Oberflächentechnik von pankreatischen kleinen Inseln mit einer Heparinisierten StarPEG NanoCoatings
23. Juni 2018
Dieses Protokoll soll die Oberflächentechnik der pankreatischen Inselchen mit ein Heparin-integriert StarPEG NanoCoatings über Pseudo-Bioorthogonal Chemie zwischen N- Hydroxysuccinimide-Gruppen der NanoCoatings und Amin Gruppen der Insel Zellmembran.
Diese Methode kann dazu beitragen, große Herausforderungen bei der Transplantation von Pankreasinseln zu lösen, wie z. B. Immunabstoßung, Revaskularisierung von Inselzellen nach der Transplantation und Überleben. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass dieser einfach anzuwendende Ansatz das Oberflächen-Engineering lebender Zellen ermöglicht, indem er die zelluläre Landschaft der Pankreasinsel umformt, wodurch die Transplantatfunktion, das Überleben und letztendlich die therapeutische Wirksamkeit der Inselzelltransplantation verbessert werden. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auch auf zellbasierte Therapien, da das therapeutische Ergebnis zellbasierter Therapien auch durch eine geringe Zellretention und ein schlechtes Überleben begrenzt ist.
Jingyi Yang, eine Doktorandin aus meinem Labor, demonstriert dieses Verfahren. Wiegen Sie zunächst 6,9 Gramm Heparin ab und lösen Sie es in 2 Millilitern eiskaltem, entionisiertem Wasser in einem Eppendorf-Röhrchen auf. Lösen Sie 0,23 Gramm NHS in 0,5 Millilitern eiskaltem, deionisiertem Wasser in einem Eppendorf-Röhrchen auf.
Lösen Sie dann 0,77 Gramm EDC in 0,5 Millilitern eiskaltem, deionisiertem Wasser in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen auf. Mischen Sie die NHS- und EDC-Lösungen in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen. Nachdem Sie die gemischte Lösung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gelassen haben, zentrifugieren Sie sie 10 Minuten lang bei 12.000 U/min, um das überschüssige EDC und NHS zu entfernen.
Geben Sie anschließend 30 Milliliter kaltes Ethanol in die Lösung und zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 12.000 U/min. Geben Sie nun 1 Milliliter 10%starPEG MI Aid in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie dann 0,67 Milliliter 10%ige Heparin-NHS-Lösung in das gleiche konische 50-Milliliter-Röhrchen.
Geben Sie die gemischte Lösung 20 Minuten lang bei 25 Grad Celsius in einen Inkubator, um eine viskose, klare Lösung zu erhalten. Entnehmen Sie 200 zuvor extrahierte Mausinseln unter einem Präpariermikroskop und geben Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie 500 Mikroliter PBS zu den Inseln und zentrifugieren Sie eine Minute lang bei 1.200 U/min bei vier Grad Celsius.
Entfernen Sie den Überstand, fügen Sie 250 Mikroliter der Heparin-PEG-Lösung hinzu und legen Sie die Mischung 10 Minuten lang auf Eis. Pipettieren Sie auf und ab, damit sich die Inseln gut mit der Heparin-PEG-Lösung vermischen können. Anschließend zentrifugieren Sie die Mischung eine Minute lang bei 1.200 U/min.
Entfernen Sie dann den Überstand und fügen Sie 500 Mikroliter PBS hinzu. Pipettieren Sie auf und ab, um es gut zu vermischen. Nach dem Zentrifugieren bei 1.200 U/min für eine Minute wird der Überstand entfernt und die Inseln für die weitere Verwendung aufbewahrt.
Als nächstes fügen Sie ein bis zwei Milliliter RPM I 1640 hinzu, ergänzt mit 10 % FBS auf die beschichteten Inseln. Und überführen Sie diese Inseln in eine ungeladene sterile Bakterienkulturschale. Beobachten Sie schließlich die Morphologie und die Fluoreszenzsignale der FAM-Heparin-PEG-beschichteten Inselzellen unter einem inversen Fluoreszenzmikroskop.
Charakteristische Heparin-Peaks, die den HYDROXAL-Gruppen entsprechen, wurden im Heparin-PEG-Nanobeschichtungs-FTIR-Spektrum beobachtet. Die Abnahme der Amplitude dieser Peaks stellt eine Konjugation zwischen den Stern-PEG MI-Hilfsamidgruppen und der Heparin-Karbongruppe dar. Der Peak, der der Amid-Kohlenstoff-Dehnungsschwingung entspricht, war ebenfalls reduziert, was auf eine ausreichende Reaktion zwischen den Heparincarboxylatgruppen mit dem Succynimidal-Suxsonat und dem Star-PEG MI Aid-Amin hinweist.
Raster- und Elektronenmikroskopiedaten zeigen die stark vernetzte poröse Struktur der Heparin-PEG-Nanobeschichtung, was darauf hindeutet, dass sie für das Überleben der Zellen während der In-vivo-Verabreichung geeignet sein könnte. Eine dünne Schicht aus Nanobeschichtung, die durch grüne Fluoreszenz gekennzeichnet ist, wurde gleichmäßig auf der Oberfläche der beschichteten Inseln abgeschieden, ohne offensichtliche Veränderungen des Inselvolumens oder der Inselgröße zu verursachen. Heparin-PEG-beschichtete Mausinseln zeigten eine robuste Lebensfähigkeit der Inselzellen in Kultur.
Eine signifikant fortgeschrittenere Gefäßbildung zeigte sich bei Insel-Endothelzellen, die mit Heparin-PEG-beschichteten Inselzellen co-kultiviert wurden, was durch längliche mikrogefäßähnliche Strukturen und netzwerkartige Gefäßstrukturen gekennzeichnet war. In allen Behandlungsgruppen wurde eine geringe Insulinsekretion beobachtet, wenn die Inselzellen mit einer physiologischen Salzlösung durchblutet wurden, die mit einem substimulatorischen Glukosespiegel ergänzt wurde. Wenn die Inselzellen mit einem superphysiologischen Glukosespiegel stimuliert wurden, wurde ein Anstieg der Insulinsekretion beobachtet.
Einmal gemeistert, kann die Beschichtung in einer Minute durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird, um die Lebensfähigkeit der Inselzellen zu erhalten.
Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Oberflächenmodifikation von Pankreasinseln unter Verwendung einer Heparin-inkorporierten starPEG-Nanobeschichtung. Diese Technik zielt darauf ab, die Ergebnisse der Inseltransplantation zu verbessern, indem sie die Funktion und das Überleben des Transplantats verbessert.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Zellbasierte Therapien
- Transplantationsbiologie
- Oberflächenmodifikation
Hintergrund
- Die Pankreasinseltransplantation steht vor Herausforderungen wie Immunabstoßung und schlechter Inselüberlebensrate.
- Die Verbesserung der zellulären Landschaft der Inseln kann die therapeutische Wirksamkeit verbessern.
- Heparin-PEG-Nanobeschichtung bietet eine potenzielle Lösung für diese Herausforderungen.
- Diese Methode ist einfach zu übernehmen und kann schnell durchgeführt werden.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Beschichtungstechnik, die das Überleben und die Funktion von Pankreasinseln verbessert.
- Bewältigung von Problemen im Zusammenhang mit niedriger Zellretention in zellbasierten Therapien.
- Nachweis der Wirksamkeit der Heparin-PEG-Nanobeschichtung bei der Verbesserung der Ergebnisse der Inseltransplantation.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Heparin- und NHS-Lösungen.
- Mischen von NHS- und EDC-Lösungen für die Nanobeschichtung.
- Beschichtung von Mausinseln mit der Heparin-PEG-Lösung.
- Beobachtung der Inselmorphologie und -lebensfähigkeit unter einem Fluoreszenzmikroskop.
Hauptergebnisse
- Heparin-PEG-beschichtete Inseln zeigten verbesserte Lebensfähigkeit in der Kultur.
- Verbesserte Gefäßbildung wurde in kokultivierten Inselendothelzellen beobachtet.
- Die Insulinsekretion reagierte auf Glukosestimulierung in beschichteten Inseln.
- Die Beschichtung veränderte das Inselvolumen oder die Größe nicht signifikant.
Schlussfolgerungen
- Die Heparin-PEG-Nanobeschichtung ist eine vielversprechende Methode zur Verbesserung der Inseltransplantation.
- Diese Technik könnte die Wirksamkeit zellbasierter Therapien verbessern.
- Zukünftige Anwendungen könnten sich auf andere Zelltypen erstrecken, die eine Oberflächenmodifikation erfordern.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Surface engineering of pancreatic islets with a heparinized starPEG nanocoating addresses critical barriers in cell-based therapies, including immuno-rejection and poor graft survival. This platform enables functional modification of living cell surfaces, supporting improved transplantation outcomes and translational continuity. The approach offers a scalable, mild, and adaptable solution for enhancing cell viability and therapeutic efficacy in preclinical and discovery-stage R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of immune-modulatory strategies for cell-based therapy targets.
- Supports biological de-risking by preserving islet viability and function post-coating.
- Facilitates predictive confidence in cell survival and engraftment for portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Prepares standardized, surface-engineered islets for downstream functional assays.
- Ensures reproducibility and quantitative assessment of islet viability and insulin secretion.
- Enables reliable evaluation of immune protection and vascularization in screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for islet transplantation and immune response studies.
- Supports continuity from in vitro engineering to in vivo transplantation validation.
- Provides mechanistic de-risking for cell retention and survival in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
This nanocoating method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting early-stage hypothesis testing and enabling robust preclinical validation of cell-based therapies.
- Discovery Biology: Advances hypothesis testing for immune evasion and graft survival mechanisms.
- Screening: Delivers reproducible, quantifiable outputs for islet viability and function.
- Analytics: Provides measurable readouts such as insulin secretion and vascularization metrics.
- Translational Research: Bridges in vitro engineering with in vivo transplantation studies for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a modular platform adaptable to various cell types and functional mediators.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in cell survival and immune protection.
- Operational Value: Standardizes cell surface engineering with minimal impact on cell viability.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions for cell therapy candidates and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of cell-based therapeutic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell isolation, surface chemistry, and nanocoating techniques.
- Needs access to fluorescence microscopy and analytical instrumentation for validation.
- Demands cross-team standardization for reproducibility in islet preparation and coating.
- Adaptable to different cell types and functional mediators as supported by platform design.
- Practical limitations include maintaining cell viability and ensuring uniform coating coverage.
