Whole-Cell Ströme induziert durch Blätterteig Anwendung von GABA im Gehirnscheiben

Das übergeordnete Ziel dieser Puff-Technik ist es, die pharmakologische Verabreichung im Ganzzell-Patch-Clamp-Recording durchzuführen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Elektrophysiologie zu beantworten, wie z. B. die pharmakologische Verabreichung. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Wirkstoffkonzentration um die Aufnahmestelle herum schnell ansteigt und so eine Desensibilisierung der Membranrezeptoren verhindert wird.

Im Allgemeinen werden Einzelpersonen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da die Vorbereitung der akuten präfrontalen Kortexscheibe und die Position der Puff-Mikropipette relativ schwierig sind. Um diesen Vorgang zu starten, zerkleinern Sie die gefrorene Schneidlösung, um einen Matsch zu erhalten. Halten Sie die matschige Lösung auf Eis und sprudeln Sie sie mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid.

Legen Sie dann den präparierten Kopf in ein mit eiskalter Schneidlösung gefülltes Becherglas und nehmen Sie ihn nach einigen Sekunden heraus. Schneiden Sie den Schädel entlang der Mittellinie in kaudal-rostraler Richtung mit einer feinen Schere ein und entfernen Sie die seitlichen Schädelanteile. Entfernen Sie dann das Gehirn mit einem feinen Spatel und lassen Sie es in die eiskalte Schneidlösung fallen.

Legen Sie anschließend das Gehirn auf den Deckel einer neun Zentimeter großen, mit Eis gefüllten Petrischale. Spülen Sie das Gehirn mit eiskalter Schneidlösung ab. Schneide dann das Kleinhirn und den Riechkolben mit einer Rasierklinge ab.

Tragen Sie anschließend Cyanacrylatkleber auf den Vibratome-Probenhalter auf. Legen Sie den Hirnblock vorsichtig mit der rostralen Seite nach oben auf den Leimtropfen und tauchen Sie ihn sofort in die eiskalte Schneidlösung. Stellen Sie den Klingenhalter in einem Winkel von 15 Grad in Bezug auf die horizontale Ebene ein.

Teilen Sie das Gehirngewebe in 350 Mikrometer große koronale Scheiben. Übertragen Sie dann die Objektträger in die mit ACSF gefüllte Auffangkammer und inkubieren Sie sie eine Stunde lang mit konstantem Blubbern von 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid. In unserem Experiment ist auch die Vorbereitung des akuten präfrontalen Kortexschnitts entscheidend für den Eingriff.

Ein gesunder Gehirnschnitt bedeutet aktive Neuronen, die fest geflickt werden können. Bei diesem Verfahren werden Borosilikat-Mikropipetten aus Glas hergestellt, die als Aufzeichnungselektroden oder Puff-Mikropipetten verwendet werden können. Für die Aufzeichnung von Elektroden liegen die Spitzenwiderstände im Bereich von vier bis sechs Megaohm, während Puff-Mikropipetten Spitzendurchmesser im Bereich von zwei bis fünf Mikrometern haben.

Geben Sie einen Sodionskanalblocker zu ACSF, um schnelle Dionenkanäle und damit Aktionspotentiale zu blockieren, und halten Sie eine konstante Durchflussrate dieser Lösung von zwei bis drei Millilitern pro Minute in der Aufnahmekammer aufrecht. Blasen Sie den ACSF ständig mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid, um die Lebensfähigkeit der Scheiben zu gewährleisten. Übertragen Sie eine Gehirnscheibe mit einer Pasteur-Pipette, deren feine Spitze auf die Größe der Scheibe zugeschnitten ist, in die Aufnahmekammer.

Platzieren Sie als Nächstes einen Platin-Scheibenanker über der Scheibe, um sie auf der Plattform zu halten. Füllen Sie danach die Aufzeichnungsmikropipetten mit interner Lösung und füllen Sie die Puff-Mikropipetten mit GABA bei 10 Mikromolaren, 50 Mikromolaren und 100 Mikromolaren oder ACSF als Vehikelkontrolle. Um eine Verstopfung durch Schmutz zu vermeiden, üben Sie mit einer Ein-Milliliter-Spritze einen leichten Überdruck aus, bevor Sie die Aufzeichnungselektrode in den ACSF eintauchen.

Positionieren Sie die Aufzeichnungselektrode und die Puff-Mikropipette unter einem Mikroskop so, dass die Spitzen in der Mitte des Monitors erscheinen. Identifizieren Sie dann ein Zielneuron. Passen Sie den Mikroskopfokus an, während Sie die Puff-Mikropipette allmählich absenken, und platzieren Sie sie in einem Winkel von 45 Grad über dem Aufnahmeneuron.

Halten Sie den Abstand zwischen der Spitze der Puff-Mikropipette und dem Zielneuron im Bereich von 20 bis 40 Mikrometern. Nähern Sie sich langsam und vorsichtig mit der Aufzeichnungselektrode dem Neuron und lassen Sie dann den Überdruck los. Üben Sie einen schwachen und kurzen Sog durch den Schlauch aus, der mit dem Elektrodenhalter verbunden ist, um eine Gigaohm-Abdichtung zu erzeugen.

Halten Sie die Spannung bei null Millivolt. Nach der Bildung der Gigaohm-Dichtung kompensieren Sie die schnelle und langsame Kapazität manuell oder automatisch. Üben Sie dann einen kurzen und starken Sog durch den Schlauch aus, um in den Ganzzellenmodus zu wechseln.

Anschließend werden die evozierten IPSC-Ströme im Voltage-Clamp-Modus aufgezeichnet. Geben Sie einzelne oder gepaarte GABA-Züge über die Puff-Mikropipette ab, die von einem Master-8-Spannungsstufengenerator gesteuert wird. Ändern Sie die Zugdauer, um die besten Ergebnisse für evozierte IPSC-Ströme zu erhalten, und messen Sie die evozierten IPSC-Ströme im LPS-induzierten Depressionsmodell.

Hier sind die Beispiel-IPSCs dargestellt, die durch 10, 50 und 100 mikromolare GABA induziert wurden. Und hier sind die Reaktionskurven der Puffdauer. Hier sind die repetitiven Ströme dargestellt, die GABA bei 50 mikromolaren Zügen in Abständen von einem, zwei oder drei Sekunden hervorruft.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, gesunde Gehirnschnitte zu erhalten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der pharmakologischen Verabreichung, um die Wirkung von Arzneimitteln in der Elektrophysiologie zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die pharmakologische Verabreichung bei der Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung durchgeführt wird. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit TTX extrem gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. das Tragen von Handschuhen.