Quantifizierung von Proteinen über ein Peptid Immunoaffinity Enrichment gekoppelt mit der Massenspektrometrie

Das allgemeine Ziel des folgenden Verfahrens besteht darin, Peptide in einem komplexen Gemisch zu isolieren und zu quantifizieren, die als Surrogate für ihre jeweiligen Proteine fungieren. Zunächst werden große Proteine innerhalb des Gemischs mithilfe eines Enzyms wie Trypsin in Bestandteile-Peptide gespalten. Anschließend werden die gezielten Peptid-Analyten sowie ein zugefügter stabiler, isotonisch markierter interner Standard mittels Antipeptid-Antikörpern angereichert, die auf mit Protein G codierten magnetischen Partikeln immobilisiert sind, nach der Isolierung.

Die gezielten Peptide werden von den magnetischen Partikeln eluiert und mittels Massenspektrometrie zur Quantifizierung relativ zum internen Standard analysiert. Die Hauptvorteile dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie traditionellen Immunoassays sind, dass sie schneller und kosteneffizienter bei der Erstellung einer großen Anzahl von Assays ist. Sie weist eine hohe Erfolgsrate auf und kann leicht multiplexiert werden, wie im Folgenden beschrieben wird.

Ein Techniker im Labor hat ein 10-Mikroliter-Plasma-Eloqua auf nassem Eis. Überführen Sie die Probe in eine 1000-Mikroliter-Tiefbrunnenplatte und bedecken Sie sie mit Parafilm. Um die Proteine zu denaturieren, geben Sie 20 Mikroliter frischer 9-molarer Harnstofflösung und 30 Millimolar DTT zu jeder Probe hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Geben Sie anschließend drei Mikroliter frischen 500-Millimolar-Iodacetamids zu jeder Probe hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur. Verdünnen Sie nun den Harnstoff mit 100 Millimolar Tris, pH 8, auf 0,6 molar und fügen Sie 10 Mikroliter einer Stammlösung mit einer Konzentration von einem Mikrogramm Trip pro Mikroliter hinzu, um ein Enzym-Substrat-Verhältnis von 1:50 zu erreichen.

Nach der Inkubation der Reaktion bei 37 Grad Celsius über Nacht, drei Mikroliter reiner Ameisensäure hinzufügen, um eine Endkonzentration von 1 % zu erreichen, und anschließend den stabilen Isotopenstandard oder mehrere Standards hinzugeben. Falls ein Multiplex-Assay durchgeführt wird, die Oasis-Kartuschenplatte mit 500 Mikrolitern 0,1 %iger Ameisensäure in 80 % Acetonitril waschen und den Durchlauf verwerfen. Danach die Kartuschenplatte durch Zugabe von 500 Mikrolitern 0,1 %iger Ameisensäure in Wasser equilibrieren und den Durchlauf verwerfen.

Die Verdauungsproben auf die Kartuschenplatte geben und das Vakuum so einstellen, dass die Durchflussgeschwindigkeit sehr langsam ist. Dreimal mit jeweils 500 µL 0,1 %iger Ameisensäure in Wasser waschen und den Durchlauf verwerfen. Die Peptide zweimal mit jeweils 500 µL 0,1 %iger Ameisensäure in 80 % Acetonitril eluieren, dann das Eluat bis zur Trockne eintrocknen (lyophilisieren oder im Vakuum trocknen) und die getrockneten Peptide in 50 µL PBS mit 0,03 % Chaps wieder aufnehmen. Die Proben in eine standardmäßige Kingfisher-96-Well-Platte überführen, je ein Mikrogramm Antikörper und 1,5 µL protein-G-konjugierte magnetische Kügelchen pro Zielmolekül hinzufügen. Die Kügelchen vor der Zugabe vortexen.

Um sicherzustellen, dass die Kügelchen gut suspendiert sind. Decken Sie die Platte mit Folie ab und inkubieren Sie sie über Nacht bei sanfter Rotation im Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Platte bei 400 U/min für 10 Sekunden, um Flüssigkeit von der Folienoberfläche zu entfernen.

Entfernen Sie die Folienabdeckung. Die Probenaufbereitung erfolgt auf einer automatisierten Kingfisher-Plattform. Waschen Sie die Perlen zweimal mit 200 µL PBS plus 0,03 % CHAPS und einmal mit 200 µL einer 1:10-Verdünnung von PBS plus 0,03 % CHAPS. Eluieren Sie nun die Peptide mit 25 µL 5 %iger Essigsäure plus 0,03 % CHAPS.

Stellen Sie die Elutionsplatte auf einen Magneten und überführen Sie das Eluat in eine 96-Well-Platte, wobei darauf geachtet werden muss, dass die übrig gebliebenen Kügelchen nicht mitübertragen werden. Decken Sie die Platte mit der Deckfolie ab und bringen Sie die Platte mit dem Eluat zur Analyse an das Triple-Quadrupol-Massenspektrometer. Die MRM-Methode wird erstellt, indem zunächst ein Tandem-Massenspektrum des Peptids von Interesse aufgenommen und anschließend die besten Übergangs-Fragmentionen ausgewählt und optimiert werden.

Typischerweise verwendet eine Konfiguration für die MRM-Analyse eine C 18-Trap- und Analysensäule mit zwei mobilen Phasen. Laden Sie 10 Mikroliter der Probe auf und eluieren Sie mit einem linearen Gradienten. Integrieren Sie die Peakflächen für die leichten und schweren Peptide, und berechnen Sie das Verhältnis der Peakflächen von unlabeled zu labeled Peptid in jeder Probe.

Die leichten und schweren Peptide eluieren gleichzeitig, und für jedes Peptid können mehrere Übergänge überwacht werden. Zur Bestätigung der Identität wird die Peakfläche des endogenen Peptids im Verhältnis zur Fläche des internen Standards gemessen, um eine quantitative Bestimmung des Zielpeptids zu erhalten. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie diese Methode in Ihrem Labor anwenden können. Sie kann verwendet werden, um jedes beliebige Protein von Interesse zu quantifizieren, und eignet sich daher für eine breite Palette von Anwendungen in der biologischen Forschung.