 4 : Lymphozyten gating. (A) blauen Zellen sind WBC gezeigt im FSC/SSC Plot B) grüne Zellen sind Lymphozyten gekennzeichnet durch CD45hohe/SSCniedrig, C) Negativität für CD34, (D) Negativität für CD117 und Negativität (E) für CD13, F) die verschiedenen Zelltypen sind Beispiele für eine Übersichtsbaum Bevölkerung. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig5.jpg"> Abbildung 5 : Bei der AML Diagnose LAIP. (A) LAIP basierend auf cross-Linie Aberrancy (CD7 auf CD33 mit dem Ausdruck ihrer Zellen), B) LAIP basierend auf asynchrone Differenzierung (CD11b auf CD13 mit dem Ausdruck ihrer Zellen), (C) LAIP basierend auf Überexpression im Vergleich zu normalen Zellen (CD34sehr hoch auf CD13 mit dem Ausdruck ihrer Zellen), (D). LAIP basierend auf minder im Vergleich zu normalen Zellen (HLA-DRniedrig auf CD33 Ausdruck Zellen). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig6.jpg"> Abbildung 6 : LAIP gefolgt während der Therapie. (A) LAIP Definition bei der Diagnose (CD34 + / CD13 + / CD33-) und Verlust von LAIP während Follow-up bei einem Patienten, der in kontinuierlichen kompletter Remission, (B) LAIP Definition bei der Diagnose blieb (CD117 + / CD7 + / CD33 +) und Persistenz von LAIP während Follow-up bei einem Patienten, der einen Rückfall. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig7.jpg"> Abbildung 7 : Stem Cell gating. (A) Herbeirufung der verschiedenen CD34 + / CD38 Populationen anhand Perlen (CD38niedrig ist unterhalb der oberen Grenze der Perlen, während CD38sehr niedrig sind definiert als die wahren negativen Zellen repräsentieren die LSC und befinden sich unter dem Median der Perlen), (B) zwei Beispiele von Patienten mit Unterscheidung zwischen HSC und LSC bei Follow-up basierend auf CD45RANeg und CD45RApos Ausdruck. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Ergänzende Datei 1. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/Sampling_Form_MRD_1.pdf" target="_blank">Klicken Sie bitte hier zum Downoad Datei.</a>
Ergänzende Datei 2. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/Sampling_Form_MRD_2.pdf" target="_blank">Klicken Sie bitte hier zum Downoad Datei.</a>
Ergänzende Datei 3. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/Supplementary_information_revised_Cloos_et_al_final2018.docx" target="_blank">Klicken Sie bitte hier zum Downoad Datei.</a>

Nachweis von minimal oder messbare Resterkrankung (MRD) ist eine wichtige prognostische Biomarker für die Verfeinerung der Risikobewertung und Vorhersage von Rückfällen bei akuter myeloischer Leukämie (AML). Diese umfassende Leitlinien und Empfehlungen mit best Practices für konsistente und genaue Identifizierung und Nachweis von MRD, können helfen, effektive Entscheidungen für AML-Behandlung.

Umfassendes Protokoll zur Probe und Prozess des Knochenmarks zur Messung von messbaren Resterkrankung und leukämischen Stammzellen in der akuten myeloischen Leukämie

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, eine genaue Untersuchung von Knochenmarkproben von Patienten mit akuter myeloischer Leukämie auf messbare Resterkrankungen durchzuführen, einschließlich der Quantifizierung von Leukämiestammzellen. Diese Methode kann eine genaue Beurteilung der messbaren Resterkrankung in Knochenmarkproben von Patienten mit akuter myeloischer Leukämie liefern. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass eine genaue Befolgung des Protokolls zu hochreproduzierbaren, qualitativ hochwertigen Ergebnissen führt.Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die klinische Entscheidungsfindung, da sie als Ablesung des Ansprechens der Patienten auf die Behandlung verwendet werden kann. Jeroen Janssen, Hämatologe, Gerrit Sijm, Techniker des Labors für diagnostische Hämatologie, und Jennifer Scheick und Sander Snel, Techniker des MRD-Teams, werden die Verfahren vorführen. Wenn sich der Patient in der lateralen Dekubitusposition befindet, wird die hintere Beckenwirbelsäule mit einem Stift markiert und die Haut des vorgesehenen Biopsiebereichs mit 0,5 bis 1 % Chlorhexidin in Ethanol in einer nach außen kreisenden Bewegung nach außen desinfiziert.Nehmen Sie nach der Verabreichung eines Lokalanästhetikums eine 15-Gauge-2,8-Zoll-Nadel mit dem proximalen Ende in der Handfläche und dem Zeigefinger gegen die Seite des Metallschafts der Nadel in der Nähe der Spitze zur Kontrolle. Führen Sie die Nadel mit sanftem, aber festem Druck mit einer schnellen, abwechselnd pronierenden, supinierenden Bewegung durch die anästhesierte Haut in Richtung der Beckenwirbelsäule ein. Wenn die Nadel mit der hinteren Beckenwirbelsäule in Berührung kommt, entfernen Sie die Stilette und befestigen Sie eine leere 10-Milliliter-Spritze an der Nadel.Ziehen Sie den Kolben vorsichtig zurück, um einen Unterdruck in der Spritze zu erzeugen, bis bis zu 10 Milliliter Knochenmarknadeln entnommen wurden. Nehmen Sie nicht mehr als 10 mil Knochenmark pro Aspirat ein, um eine Hämodilution zu vermeiden. Entfernen Sie die Spritze und setzen Sie das Stilette wieder auf die Nadel.Werfen Sie dann etwa zwei Milliliter des Knochenmarks in ein Uhrglas aus und stellen Sie sicher, dass genügend Probe entnommen wird, um in ein mit Heparin beschichtetes Acht-Milliliter-Röhrchen injiziert zu werden, und drehen Sie das Röhrchen sofort um. Um eine Gerinnung zu verhindern, ist es wichtig, das gerinnungshemmende Röhrchen zu investieren, sobald das Knochenmark zugesetzt wird. Für eine optimale morphologische Beurteilung übertragen Sie mit einem Kunststoffspatel die Spikulen aus dem Aspirat im Uhrglas auf einen Objektträger und schieben Sie vorsichtig einen weiteren Objektträger über das Mark.Nach dem Trocknen färben Sie die Spikulen mit May-Grunwald Giemsa für die lichtmikroskopische Analyse. Legen Sie das Knochenmarkröhrchen in einen Kunststoffhalter und legen Sie den Halter in einen Kunststoffbehälter mit einer Umgebungsgelpackung und einem ausgefüllten Antragsformular. Bevor Sie das Knochenmark mittels Durchflusszytometrie analysieren, starten Sie das Durchflusszytometer und öffnen Sie die Durchflusszytometrie-Analysesoftware, um ein neues Experiment mit einem Vorwärtsstreu- und einem Seitenstreupunktdiagramm zu erstellen.Um die Größe und Granularität der Zellen zu beurteilen, laden Sie unmarkierte lysierte periphere Blutzellen von einem gesunden Spender und wählen Sie die Funktion Zellen erwerben. Gatet die Lymphozyten und passen Sie die Vorwärts- und Seitenstreuspannungen an, um die entsprechenden mittleren Zielwerte für die Gated-Zellpopulation zu erreichen. Rufen Sie dann Daten für mindestens 10.000 Ereignisse ab.Um die Photomultiplier-Röhrenspannungen des Ziel-Floreszenzkanals einzurichten, verwenden Sie zunächst Regenbogenperlen-Kalibrierungspartikel mit acht Spitzen gemäß den Anweisungen des Herstellers, um 10.000 Ereignisse mit einer niedrigen Durchflussrate zu erfassen. Gate der Singulett-Perlen im Scatter-Dot-Plot "Forward versus Side", gefolgt von einem Gating des 7. Peaks im FITC-PE-Dot-Plot. Gate die resultierenden Kügelchenpopulationen für jedes Fluorophor.Setzen Sie die Erfassung der Regenbogenperlensuspension mit acht Peaks fort und passen Sie die PMT-Spannungen in allen Fluoreszenzkanälen an, um die MFI-Zielwerte gemäß den Anweisungen des Herstellers zu erreichen. Verwenden Sie Aufzeichnen, um Daten von etwa 2.000 Ereignissen zu sammeln, und überprüfen Sie den MFI auf die 7. Spitzenperle. Als nächstes fügen Sie ein ausreichendes Volumen jedes experimentellen Fluorochrom-konjugierten Antikörpers hinzu, um die Kügelchen in den entsprechenden Floreszenzröhrchen abzüglich einer Kontrolle zu färben und die Röhrchen gründlich zu wirbeln.Erstellen Sie ein neues leeres Experiment mit denselben Kompensationsparametern, wobei Sie darauf achten, dass der Schwellenwert für die Vorwärtsstreuung auf 5.000 festgelegt ist und die Kompensationswerte aller Fluorochrome null sind. Um die Kompensationsregler zu erstellen, wählen Sie die Funktion Kompensationssteuerung erstellen und laden Sie das nicht gefärbte Regelrohr. Passen Sie das P1-Gate an die Singulett-Bead-Population an, und vergewissern Sie sich, dass das P1-Gate nur Singulett-Beads enthält.Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das P1-Gate und wählen Sie Auf alle Kompensationssteuerelemente anwenden. Zeichnen Sie dann die Daten für alle einzeln markierten Fluoreszenzröhren auf und bestätigen, dass das P2-Gate die positive Population in jedem Floreszenzhistogramm umfasst. Um die Zellen für die durchflusszytometrische Analyse zu färben, transportieren Sie das Knochenmark ins Labor, überprüfen Sie das Antragsformular, um die Studiennummer und das Geburtsdatum des Patienten zu überprüfen, und bestimmen Sie, was gefärbt werden muss.Für die MRD verwenden wir eine Färbeplatte, die aus vier Röhrchen besteht. Hier zeigen wir die Färbung der LSC-Platte, die aus einem Rohr besteht. Übertragen Sie nach der Zellzählung das entsprechende Volumen des Knochenmarks in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen.Fügen Sie Lysepuffer mit dem 10-fachen des experimentellen Zellvolumens hinzu, um die roten Blutkörperchen zu lysieren. Drehen Sie das Röhrchen um, um die Zellen zu mischen und 10 Minuten bei Raumtemperatur zu inkubieren. Am Ende der Lysephase pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation.Resuspendieren Sie die Zellen in 15 Millilitern Waschpuffer bei Raumtemperatur und ernten Sie das Zellpellet erneut durch Zentrifugation. In der Zwischenzeit pipettieren Sie die entsprechende Menge der Antikörper-Cocktail-Lösung in Fünf-Milliliter-FACS-Röhrchen. Hier ist das Panel für das Stammzellröhrchen zu sehen.Resuspendieren Sie das Pellet in Waschpuffer und geben Sie die Suspension der Zelle in das FACS-Röhrchen mit der monoklonalen Antikörper-Cocktaillösung für eine 15-minütige Inkubation im Dunkeln. Waschen Sie dann die Zellen in Waschpuffer und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation. Nach der Zentrifugation resuspendieren Sie das Pellet in 400 Mikrolitern frischem Waschpuffer.Um die leukämischen Stammzellen zu analysieren, fügen Sie der Zellsuspension, die mit dem Stammzell-Antikörper-Cocktail gefärbt ist, vier Mikroliter blanke Kügelchen hinzu. Lesen Sie dann die Proben mit den zuvor eingestellten Parametern ab und erfassen Sie mindestens viermal 10 bis zum 6. Ereignis aus den experimentellen Patientenproben. Um den Leukämie-assoziierten Immunphänotyp zu identifizieren, der bei etwa 90 % der Patienten mit akuter myeloischer Leukämie beobachtet wird, ist es entscheidend, dass die Blast-Gates wie dargestellt richtig gesetzt werden.Hier werden Beispiele für Daten von einzelnen Patienten gezeigt, die unterschiedliche Arten von Aberrantik auf den CD34-positiven primitiven Zellen aufweisen. In diesen Diagrammen sind ein Patient zu beobachten, der sich in vollständiger Remission befindet, und ein Patient, der nach dem zweiten Zyklus der Induktionstherapie messbare positive Ergebnisse bei der Resterkrankung erlitten hat, was die Notwendigkeit einer genauen Gate-Einstellung vor der Probenanalyse unterstreicht. Die Identifizierung und Quantifizierung von LSC erfordert eine zusätzliche Analyse von Aberranten, die speziell auf CD34-positiven CD38-negativen Blastenzellen zu finden sind, wie in diesen Grafiken dargestellt.Bei der Durchführung dieses Protokolls ist es sehr wichtig, spezialisiertes und unterstützendes Personal für die Knochenmarkentnahme, den Transport, die experimentelle Arbeit und die Analyseschritte dieses Verfahrens zu haben. Dieses Verfahren kann auch zur Durchführung zytogenetischer und molekularer Analysen verwendet werden, um zusätzliche Fragen zur Korrelation zwischen spezifischen Zellpopulationen und molekularen Anomalien von Interesse zu beantworten oder um die Risikogruppe eines Patienten für die Vorhersage des klinischen Ergebnisses zu verfeinern. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Hämatologie, um die Resterkrankung von AML-Patienten nach der Behandlung zu erforschen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie wir Resterkrankungen mithilfe der Durchflusszytometrie genau identifizieren und quantifizieren, einschließlich der Entnahme und des Transports von Knochenmarkproben von AML-Patienten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Dieses Video beschreibt die Technik der Absaugung von Knochenmark aus der Beckenwirbelsäule und die Vorbereitung des Abstrichs für die Biopsie. In diesem Beispiel führen wir eine Knochenmarkaspiration bei einem Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) durch und untersuchen die Zellen auf eine messbare Resterkrankung (MRD), einen wichtigen prognostischen Biomarker.

Knochenmarkaspiration: Eine Methode zur Gewinnung von Knochenmark zur Untersuchung der Zellmorphologie

Wir skizzieren ein Protokoll zur gleichzeitigen Ausdruck der Leukämie Stammzell-Marker auf primäre akute myeloische Leukämie-Zellen durch Durchflusszytometrie zu erkennen. Wir zeigen, wie Sie drei Vorläuferzellen Populationen und eine vermeintliche LSC Bevölkerung mit zunehmendem Grad der Reifung zu quantifizieren. Wir bestätigte das Vorhandensein dieser Populationen in entsprechenden Patienten-abgeleitet-Xenotransplantate.

Flow Cytometry um Leukämie-Stammzellen in primäre akute myeloische Leukämie und Patienten-abgeleitet-Xenotransplantate bei Diagnose und folgen bis zu schätzen

Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Isolierung und Charakterisierung von Knochenmark-Mikroumgebungspopulationen aus murinen Modellen myelodysplastischer Syndrome und akuter myeloischer Leukämie vorgestellt. Mit dieser Technik werden Veränderungen in der nicht-hämatopoetischen Knochenmarknische, einschließlich der endothelialen und mesenchymalen Stromazellen, mit Fortschreiten der Erkrankung identifiziert.

Identifizierung von Knochenmark-Mikroumgebungspopulationen beim myelodysplastischen Syndrom und der akuten myeloischen Leukämie

Hier wird eine auf Phosphoflow-Zytometrie basierende Methode zur Analyse der Signalwege stromabwärts der mTORC1-, JAK/STAT5- und MAPK-Signalwege in akuten humanen myeloischen Leukämiezellen beschrieben, die in Mäuse xenotransplantiert und aus Knochenmarkaspiraten gewonnen wurden. Die Werte von p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 und p-ERK1/2 werden gleichzeitig mit einem spektralen Durchflusszytometer der nächsten Generation mit hoher Empfindlichkeit gemessen.

Intrazelluläre Phosphoflow-Zytometrie von Xenotransplantaten bei akuter myeloischer Leukämie

Das Protokoll zielt darauf ab, ein Mausmodell zur Erzeugung von Schüben akuter lymphatischer Leukämie zu beschreiben, basierend auf der Dynamik des Ansprechens auf eine Induktionschemotherapie.

Mausmodell des Leukämie-Rezidivs zur Induktionschemotherapie bei akuter lymphatischer Leukämie

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren für die schnelle Verarbeitung von post-mortem diffuse intrinsische Ponsgliom Proben für die Einrichtung von Patienten stammenden Zellkulturmodellen oder direkte Charakterisierung von Tumor und Mikroumgebungs Zellen.

Ein Protokoll für schnelle Post-mortem-Zellkultur von Diffuse Intrinsic Ponsgliom (DIPG)

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von zentrifugalen Sammelnetzwerk primäre akute lymphoblastische Leukämie-Zellen in verschiedenen Zellzyklus Phasen aufteilen.

Vorbereitung der primäre akute lymphoblastische Leukämie-Zellen in verschiedenen Zellzyklus Phasen durch zentrifugale Sammelnetzwerk

Dieses Protokoll beschreibt einen umgekehrte vertikale Invasion-Assay, der verwendet werden könnten, um die Migration und Invasion Funktionen von Zellen in einer dreidimensionalen Umgebung unter Beibehaltung der Zelle Mikroumgebung zu quantifizieren. Dieser Test eignet sich für seltene und/oder empfindliche Zellen.

Nach oben bewegen: Eine einfache und Flexible In-vitro- dreidimensionale Invasion Assay Protokoll

Die Ex-vivo-Kultur von Knochenexplanten kann ein wertvolles Werkzeug für die Erforschung der Knochenphysiologie und die mögliche Bewertung von Medikamenten bei Knochenremodellierung und Knochenerkrankungen sein. Das vorgestellte Protokoll beschreibt die Vorbereitung und Kultur von Calvarias, die aus neugeborenen Mäuseschädeln isoliert sind, sowie deren Anwendungen.

Messung der Knochenumgestaltung und Nachbildung der Tumor-Knochen-Mikroumgebung mit Calvaria-Kokultur und Histomorphometrie

Wir beschreiben eine Methode zur Verwendung von Multiparameter-Durchflusszytometrie zum Nachweis von mitochondrialen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in murinen gesunden hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) und Leukämiezellen aus einem Mausmodell akuter myeloischer Leukämie (AML), das von MLL-AF9.

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Lernen Sie ein standardisiertes Protokoll zur Knochenmarkaspiration und Durchflusszytometrie für die MRD-Detektion bei akuter myeloischer Leukämie. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Quantifizierung leukämischer Stammzellen.

Umfassendes Protokoll zur Probe und Prozess des Knochenmarks zur Messung von messbaren Resterkrankung und leukämischen Stammzellen in der akuten myeloischen Leukämie (Video) | JoVE Journal

Umfassendes Protokoll zur Probe und Prozess des Knochenmarks zur Messung von messbaren Resterkrankung und leukämischen Stammzellen in der akuten myeloischen Leukämie

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