Oberflächentechnik von pankreatischen kleinen Inseln mit einer Heparinisierten StarPEG NanoCoatings

Diese Methode kann dazu beitragen, große Herausforderungen bei der Transplantation von Pankreasinseln zu lösen, wie z. B. Immunabstoßung, Revaskularisierung von Inselzellen nach der Transplantation und Überleben. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass dieser einfach anzuwendende Ansatz das Oberflächen-Engineering lebender Zellen ermöglicht, indem er die zelluläre Landschaft der Pankreasinsel umformt, wodurch die Transplantatfunktion, das Überleben und letztendlich die therapeutische Wirksamkeit der Inselzelltransplantation verbessert werden. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auch auf zellbasierte Therapien, da das therapeutische Ergebnis zellbasierter Therapien auch durch eine geringe Zellretention und ein schlechtes Überleben begrenzt ist.

Jingyi Yang, eine Doktorandin aus meinem Labor, demonstriert dieses Verfahren. Wiegen Sie zunächst 6,9 Gramm Heparin ab und lösen Sie es in 2 Millilitern eiskaltem, entionisiertem Wasser in einem Eppendorf-Röhrchen auf. Lösen Sie 0,23 Gramm NHS in 0,5 Millilitern eiskaltem, deionisiertem Wasser in einem Eppendorf-Röhrchen auf.

Lösen Sie dann 0,77 Gramm EDC in 0,5 Millilitern eiskaltem, deionisiertem Wasser in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen auf. Mischen Sie die NHS- und EDC-Lösungen in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen. Nachdem Sie die gemischte Lösung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gelassen haben, zentrifugieren Sie sie 10 Minuten lang bei 12.000 U/min, um das überschüssige EDC und NHS zu entfernen.

Geben Sie anschließend 30 Milliliter kaltes Ethanol in die Lösung und zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 12.000 U/min. Geben Sie nun 1 Milliliter 10%starPEG MI Aid in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie dann 0,67 Milliliter 10%ige Heparin-NHS-Lösung in das gleiche konische 50-Milliliter-Röhrchen.

Geben Sie die gemischte Lösung 20 Minuten lang bei 25 Grad Celsius in einen Inkubator, um eine viskose, klare Lösung zu erhalten. Entnehmen Sie 200 zuvor extrahierte Mausinseln unter einem Präpariermikroskop und geben Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie 500 Mikroliter PBS zu den Inseln und zentrifugieren Sie eine Minute lang bei 1.200 U/min bei vier Grad Celsius.

Entfernen Sie den Überstand, fügen Sie 250 Mikroliter der Heparin-PEG-Lösung hinzu und legen Sie die Mischung 10 Minuten lang auf Eis. Pipettieren Sie auf und ab, damit sich die Inseln gut mit der Heparin-PEG-Lösung vermischen können. Anschließend zentrifugieren Sie die Mischung eine Minute lang bei 1.200 U/min.

Entfernen Sie dann den Überstand und fügen Sie 500 Mikroliter PBS hinzu. Pipettieren Sie auf und ab, um es gut zu vermischen. Nach dem Zentrifugieren bei 1.200 U/min für eine Minute wird der Überstand entfernt und die Inseln für die weitere Verwendung aufbewahrt.

Als nächstes fügen Sie ein bis zwei Milliliter RPM I 1640 hinzu, ergänzt mit 10 % FBS auf die beschichteten Inseln. Und überführen Sie diese Inseln in eine ungeladene sterile Bakterienkulturschale. Beobachten Sie schließlich die Morphologie und die Fluoreszenzsignale der FAM-Heparin-PEG-beschichteten Inselzellen unter einem inversen Fluoreszenzmikroskop.

Charakteristische Heparin-Peaks, die den HYDROXAL-Gruppen entsprechen, wurden im Heparin-PEG-Nanobeschichtungs-FTIR-Spektrum beobachtet. Die Abnahme der Amplitude dieser Peaks stellt eine Konjugation zwischen den Stern-PEG MI-Hilfsamidgruppen und der Heparin-Karbongruppe dar. Der Peak, der der Amid-Kohlenstoff-Dehnungsschwingung entspricht, war ebenfalls reduziert, was auf eine ausreichende Reaktion zwischen den Heparincarboxylatgruppen mit dem Succynimidal-Suxsonat und dem Star-PEG MI Aid-Amin hinweist.

Raster- und Elektronenmikroskopiedaten zeigen die stark vernetzte poröse Struktur der Heparin-PEG-Nanobeschichtung, was darauf hindeutet, dass sie für das Überleben der Zellen während der In-vivo-Verabreichung geeignet sein könnte. Eine dünne Schicht aus Nanobeschichtung, die durch grüne Fluoreszenz gekennzeichnet ist, wurde gleichmäßig auf der Oberfläche der beschichteten Inseln abgeschieden, ohne offensichtliche Veränderungen des Inselvolumens oder der Inselgröße zu verursachen. Heparin-PEG-beschichtete Mausinseln zeigten eine robuste Lebensfähigkeit der Inselzellen in Kultur.

Eine signifikant fortgeschrittenere Gefäßbildung zeigte sich bei Insel-Endothelzellen, die mit Heparin-PEG-beschichteten Inselzellen co-kultiviert wurden, was durch längliche mikrogefäßähnliche Strukturen und netzwerkartige Gefäßstrukturen gekennzeichnet war. In allen Behandlungsgruppen wurde eine geringe Insulinsekretion beobachtet, wenn die Inselzellen mit einer physiologischen Salzlösung durchblutet wurden, die mit einem substimulatorischen Glukosespiegel ergänzt wurde. Wenn die Inselzellen mit einem superphysiologischen Glukosespiegel stimuliert wurden, wurde ein Anstieg der Insulinsekretion beobachtet.

Einmal gemeistert, kann die Beschichtung in einer Minute durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird, um die Lebensfähigkeit der Inselzellen zu erhalten.