Name: Whole-Cell Ströme induziert durch Blätterteig Anwendung von GABA im Gehirnscheiben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Erfahren Sie die Puff-Technik für die pharmakologische Verabreichung bei Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen im präfrontalen Kortex. Diese Methode ermöglicht eine schnelle Arzneimittelkonzentration und verhindert Rezeptor-Desensibilisierung.

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Die Autoren möchten die folgenden Organisationen danken: National Natural Science Foundation of China (31171018, 31171355), der Wissenschaft und Technik Abteilung Guangdong (2013KJCX0054), der naturwissenschaftlichen Grundlage der Provinz Guangdong ( 2014A030313418, 2014A030313440), Guangzhou Wissenschaft und Technologie Bureau (201607010320).

Tierhaltung und alle Tierarten, die Experimente wurden nach Verfahren genehmigt von der Ethikkommission für Tierversuche an South China Normal University, nach den Richtlinien für Animal Care vom National Institute of Gesundheit.
 1. Vorbereitung der Lösungen <ol><li>bereiten 500 mL standard künstliche Liquor cerebrospinalis (ACFS) mit den Komponenten in unseren veröffentlichten Werk 7 beschrieben, wie in Tabelle 1 aufgeführt.
	<ol><li>Verwendung sauberes Glas Becher mit entionisiertem Wasser, eine frische ACFS Lösung vorzubereiten. Spachteln mit entionisiertem Wasser reinigen und trocknen, bevor Sie mit NaCl, KCl, NaH hinzufügen 2 PO 4, Nahco3 3, MgSO 4, D-Glucose, und fügen Sie das CaCl 2 nach haben sprudelte die Lösung mit 95 % O 2 / 5 % CO 2 Mischung für ~ 20 min (wie in Tabelle 1) bis 500 mL entionisiertem Wasser. Rühren, bis Sie vollständig aufgelöst.</li>
		<li>Stellen Sie sicher der ACFS völlig ist klar, ohne jede Niederschlag. Dann stellen Sie den pH-Wert auf 7.2-7.4. Blase mit einem Gasgemisch bestehend aus 95 % O 2 und 5 % CO 2 für ~ 20 min.</li>
	</ol></li> <li>250 mL Slice Cutting-Lösung mit den Chemikalien 7 in Tabelle 2 beschrieben vorbereiten.
	<ol><li>KCl, MgCl 2, NaH 2 PO 4, Nahco3 3, Choline·Cl, D-Glucose hinzufügen und fügen Sie das CaCl 2 zuletzt gemäß 1.1.1 bis 250 mL entionisiertem Wasser und auflösen wie in 1.1.1 und 1.1.2 beschrieben.</li>
		<li>Nach sprudeln mit 95 % O 2 / 5 % CO 2, stellen die Lösung in eine Tiefkühltruhe für 15-20 min, so dass die Cutting-Lösung wird eiskalt und teilweise gefrorenen. 
		Hinweis: Wir verwenden diese Cutting-Lösung bei der Scheiben von 1-2 Monate-alten Mäusen; die Formel für Mäuse, die älter als 2 Monate abweichen.</li>
		<li>Bereiten LPS Lösung durch Auflösen in sterilen Endotoxin-freie isotonische Kochsalzlösung (0,9 % NaCl). LPS ist intraperitoneal verabreicht (0,5 mg/kg) und mit der Aufnahme 2 h später.</li>
	</ol></li></ol> 2. Vorbereitung des präfrontalen Cortex Slice <ol><li>Cutting-Lösung aus dem Gefrierschrank nehmen und homogenisieren um ein Matsch zu erhalten. Legen Sie die Lösung auf dem Eis und Blase ständig mit 95 % O 2 / 5 % CO 2.</li>
	<li>Mit großen, scharfen Schere, schnell eine Maus als beschriebenen 9 enthaupten und sofort legte den Kopf in ein Becherglas gefüllt mit eiskalten (0-4 ° C) Schneidlösung.</li>
	<li>Schneiden Sie die Spitze des Schädels entlang der Mittellinie in Richtung kaudalen Nasal mit einer feinen Schere und die seitlichen Schädel Teile zu entfernen. Entfernen Sie das Gehirn mit einem feinen Spachtel und Drop ins eiskalte Schneidlösung. 
	Hinweis: Schritte 2.2-2.3 erfolgen schnell (im Idealfall &#60; 1 min).</li>
	<li>Legen Sie das Gehirn auf den Deckel einer 9 cm Petrischale mit Eis gefüllt. Spülen Sie das Gehirn mit eiskalten Schneidlösung. Das Kleinhirn und der Riechkolben mit einer Rasierklinge abgeschnitten.</li>
	<li>Anwenden Cyanacrylat-Klebstoff auf die Probe Inhaber einer Vibratome. Legen Sie vorsichtig den Gehirn-Block auf den Tropfen Klebstoff, rostral Seite nach oben, und sofort eintauchen in eiskaltes Schneidlösung.</li>
	<li>Einstellen den Klingenhalter Vibratome in einem Winkel von 15° mit Bezug auf die horizontale Ebene und bereiten 350 µm koronalen Gehirnscheiben (Klinge Schwingungsfrequenz = 85 Hz, Geschwindigkeit = 0,1 mm/s).</li>
	<li>Mit einer Pipette, die Scheiben in die Erholung-Kammer voller ACFS, Transfer inkubieren 1 h (bei RT) mit konstanten sprudeln von 95 % O 2 / 5 % CO 2.</li>
</ol> 3. Ganze Zelle Patch Aufnahme <ol><li>machen Glas Borosilikat Mikropipetten für als Aufnahme Elektroden verwenden oder Blätterteig Mikropipetten nach den vorgegebenen Richtlinien der Puller-Betriebsanleitung. Für die Aufzeichnung von Elektroden, Tipp Widerstände sind im Bereich von 4-6 M &#8486;, während Blätterteig Mikropipetten Spitze Durchmesser im Bereich von 2 bis 5 µm haben.</li>
	<li>Na +-Kanal-Blocker (TTX, 1 µM), Block schnell Na + Kanal und damit Aktionspotentiale zu ACFS hinzufügen und Verwalten von konstantem Volumenstrom dieser Lösung von 2-3 mL/min in der Kammer Aufnahme durch peristaltische Pumpe in die Kammer und streben aus ihm heraus. Blase der ACFS mit 95 % O 2 / 5 % CO 2 ständig um die Lebensfähigkeit der Scheiben gewährleisten.</li>
	<li>Übertragen eine Gehirn-Scheibe in der Aufnahme-Kammer mit einer modifizierten Pasteurpipette deren feiner Spitze geschnitten wurde, um die Scheibe Größe passen. Decken Sie die Scheibe mit einem Platin Slice-Anker mit parallel Nylonfäden Abstand &#8805; 2 mm auseinander, die Scheibe auf der Plattform zu halten.</li>
	<li>Füllen Sie die Aufnahme Mikropipette mit internen Lösung 7 (Tabelle 3), und füllen Sie die Blätterteig Mikropipetten mit GABA bei 10 µM, 50 µM und 100 µM (aufgelöst in ACFS) oder ACFS als Fahrzeugkontrolle.</li>
	<li>Gegen Verstopfung mit Schutt, üben Sie leichten positive Druck mit eine 1 mL Spritze vor die Aufnahme Elektrode in der ACFS eintauchen. Mit einem Mikromanipulator unter dem Mikroskop (4 X Objektiv), die Aufnahme Elektrode und Blätterteig Mikropipette so positionieren, dass die Spitzen in der Mitte des video-Bildes auf dem Monitor ( Abbildung 1 A) erscheinen.</li>
	<li>Stellen Sie den Mikroskop-Fokus (40 X Objektiv) schrittweise Senkung der Blätterteig Mikropipette und legen Sie es über das Neuron Aufnahmen in einem Winkel von 45°. Halten Sie den Abstand zwischen der Spitze des Blätterteig Mikropipette und das Neuron, aufgenommen zwischen 20-40 µm ( Abbildung 1 B). Nähern Sie langsam und vorsichtig das Neuron mit der Aufnahme-Elektrode und lassen Sie dann den positiven-Luftdruck. Eine schwache und kurze Absaugung durch den Schlauch angeschlossen, der Elektrodenhalter erstelle ich ein Giga-Ohm-Siegel bewerben.</li>
	<li>Pflegen die Spannung auf 0 mV. Nach Bildung der Giga-Ohm-Dichtung schnell kompensieren Sie und verlangsamen Sie Kapazität zu, manuell oder automatisch. Dann bewerben Sie sich eine kurze und starke Absaugung durch die Schläuche erwähnt, um in den gesamten Zelle Modus bekommen.</li>
	<li>Datensatz eIPSC in Voltage-Clamp-Modus. Die Blätterteig-Mikropipette mit einer Picospritzer durch einen Master 8 Schritt Generatorspannung gesteuert, einzeln oder paarweise GABA Puffs ( Abbildung 2) liefern niedrigen Gasdruck (Stickstoff, 4-6 Psi) zuweisen.</li>
	<li>Ändern die Blätterteig-Dauer um das beste eIPSC erzielen ( Abbildung 3) und Messen Sie die eIPSC in die LPS-induzierte Depression-Modell ( Abbildung 4).</li>
</ol>

<ol><li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.</a> Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).</li>
<li>Sakmann, B., Edwards, F., Konnerth, A., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+used+for+studying+synaptic+transmission+in+slices+of+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Q+J+Exp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques used for studying synaptic transmission in slices of mammalian brain.</a> Q J Exp Physiol. 74 (7), 1107-1118 (1989).</li>
<li>Eyo, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+hyperactivity+recruits+microglial+processes+via+neuronal+NMDA+receptors+and+microglial+P2Y12+receptors+after+status+epilepticus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus.</a> J Neurosci. 34 (32), 10528-10540 (2014).</li>
<li>Dickinson, G. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+determining+the+recruitment+of+inositol+trisphosphate+receptor+channels+during+calcium+puffs%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Factors determining the recruitment of inositol trisphosphate receptor channels during calcium puffs.</a> Biophys J. 105 (11), 2474-2484 (2013).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Columnar+distribution+of+activity+dependent+gabaergic+depolarization+in+sensorimotor+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Columnar distribution of activity dependent gabaergic depolarization in sensorimotor cortical neurons.</a> Mol Brain. 5, 33(2012).</li>
<li>Glykys, J., Mody, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+main+source+of+ambient+GABA+responsible+for+tonic+inhibition+in+the+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The main source of ambient GABA responsible for tonic inhibition in the mouse hippocampus.</a> J Physiol. 582, (Pt 3) 1163-1178 (2007).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APP+modulates+KCC2+expression+and+function+in+hippocampal+GABAergic+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">APP modulates KCC2 expression and function in hippocampal GABAergic inhibition.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Dunn, A. J., Swiergiel, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+interleukin-1+and+endotoxin+in+the+forced+swim+and+tail+suspension+tests+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Biochem+Behav%22%5BJournal%5D)">Effects of interleukin-1 and endotoxin in the forced swim and tail suspension tests in mice.</a> Pharmacol Biochem Behav. 81 (3), 688-693 (2005).</li>
<li>Engel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+Patch-clamp+Recordings+from+the+Somatodendritic+Domain+of+Nigral+Dopamine+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li>
<li>Wondolowski, J., Frerking, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit-dependent+postsynaptic+expression+of+kainate+receptors+on+hippocampal+interneurons+in+area+CA1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Subunit-dependent postsynaptic expression of kainate receptors on hippocampal interneurons in area CA1.</a> J Neurosci. 29 (2), 563-574 (2009).</li>
<li>Yang, L., Wang, Z., Wang, B., Justice, N. J., Zheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+precursor+protein+regulates+Cav1.2+L-type+calcium+channel+levels+and+function+to+influence+GABAergic+short-term+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Amyloid precursor protein regulates Cav1.2 L-type calcium channel levels and function to influence GABAergic short-term plasticity.</a> J Neurosci. 29 (50), 15660-15668 (2009).</li>
<li>Huo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+Cortical+GABAergic+Dysfunction+Contributes+to+Aberrant+UP-State+Duration+in+APP+Knockout+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Prefrontal Cortical GABAergic Dysfunction Contributes to Aberrant UP-State Duration in APP Knockout Mice.</a> Cereb Cortex. , (2016).</li>
<li>Zhou, W. L., Gao, X. B., Picciotto, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholine+Acts+through+Nicotinic+Receptors+to+Enhance+the+Firing+Rate+of+a+Subset+of+Hypocretin+Neurons+in+the+Mouse+Hypothalamus+through+Distinct+Presynaptic+and+Postsynaptic+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Acetylcholine Acts through Nicotinic Receptors to Enhance the Firing Rate of a Subset of Hypocretin Neurons in the Mouse Hypothalamus through Distinct Presynaptic and Postsynaptic Mechanisms.</a> eNeuro. 2 (1), (2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Blätterteig-Anwendung ist weit verbreitet, postsynaptischen Rezeptor-Funktion3,4,7zu bewerten, sondern erfordert eine präzise Steuerung in jedem Experiment. Wir beschreiben hier ein Verfahrens unter Beteiligung ganz-Zell-Patch zu spannen, was beweist, dass GABA-Blätterteig IPSCs (z.B. eIPSCs) im präfrontalen kortikalen Gehirnscheiben induziert. Der Widerstand der Elektrode Aufnahme beträgt ca. 5 MΩ, während der Kopfkreis des Blä...

Die Patch-Clamp-Technik, ein wichtiges Werkzeug für die Untersuchung von elektrischen Signale in Neuronen, wurde in den 1970er Jahren1,2entwickelt. Ein großer Vorteil dieser Technik ist, dass sie wissen wie bestimmte Behandlungen bietet (z. B. pharmakologische) neuronale Funktionen oder Kanäle in Echtzeit3verändern kann. Pharmakologische Bewertung der neuronalen Funktion während der gesamten-Zelle in einer Gehirn-Scheibe Aufzeichnung erfordert die Anwendung von Medikamenten, wie z. B. Agonisten oder Antagonisten von spezifischen Rezeptoren, die Neuronen aufgenommen wird. Diese Methode ermöglicht die Identifikation von neuronalen Veränderungen, die auftreten, nach der Anwendung eines bestimmten Medikaments, führt zu einem besseren Verständnis der physiologischen und pathologischen Eigenschaften der Neuronen-4. Obwohl pharmakologische Verwaltung über entweder Perfusion5 oder Blätterteig6durchgeführt werden kann, ist letzteres die überlegene Technik. Insbesondere: (i) Blätterteig Anwendung rasch erhöht Medikament Konzentration um das aufgezeichnete Neuron auf ein Niveau, so dass Desensibilisierung der Membranrezeptoren verhindert wird; (Ii) das Volumen der Droge aufgeblasen ist äußerst gering, so dass es kaum Auswirkungen auf die Bad-Lösung, die daher Nebenwirkungen der verabreichten Chemikalien auf Gehirnscheiben reduziert; (Iii) das Blätterteig-Protokoll kann eingestellt und gespeichert, so dass das Experiment sehr genau reproduzierbar; (iv) Blätterteig Anwendung steht für sparsamen Umgang mit Agonisten/Antagonisten, besonders wo solche Reagenzien sind teuer oder schwer zu erlangen.
Hier konzentrieren wir uns auf die ganze Zelle Ströme induziert durch schnaufend GABA in akut bereit Gehirnscheiben, ein Präparat, das hat den Vorteil, relativ gut erhaltene Hirnschaltkreisen Aufnahme. Wie führen wir Blätterteig-induzierte hemmenden Strömungen7 werden in diesem Artikel beschrieben werden. Mithilfe von Cäsium (Cs+)-interne Lösungen, und halten die Neuronen bei 0 mV, präsentieren wir GABA-Blätterteig hervorgerufen inhibitorischen postsynaptischen Ströme (eIPSCs) mit entsprechenden technischen Details. Mit einem Maus-Modell der Depression induziert durch Lipopolysaccharid (LPS) Injektion8, wir zeigen, dass die eIPSC ist Amplitude, hervorgerufen durch einen GABA-Zug in Scheiben von LPS injiziert Mäusen im Vergleich zu Kontrollen Fahrzeug deutlich reduziert. Unsere Absicht ist, dass dieser Artikel zeigen sollte, wie die Blätterteig-Technik ist überall anwendbar, Studien zur Bewertung der Wirkung von Chemikalien, Verbindungen oder Drogen auf neuronalen Aktivitäten im Gehirnscheiben.

<table><tbody><tr><td>Glas Borosilikat-Mikropipetten</td><td>Shutter Instruments</td><td>BF150-86-10</td><td>1,50 mm Außendurchmesser; 0,86 mm Innendurchmesser</td></tr><tr><td>Mikropipette Puller</td><td>Shutter Instruments</td><td>MODELL P-97&nbsp;</td><td>Flaming/Brow Mikropipetten-Abzieher</td></tr><tr><td>Mikromanipulatoren</td><td>Shutter Instruments</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Computergesteuerter Verstärker&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Digitales Erfassungssystem&nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Imaging-Kamera</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>2115001</td><td>Prüfgeräte</td></tr><tr><td>Mikroskopie&nbsp;</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>Eclipse FN1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Master 8</td><td>A.M.P.I.</td><td>Master-8 Pulsstimulator</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome Slicer</td><td>Leica</td><td>VT 1000S</td><td></td></tr><tr><td>Rasierklinge</td><td>Gillette</td><td>74-S</td><td>FLYING EAGLE</td></tr><tr><td>Videomonitor</td><td>Panasonic</td><td>WV-BM 1410</td><td></td></tr><tr><td>502 Glue</td><td>Deli</td><td>7146</td><td>Cyanacrylat-Kleber</td></tr><tr><td>Schlauchpumpe</td><td>Shanghai JIA PENG Corporation</td><td>BT100-1F</td><td></td></tr><tr><td>Videokamera</td><td>Olympus America Medical</td><td>OLY-150</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Pipets</td><td>Biologix</td><td>30-0138A1</td><td></td></tr></tbody></table>

whole-cell ströme induziert durch blätterteig anwendung von gaba im gehirnscheiben

Whole-cell Currents Induced by Puff Application of GABA in Brain Slices

Pharmakologische Verwaltung wird häufig verwendet, wenn Sie ganze Zelle Patch-Clamp in Hirnschnitten Aufnahme durchführen. Eine der besten Methoden der Zulassungsantrag bei der elektrophysiologischen Aufnahme ist der Blätterteig-Technik, die verwendet werden kann, um die Wirkung der pharmakologischen Reagenzien auf neuronalen Aktivitäten im Gehirnscheiben zu studieren. Der größte Vorteil der Blätterteig-Anwendung ist, dass die Wirkstoffkonzentration rund um den Ort der Aufnahme schnell erhöht und verhindert so die Desensibilisierung von Membranrezeptoren. Erfolgreichen Einsatz von Blätterteig Anwendung beinhaltet besondere Aufmerksamkeit auf die folgenden Elemente: die Konzentration des Medikaments, die Parameter der Blätterteig Mikropipette, der Abstand zwischen der Spitze des einen Blätterteig Mikropipette und das Neuron aufgenommen und die Dauer und Druck der Zug fahren (Pfund pro Quadratzoll, Psi). Dieser Artikel beschreibt ein schrittweises Verfahren zur Erfassung der ganzen Zelle Ströme induziert durch Gamma - Aminobuttersäure (GABA) auf ein Neuron eine präfrontalen kortikalen Scheibe schnaufend. Insbesondere kann das gleiche Verfahren mit geringfügigen Änderungen, andere Hirnareale wie Hippocampus und das Striatum und verschiedene Präparate, wie z. B. Zellkulturen angewendet werden.

Die Blätterteig-Technik erlaubt Forschern, die Wirkung von Medikamenten auf bestimmte Rezeptoren auf der Oberfläche eines bestimmten Neurons zu studieren. In diesem Artikel konzentrieren wir uns auf Strömungen durch GABA-Rezeptoren vermittelt. Abbildung 1 zeigt die Blätterteig und Aufnahme Mikropipetten. Keine Auswirkungen auf die aufgezeichneten Neuronen des physischen Drucks zu beseitigen durch das Blätterteig ACFS generiert und Saccharose Puffs (<strong cl...

Wir beschreiben die Blätterteig-Technik, durch die pharmakologische Reagenzien können während der gesamten Zelle Patch-Clamp-Aufnahme verabreicht werden, und verschiedene Aspekte der Funktionen, die für den Erfolg entscheidend sind.

Whole-Cell Ströme induziert durch Blätterteig Anwendung von GABA im Gehirnscheiben

Pharmacological administration is commonly used when conducting whole-cell patch-clamp recording in brain slices. One of the best methods of drug ...

Das übergeordnete Ziel dieser Puff-Technik ist es, die pharmakologische Verabreichung im Ganzzell-Patch-Clamp-Recording durchzuführen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Elektrophysiologie zu beantworten, wie z. B. die pharmakologische Verabreichung. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Wirkstoffkonzentration um die Aufnahmestelle herum schnell ansteigt und so eine Desensibilisierung der Membranrezeptoren verhindert wird.Im Allgemeinen werden Einzelpersonen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da die Vorbereitung der akuten präfrontalen Kortexscheibe und die Position der Puff-Mikropipette relativ schwierig sind. Um diesen Vorgang zu starten, zerkleinern Sie die gefrorene Schneidlösung, um einen Matsch zu erhalten. Halten Sie die matschige Lösung auf Eis und sprudeln Sie sie mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid.Legen Sie dann den präparierten Kopf in ein mit eiskalter Schneidlösung gefülltes Becherglas und nehmen Sie ihn nach einigen Sekunden heraus. Schneiden Sie den Schädel entlang der Mittellinie in kaudal-rostraler Richtung mit einer feinen Schere ein und entfernen Sie die seitlichen Schädelanteile. Entfernen Sie dann das Gehirn mit einem feinen Spatel und lassen Sie es in die eiskalte Schneidlösung fallen.Legen Sie anschließend das Gehirn auf den Deckel einer neun Zentimeter großen, mit Eis gefüllten Petrischale. Spülen Sie das Gehirn mit eiskalter Schneidlösung ab. Schneide dann das Kleinhirn und den Riechkolben mit einer Rasierklinge ab.Tragen Sie anschließend Cyanacrylatkleber auf den Vibratome-Probenhalter auf. Legen Sie den Hirnblock vorsichtig mit der rostralen Seite nach oben auf den Leimtropfen und tauchen Sie ihn sofort in die eiskalte Schneidlösung. Stellen Sie den Klingenhalter in einem Winkel von 15 Grad in Bezug auf die horizontale Ebene ein.Teilen Sie das Gehirngewebe in 350 Mikrometer große koronale Scheiben. Übertragen Sie dann die Objektträger in die mit ACSF gefüllte Auffangkammer und inkubieren Sie sie eine Stunde lang mit konstantem Blubbern von 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid. In unserem Experiment ist auch die Vorbereitung des akuten präfrontalen Kortexschnitts entscheidend für den Eingriff.Ein gesunder Gehirnschnitt bedeutet aktive Neuronen, die fest geflickt werden können. Bei diesem Verfahren werden Borosilikat-Mikropipetten aus Glas hergestellt, die als Aufzeichnungselektroden oder Puff-Mikropipetten verwendet werden können. Für die Aufzeichnung von Elektroden liegen die Spitzenwiderstände im Bereich von vier bis sechs Megaohm, während Puff-Mikropipetten Spitzendurchmesser im Bereich von zwei bis fünf Mikrometern haben.Geben Sie einen Sodionskanalblocker zu ACSF, um schnelle Dionenkanäle und damit Aktionspotentiale zu blockieren, und halten Sie eine konstante Durchflussrate dieser Lösung von zwei bis drei Millilitern pro Minute in der Aufnahmekammer aufrecht. Blasen Sie den ACSF ständig mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid, um die Lebensfähigkeit der Scheiben zu gewährleisten. Übertragen Sie eine Gehirnscheibe mit einer Pasteur-Pipette, deren feine Spitze auf die Größe der Scheibe zugeschnitten ist, in die Aufnahmekammer.Platzieren Sie als Nächstes einen Platin-Scheibenanker über der Scheibe, um sie auf der Plattform zu halten. Füllen Sie danach die Aufzeichnungsmikropipetten mit interner Lösung und füllen Sie die Puff-Mikropipetten mit GABA bei 10 Mikromolaren, 50 Mikromolaren und 100 Mikromolaren oder ACSF als Vehikelkontrolle. Um eine Verstopfung durch Schmutz zu vermeiden, üben Sie mit einer Ein-Milliliter-Spritze einen leichten Überdruck aus, bevor Sie die Aufzeichnungselektrode in den ACSF eintauchen.Positionieren Sie die Aufzeichnungselektrode und die Puff-Mikropipette unter einem Mikroskop so, dass die Spitzen in der Mitte des Monitors erscheinen. Identifizieren Sie dann ein Zielneuron. Passen Sie den Mikroskopfokus an, während Sie die Puff-Mikropipette allmählich absenken, und platzieren Sie sie in einem Winkel von 45 Grad über dem Aufnahmeneuron.Halten Sie den Abstand zwischen der Spitze der Puff-Mikropipette und dem Zielneuron im Bereich von 20 bis 40 Mikrometern. Nähern Sie sich langsam und vorsichtig mit der Aufzeichnungselektrode dem Neuron und lassen Sie dann den Überdruck los. Üben Sie einen schwachen und kurzen Sog durch den Schlauch aus, der mit dem Elektrodenhalter verbunden ist, um eine Gigaohm-Abdichtung zu erzeugen.Halten Sie die Spannung bei null Millivolt. Nach der Bildung der Gigaohm-Dichtung kompensieren Sie die schnelle und langsame Kapazität manuell oder automatisch. Üben Sie dann einen kurzen und starken Sog durch den Schlauch aus, um in den Ganzzellenmodus zu wechseln.Anschließend werden die evozierten IPSC-Ströme im Voltage-Clamp-Modus aufgezeichnet. Geben Sie einzelne oder gepaarte GABA-Züge über die Puff-Mikropipette ab, die von einem Master-8-Spannungsstufengenerator gesteuert wird. Ändern Sie die Zugdauer, um die besten Ergebnisse für evozierte IPSC-Ströme zu erhalten, und messen Sie die evozierten IPSC-Ströme im LPS-induzierten Depressionsmodell.Hier sind die Beispiel-IPSCs dargestellt, die durch 10, 50 und 100 mikromolare GABA induziert wurden. Und hier sind die Reaktionskurven der Puffdauer. Hier sind die repetitiven Ströme dargestellt, die GABA bei 50 mikromolaren Zügen in Abständen von einem, zwei oder drei Sekunden hervorruft.Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, gesunde Gehirnschnitte zu erhalten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der pharmakologischen Verabreichung, um die Wirkung von Arzneimitteln in der Elektrophysiologie zu erforschen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die pharmakologische Verabreichung bei der Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung durchgeführt wird. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit TTX extrem gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. das Tragen von Handschuhen.

whole-cell-currents-induced-puff-application-gaba-brain

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Wir nutzen die Patch-Clamp-Technik, um GABA-aktivierte Einkanal-Ströme (GABAA-Kanälen, GABAA-Rezeptoren) und die synaptischen und Tonic Ströme erzeugen sie in Neuronen zu messen. Aktivierung der Kanäle sinkt neuronale Erregbarkeit in Gesundheit und...

GABA-aktivierten Single-Channel-und Tonic Currents in Hirnschnitten der Ratte

Dieses Video zeigt die Aufzeichnung von Ganzzellströmen, die durch Gamma-Aminobuttersäure oder GABA induziert werden, in einem präfrontalen kortikalen Hirnschnitt der Maus. Die kontrollierte Verabreichung von GABA öffnet Chloridkanäle in einem postsynaptischen Neuron und erzeugt inhibitorische postsynaptische Ströme oder IPSCs. Diese IPSCs nehmen mit höheren GABA-Konzentrationen zu, was die hemmende Wirkung von GABA auf die synaptische Übertragung widerspiegelt.

Aufzeichnung von Ganzzellströmen mit GABA-Puffing in einer Gehirnscheibe einer Maus

Kortikaler Netzwerke werden von einem kleinen, aber vielfältige Reihe von hemmenden Inter gesteuert. Funktionelle Untersuchung von Inter erfordert daher gezielte Aufnahme und strenge Identifizierung. Hier beschrieben wird, ist ein kombinierter Ansatz, der Ganzzellableitungen von einzelnen oder synaptisch gekoppelten Paare von Neuronen mit intrazelluläre Markierung, Post-hoc-morphologische und immunzytochemische Analyse.

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen aus Morphologically- und neurochemisch identifizierten Hippocampus Inter

Schwingungen sind grundlegende Netzeigenschaften und sind von Krankheiten und Arzneimittel moduliert. Studieren Gehirn-slice Schwingungen ermöglicht Charakterisierung der isolierten Netze unter kontrollierten Bedingungen. Protokolle sind für die Herstellung von akuten Gehirnscheiben zum Hervorrufen CA1 γ Schwingungen vorgesehen.

Generation of Local CA1 γ Schwingungen durch tetanische Stimulation

Dieses Protokoll beschreibt grundlegende Verfahrensschritte für die Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen durchführen. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung des elektrischen Verhaltens von Neuronen, und wenn in Hirnschnitten durchgeführt wird, ermöglicht die Bewertung verschiedener neuronaler Funktionen von Neuronen, die in relativ gut erhalten Gehirn Schaltungen noch integriert sind.

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen in Hirnschnitten

Hier präsentieren wir Ihnen Protokolle, um Verbindungen zu GABA-A -Rezeptoren von der Bindung an die Physiologie und Pharmakologie aktiv zu entdecken.

Methoden für die Entdeckung der neuartige Substanzen modulieren einen Gamma - Aminobuttersäure-Rezeptor geben eine Neurotransmission

Akuter Anfall Modelle sind wichtig für die Untersuchung der Mechanismen, die epileptiformen Veranstaltungen. Darüber hinaus bietet die Möglichkeit, epileptiformen Ereignisse auf Abruf erzeugen eine äußerst effiziente Methode um die genaue Abfolge der Ereignisse zugrunde liegen ihre Einleitung zu studieren. Hier beschreiben wir die akute 4-Aminopyridine kortikalen Beschlagnahme Modelle Maus und menschlichem Gewebe gegründet.

Generation und On-Demand Einleitung der akuten iktale Aktivität in Nagetier und menschlichem Gewebe

Hier beschreiben wir die wesentlichen Schritte für die ganze Zelle Patch-Clamp-Aufnahmen, die von Neuronen der Substantia Gelatinosa (SG) in der in-vitro- Rückenmark-Slice. Diese Methode ermöglicht die innere Membran Eigenschaften, synaptische Übertragung und morphologische Charakterisierung der SG Neuronen untersucht werden.

Vorbereitung der akuten Rückenmark Scheiben auf Whole-Cell Patch-Clamp-Aufnahme in den Neuronen der Substantia Gelatinosa

Das vorgestellte Protokoll beschreibt den Transport und die Vorbereitung von resektiertem menschlichen Hippocampusgewebe mit dem ultimativen Ziel, lebenswichtige Hirnscheiben als präklinisches Bewertungsinstrument für potenzielle antiepileptikatische Substanzen zu verwenden.

Vorbereitung von akuten menschlichen Hippocampusscheiben für elektrophysiologische Aufnahmen

Ex-vivo-Gehirnschnitte können verwendet werden, um die Auswirkungen von flüchtigen Anästhetika auf evozierte Reaktionen auf afferente Inputs zu untersuchen. Optogenetik wird eingesetzt, um thalamokortikale und kortikokkortikale Afferenzen für nicht-primären Neokortex unabhängig zu aktivieren, und synaptische und Netzwerkantworten werden mit Isofluran moduliert.

Optogenetische Aktivierung afferenter Signalwege in Hirnschnitten und Modulation von Reaktionen durch flüchtige Anästhetika

Dieser Artikel zielt darauf ab, ein systematisches Protokoll zu beschreiben, um horizontale Hippocampus-Gehirnscheiben bei Mäusen zu erhalten. Das Ziel dieser Methode ist es, die Integrität von Hippocampus-Faserwegen zu erhalten, wie dem Perforantenweg und dem moosigen Fasertrakt, um dentate Gyrus-bezogene neurologische Prozesse zu bewerten.

Horizontale Hippocampal Scheiben der Maus Gehirn

Erfahren Sie die Puff-Technik für die pharmakologische Verabreichung bei Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen im präfrontalen Kortex. Diese Methode ermöglicht eine schnelle Arzneimittelkonzentration und verhindert Rezeptor-Desensibilisierung.

Whole-Cell Ströme induziert durch Blätterteig Anwendung von GABA im Gehirnscheiben

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