Quantifizierung von Proteinen über ein Peptid Immunoaffinity Enrichment gekoppelt mit der Massenspektrometrie

Das übergeordnete Ziel des folgenden Verfahrens ist es, Peptide in einem komplexen Gemisch zu isolieren und zu quantifizieren, die als Surrogate für ihr jeweiliges Protein fungieren. Zuerst werden große Proteine innerhalb des Gemisches mit Hilfe eines Enzyms wie Trypsin zu Peptiden verdaut. Dann werden die Zielpeptidanalyten und ein mit Spikes markierter stabiler Isotopen-markierter interner Standard mit Antip-Peptid-Antikörpern angereichert, die nach der Isolierung auf Protein-G-kodierten magnetischen Partikeln immobilisiert sind.

Die Zielpeptide werden von den magnetischen Partikeln abgegrenzt und mittels Massenspektrometrie zur Quantifizierung relativ zum internen Standard analysiert. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie herkömmlichen Immunoassays besteht darin, dass sie schneller und kostengünstiger bei der Erstellung einer großen Anzahl von Assays ist. Es hat eine hohe Erfolgsquote und lässt sich leicht multiplexen, was zeigt, dass das Verfahren ausgelegt ist.

Ein Techniker im Labor hat ein 10 Mikroliter Plasma-Eloqua auf nassem Eis gehauen. Übertragen Sie die Probe auf eine 1000-Mikroliter-Deep-Well-Platte und bedecken Sie sie mit einer Parabelfolie, um die Proteine bei 20 Mikrolitern frischem neun molaren Harnstoff und 30 Millimolar DTT auf jede Probe zu denaturieren und 30 Minuten lang zu inkubieren. Bei 37 Grad Celsius fügen Sie jeder Probe drei Mikroliter frisches 500 Millimolar Ito Acetamid hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur. Verdünnen Sie nun den Harnstoff auf 0,6 molar mit 100 Millimolar Tris pH Eight und fügen Sie 10 Mikroliter von einem Mikrogramm pro Mikroliter Trips und Stammlösung für ein Verhältnis von einem zu 50 Enzym zu Substrat hinzu.

Nachdem Sie die Reaktion über Nacht bei 37 Grad Celsius bei drei Mikrolitern reiner Ameisensäure auf eine Endkonzentration von 1 % inkubiert haben, fügen Sie den stabilen Isotopenstandard oder mehrere Standards hinzu. Wenn Sie einen Multiplex-Assay durchführen, waschen Sie die Oasis-Kartuschenplatte gut mit 500 Mikrolitern 0,1 % Ameisensäure in 80 % ACE-Nitril und verwerfen Sie den Durchfluss. Äquilibrieren Sie dann die Kartuschenplatte, indem Sie 500 Mikroliter 0,1%ige Ameisensäure in Wasser geben und den Durchfluss verwerfen.

Laden Sie die Aufschlussproben auf die Kartuschenplatte und stellen Sie das Vakuum so ein, dass der Fluss sehr langsam ist. Waschen Sie dreimal mit 500 Mikrolitern 0,1 % Ameisensäure in Wasser und verwerfen Sie den Durchfluss, eluieren Sie die Peptide zweimal mit 500 Mikrolitern 0,1 % Ameisensäure in einem 80 %igen Aceto-Versuch, dann lyophilisieren oder beschleunigen Sie das Eluat wieder bis zur Trockenheit und rekonstituieren Sie die getrockneten Peptide in 50 Mikrolitern PBS plus 0,03 % Chaps, übertragen Sie die Proben auf eine standardmäßige Kingfisher 96-Well-Platte, fügen Sie ein Mikrogramm Antikörper und 1,5 Mikroliter Protein G hinzu codierte magnetische Kügelchen pro Ziel. Wirbeln Sie die Perlen vor der Zugabe ein.

Um sicherzustellen, dass die Perlen gut aufgehängt sind. Decken Sie die Platte mit Folie ab und inkubieren Sie sie über Nacht mit einer sanft taumelnden Zentrifuge. Die Platte 10 Sekunden lang bei 400 U/min, um Flüssigkeit von der Folienoberfläche zu entfernen.

Entfernen Sie die Folienabdeckung. Die Probenmanipulation erfolgt auf einer automatisierten Kingfisher-Plattform auf der Kingfisher-Plattform. Waschen Sie die Kügelchen zweimal mit 200 Mikrolitern PBS plus 0,03%Chaps und einmal mit 200 Mikrolitern einer Verdünnung von eins bis 10 PBS plus 0,03%Chaps, entziehen Sie sich nun den Peptiden mit 25 Mikrolitern 5%Essigsäure plus 0,03%Chaps.

Setzen Sie die Elutionsplatte auf einen Magneten und übertragen Sie das Eluat auf eine 96-Well-Platte, wobei Sie darauf achten müssen, dass die übrig gebliebenen Kügelchen nicht übertragen werden. Decken Sie die Platte mit der Deckenmatte ab und geben Sie diese Platte mit dem Eluat zur Analyse an das Dreifach-, Vierfach-Massenspektrometer. Die MRM-Methode besteht darin, ein Tandemmassenspektrum des interessierenden Peptids zu erhalten und dann die besten Übergangsfragmentionen auszuwählen und zu optimieren.

In der Regel werden bei einer Konfiguration für die MRM-Analyse eine C 18-Falle und analytische Säulen mit zwei beweglichen Phasen verwendet. Laden Sie 10 Mikroliter der Probe und eluieren Sie sie durch einen linearen Gradienten. Integrieren Sie Peakbereiche für leichte und schwere Peptide und berechnen Sie das Peakflächenverhältnis von unmarkierten zu markierten Peptiden in jeder Probe.

Die leichten und schweren Peptide eluieren gleichzeitig und für jedes Peptid können mehrere Übergänge überwacht werden. Um die Identität zu bestätigen, wird die Peakfläche des endogenen Peptids relativ zur Fläche des internen Standards gemessen, um ein quantitatives Maß für das Zielpeptid zu liefern. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie diese Technik in Ihrem Labor implementieren können. Es kann zur Quantifizierung jedes beliebigen Proteins verwendet werden und eignet sich daher für eine breite Palette von Anwendungen in der biologischen Forschung.