Name: Oberflächentechnik von pankreatischen kleinen Inseln mit einer Heparinisierten StarPEG NanoCoatings (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: Erfahren Sie die Oberflächenmodifikation von pankreatischen Inseln mit einem Heparin-StarPEG-Nanocoating. Diese Methode verbessert die Überlebensrate und Funktion der Inseln für Transplantationen.

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Wir sind dankbar für die finanzielle Unterstützung der National Natural Science Funds of China (31770968) und Tianjin-Programm der Anwendung Forschungsgemeinschaft und Advanced Technology (17JCZDJC33400).

1. Herstellung von Heparin aufgenommen Starpeg NanoCoatings
<ol><li>
Synthese von Heparin Succinimidyl Succinat (Heparin-NHS)
	<ol>
<li>Von Heparin 0,69 g abwiegen und in 2,0 mL eiskaltes deionisiertes Wasser auflösen.</li>
		<li>NHS 0,23 g abwiegen und in 0,5 mL eiskaltes deionisiertes Wasser in einem Rundboden-Kolben auflösen.</li>
		<li>EDC 0,77 g abwiegen und in 0,5 mL eiskaltes deionisiertes Wasser in einem Rundboden-Kolben auflösen.</li>
		<li>Mischen Sie die NHS und EDC-Lösungen in einem Rundboden-Kolben. Lassen Sie die gemischte Lösung auf der Bank bei Raumtemperatur für 30 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die EDC NHS Mischung 5.031 x g für 10 min bis zum Exzess EDC und NHS zu entfernen.</li>
		<li>Die Mischung Lösung und Zentrifuge bei 5.031 X g für 10 min 30 mL kaltem Ethanol hinzufügen.<ol>
<li>Zweimal wiederholen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung der StarPEG-Heparin NanoCoatings
	<ol>
<li>Ein Rundboden-Flasche 1,0 mL der 10 % (w/V) StarPEG-(NH2)8 hinzufügen.</li>
		<li>Die gleichen Rundboden-Flasche 0,67 mL 10 % (w/V) Heparin-NHS hinzufügen.</li>
		<li>Legen Sie die gemischte Lösung StarPEG-(NH2)8 und Heparin-NHS in einem Inkubator bei 25 ° C für 20 min bis eine klare Lösung mit Viskosität zu erhalten. Hinweis: Für Experimente in denen eindringmittel beschrifteten Heparin (FAM-Heparin) erforderlich war, ist das Verfahren der Herstellung gleich außer dass deionisiertes Wasser ergänzt mit 5 Absatz 6 - Sterne - PEG-(NH2)8 aufgelöst wurde Carboxyfluorescein N- Succinimidyl Ester 0,1 % (Molverhältnis) StarPEG-(NH2)8. )</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Charakterisierung von Heparin-PEG NanoCoatings durch Fourier transformieren Infrarotspektroskopie (FT-IR)
	<ol>
<li>Spülen Sie bevor Sie beginnen das Achat Mörser und Pistill Pelletierung Gerät (kleine Scheiben mit Durchmesser von 13 mm ab) mit Aceton und deionisiertes Wasser. Trocknen Sie das Glas in einem Ofen vor Gebrauch.</li>
		<li>Mix ca. 0,1 – 1 % Heparin-PEG Probe mit 200 – 250 mg feine KBr-Pulver.</li>
		<li>Legen Sie die Heparin-PEG und KBr Mischung im Achat Mörser und fein pulverisieren in kleinen Pellets mit einem Durchmesser von 2 µm.</li>
		<li>Übertragen Sie die Mischung in ein Pelletierwerk Gerät. Gelten Sie hohe Druckkraft (8 T/cm2) in einem Vakuum für 1 – 2 min. transparent Pellets zu bilden.</li>
		<li>Ziehen Sie vorsichtig die Probe Pellets von dem Pelletierwerk Gerät fern. Achten Sie darauf, nicht zu schwer, Risse entstehen nicht zu ziehen.</li>
		<li>Übertragen Sie die Probe-Pellets sehr sorgfältig auf ein Fourier transformieren Infrarot Spektroskop, Probe chemische Struktur zu bestimmen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Prüfung der internen porösen Strukturen der Heparin-PEG NanoCoatings von gescannten Rasterelektronenmikroskopie (SEM)
	<ol>
<li>Bereiten Sie für die folgenden Verfahren standard 48-Well Kultur Zellplatte und Pipetten.</li>
		<li>Pipette die Heparin-PEG-Copolymer-Lösung in die Vertiefungen einer Kultur 48-Well-Platte.</li>
		<li>Frieren Sie die Platte bei-80 ° C für 24 h.</li>
		<li>Lypophilize der Proben bei-50 ° C im Vakuum (0,1 Pa) für 24 h.</li>
		<li>Die klebrige Oberfläche ein Aluminium-Stub Proben verteilt.</li>
		<li>Die Proben mit Gold zu beschichten und beobachten unter dem gescannten Elektronenmikroskop, interne poröse Strukturen zu beobachten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Untersuchung der Heparin-PEG NanoCoatings Oberfläche durch Rasterkraftmikroskopie (AFM)
	<ol>
<li>Silica-Glas-Objektträger mit Piranha-Lösung reinigen (70 % H2SO4, 30 % H2O2) bei 80 ° C für 40 Minuten.</li>
		<li>Beschallen Sie die Folien in Methanol für 10 min und dann in Toluol für 10 min.</li>
		<li>Trocknen Sie die Folien durch Vakuumtrocknung.</li>
		<li>Waschen Sie die Folien mit 3-Aminopropyl-Triethoxysilane Lösung (2 % in Toluol), schütteln Sie Sie leicht.</li>
		<li>Beschallen Sie Folien in Methanol für 10 min dann in Toluol für 10 min.</li>
		<li>Platz 100 µL 3 % Heparin-PEG-Lösung über die Oberfläche der Folien mit einer standard-Pipette.</li>
		<li>Untersuchen Sie die Oberfläche der Heparin-PEG unter einem Rasterkraftmikroskop (eine Resonanzfrequenz von 50 – 80 kHz, erzwingen ständige 0.350 N m 21, Spitze Radius von 600 nm).</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Maus Islet Oberflächentechnik mit Heparin-PEG NanoCoatings
<ol><li>
Maus Inselchen Oberflächenbeschichtung mit Heparin-PEG NanoCoatings
	<ol>
<li>Extrahieren Sie Maus Inselchen von Kollagenase Verdauung und Histopaque gradient Reinigung wie Jupiter19berichtet.</li>
		<li>200 Inseln unter einem Mikroskop Dissektion zu einer 1,5 mL-Tube aussuchen.</li>
		<li>Die Inseln und die Zentrifuge bei 503 X g für 1 min 500 µL PBS hinzufügen.</li>
		<li>Ausziehen des Überstands und 250 µL der Heparin-PEG-Lösung hinzufügen und halten Sie die Mischung auf dem Eis für 10 min. Pipette rauf und runter, die Inseln mit den Heparin-PEG-Lösung gut mischen lassen.</li>
		<li>Zentrifuge bei 503 X g für 1 min.</li>
		<li>Entfernen des Überstands und 500 µL PBS. Pipette rauf und runter, gut mischen.</li>
		<li>503 X g für 1 min zentrifugieren Sie und entfernen Sie den überstand zu und halten Sie die Inseln für die weitere Verwendung. Für die Prüfung der Maus Inselchen mit Heparin-PEG beschichtet diente FAM-Heparin-PEG Inselchen Beschichtung folgendermaßen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Prüfung der Maus Inselchen mit dem FAM-Heparin-PEG NanoCoatings beschichtet
	<ol>
<li>Fügen Sie 1 – 2 mL RPMI 1640 mit 10 % fötalen Rinderserum beschichtete Inselchen ergänzt und übertragen Sie diese Inseln in eine sterile Bakterienkultur nicht aufgeladen-Schale.</li>
		<li>Die Morphologie und Fluoreszenz Signale der FAM-Heparin-PEG NanoCoatings beschichtet Inseln unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop zu beobachten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Funktion der Heparin-PEG beschichtet Maus Inselchen im Vergleich zu unbeschichteten Inselchen
<ol><li>
Lebensfähigkeit der Heparin-PEG beschichtet Maus Inselchen
	<ol>
<li>Aussuchen Sie 20 der Heparin-PEG beschichtet Maus Inselchen und legen Sie sie in einen Brunnen von einer 96-Well Zellplatte Kultur.</li>
		<li>Füllen Sie insgesamt 10 Bohrungen mit 20 Heparin-PEG beschichtet Maus Inselchen für jedes gut.</li>
		<li>Aussuchen Sie 20 noncoated Kontrolle Inseln und legen Sie sie in einem Brunnen der gleichen 96-Well Kultur Zellplatte.</li>
		<li>Füllen Sie insgesamt 10 Bohrungen mit 20 noncoated Kontrolle Inselchen für jedes gut.</li>
		<li>Setzen Sie 200 µL RPMI 1640 ergänzt mit 10 % fötalen Rinderserum in jede Vertiefung der 96-Well-Platte, die kleinen Inseln enthält und für 14 Tage in Kultur pflegen.</li>
		<li>Alle 2 Tage Inselchen Nährmedien zu ersetzen.</li>
		<li>Behandeln Sie die Inseln mit einem lebenden/Toten Färbung Kit am Ende der 14 Tage in Kultur und unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop beobachtet.</li>
		<li>PI+ (rot) Zellen innerhalb jeder Insel unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop zu zählen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Revaskularisation der Heparin-PEG beschichtet Maus Inselchen in vitro
	<ol>
<li>Alle experimentellen Kunststoffe einschließlich Kultur Platte Vorkühlen und Pipette Tipps mindestens 12 h vor Gebrauch.</li>
		<li>Legen Sie einen 24-Well-Ort auf ein Kühlkissen. Fügen Sie 250 µL Eis kalt Wachstumsfaktor reduziert Matrigel in jede Vertiefung eine Kultur 24 Wohlen Zellplatte. Ort der beschichteten 24-Well-Platte bei 4 ° C für mindestens 30 Minuten.</li>
		<li>Während die Matrixlösung im Kühlschrank untergeht, trypsinize der Maus pancreatic Islet Endothelzellen Mile Sven 1 (MS1).<ol>
<li>Entfernen Sie alle Nährmedien aus der Gewebekultur-Flasche. Spülen Sie das Fläschchen mit 5 mL PBS.</li>
			<li>Entfernen Sie die PBS und 3 mL Trypsin-EDTA. Inkubation bei 37 ° C für 3 min in ein standard-Inkubator.</li>
			<li>Tippen Sie die Unterseite des Kolbens zu lösen die Zellen und 5 mL Serum ergänzt Medien.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sammeln Sie die Zellen in eine 15 mL Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 1.000 X g für 5 min.</li>
		<li>Ausziehen des Überstands und 5 mL PBS. Pipette rauf und runter, gut mischen.</li>
		<li>Bei 1.000 X g für 5 min zentrifugieren und den überstand abnehmen.</li>
		<li>Hinzufügen von Serum ergänzt DMEM Medien in das Rohr und Samen 50.000 Zellen in jede Vertiefung der Matrix-Lösung beschichtet 24-Well-Platte.</li>
		<li>Fügen Sie 5 Heparin-PEG beschichtet Inselchen oder noncoated Kontrolle Inselchen in jede Vertiefung.</li>
		<li>Insgesamt 500 µL pro Bohrloch Serum ergänzt DMEM Medien in jede Vertiefung hinzufügen.</li>
		<li>Beobachten Sie Rohr-Bildung nach 4h und 24 h Inkubation unter einem Lichtmikroskop.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Glukose-stimulierten Insulinsekretion der Heparin-PEG beschichtet Inselchen Hinweis: Um festzustellen, ob NanoCoatings die Funktion der Maus Inselchen beeinträchtigt, wurde Glukose stimuliert Insulin-Sekretion von Heparin-PEG beschichtet und noncoated Inselchen bewertet.<ol>
<li>30 Heparin-PEG beschichtet Inselchen oder noncoated Kontrolle Inselchen in einem 1,5 mL Röhrchen aussuchen. Bereiten Sie insgesamt 10 Röhrchen für beschichtete Inselchen und noncoated Inseln.</li>
		<li>Fügen Sie 1 mL physiologischer Kochsalzlösung mit 2 Mmol/L Glucose20 ergänzt und Inkubation bei 37 ° C für 2 h. Hinweis: Für das Rezept der physiologischen Salzlösung, siehe Tabelle 1. Lassen Sie die Kappe der Rohre lose während der Inkubation im Brutschrank.</li>
		<li>Entfernen Sie so viel Lösung, wie möglich.</li>
		<li>Stimulieren Sie Inseln durch Zugabe von 600 µL einer physiologischen Salzlösung mit 20 Mmol/L Glucose bei 37 ° C für 30 min ergänzt.</li>
		<li>Sammeln Sie 200 µL des Überstandes aus jeder Tube für Insulin ELISA Quantifizierung mit einem kommerziellen Insulin ELISA kit.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In diesem Artikel zeigen wir "einfach zu erlassen" Ansatz für lebende Zelle Oberflächentechnik ein Heparin-integriert StarPEG NanoCoatings über Pseudo-Bioorthogonal Chemie zwischen den N- Hydroxysuccinimide die NanoCoatings und die Amin Gruppen des Pankreas Inselchen Oberfläche Membran. In der Tat die Aminogruppen in Zellmembranen sind hochreaktiv und infolgedessen frühere Studien haben berichtet, dass Wechselwirkungen zwischen primären Aminogruppen mit aktivierten N- Hydroxysuccinimidyl (NHS) Ester unter physiologischen Bedingungen14 ,16,21. Darüber hinaus hat umfangreiche Forschungen berichtet, dass Einbau von Heparin, ein höchst sulfatierte Glykosaminoglykan und wichtiger Bestandteil der extrazellulären Matrix, während Inselchen Kapselung zu verbesserten Posttransplantationsperiode führen könnte Revaskularisation und reduzierte IBMIR22,23. In Anbetracht der Biokompatibilität von PEG und mehrwertige Eigenschaften des Heparins haben wir 8-armigen PEG für maximale Heparin während der Fertigung der NanoCoatings Laden verwendet. Heparin wurde mit -NHS, modifiziert, die anschließend mit der -NH2 Gruppen auf Insel Zellmembran reagieren würde. Aktivieren die kovalente Bindung-Bildung -NH2 (der Zellmembran) bis -NHS die Hep-PEG, die Inseln leicht "beschichtet werden würde" durch die PEG Heparin eingearbeitet, wodurch es ein Nano-Dünnschicht (NanoCoatings) auf der äußeren Oberfläche des der Bauchspeicheldrüse Inselchen.
Der bisherige Ansatz unterscheidet sich von zuvor veröffentlichten Methoden, die auch PEG als die großen Polymer für Inselchen Mikroverkapselung in diesem Pseudo-Bioorthogonal Chemie zwischen -NHS (von NanoCoatings) und NH -2 von der inselzelle ausgewählt Membran diente. Wenn man bedenkt, dass die Stabilität der inselzelle/Beschichtung, vor allem in einem komplexen Umfeld wie das Plasma ist entscheidend für die Post-Transplantation Revaskularisation und überleben, die Bildung zwischen -NHS und -NH2 wäre stabiler im Vergleich zu hydrophobe Wechselwirkung zwischen PEG und Zellmembran24, elektrostatische Wechselwirkungen9,15,24,25,26 oder biologische Verbindung zwischen biotin Streptavidin-14.
Darüber hinaus erfordert Beschichtung Ansatz, der auch auf der LBL-Ansatz mit erweiterten Inselchen Umgang mit Zeit für multi-Layer Deposition14,16,25, der heutigen Technik beruht im Gegensatz zur kleinen Insel minimal Verarbeitung und sehr kurze Beschichtung Periode der isolierten Inseln. Diese beiden Faktoren sind nach Transplantation Inselchen überlebenswichtig, da Inselchen Lebensfähigkeit oft bereits kompromittierten folgenden Inselchen Isolation aufgrund von beschädigten ECM während der enzymatischen Verdauung ist. Eine Einschränkung des derzeitigen Konzepts ist jedoch, dass im Gegensatz zu LBL, über die Dicke der äußeren Beschichtung gesteuert werden könnte, durch eine Erhöhung oder Verringerung der Zahl der Abscheidung von Schichten, Dicke der Hep-PEG NanoCoatings vorerst zugeschnitten werden kann nicht.
Darüber hinaus aufgrund der milden Zustand wo chemische Reaktion zwischen -NHS und -NH2 stattfindet, der bisherige Ansatz für lebende Zelle gilt Oberflächentechnik nicht auf Pankreas Inseln, aber die meisten Zelltherapie beschränkt. Zusätzlich, wenn man bedenkt, dass Heparin bekannt ist, mit einer Reihe von Zytokinen und biologisch aktiven Molekülen interagieren, Hep-PEG NanoCoatings stellt auch eine offene Plattform, die das Potenzial zur Aufnahme von unbegrenzten biologische Mediatoren sowie Schnittstellen für komplexere Zelle Oberflächentechnik.

Die therapeutische Wirksamkeit von zellbasierten Therapien wird durch niedrige Zelle Retention und Armen überleben1,2begrenzt. Um das Ergebnis von Zelltherapien verbessern, Zell-Oberflächentechnik durch enzymatische Manipulation, wurde Peptid Konjugation, Bioorthogonal Chemie und physikalischen Kapselung mit Biomaterialien ausgebeuteten3,4, 5,6,7,8,9,10. Das aktuelle Protokoll strebt Oberflächentechnik von lebenden Zellen mit einer "leicht zu erlassen" Methode durch die Anwendung einer ultradünnen Heparin enthalten StarPEG (Heparin-PEG) NanoCoatings auf der Zelloberfläche. Oberflächentechnik von Pankreas Inseln präsentierte sich hier als Beispiel aufgrund der Heterogenität der Langerhans-Inseln und die abfällige Ergebnisse der aktuellen klinischen inselversetzung.
In der Tat, klinischen inselversetzung erfolgt derzeit durch direkte Injektion von isolierten Inseln in die hepatische portalader und dieses Verfahren ist nur für ausgewählte Patienten wegen der Knappheit an Spender Materialien und geringe therapeutische Wirksamkeit 11. konventionell, Alginat wurde die am häufigsten verwendeten Biomaterial für Inselchen Kapselung und Oberflächenmodifikation, obwohl es aufgrund der chemischen Instabilität der Alginat und Fibrose im Zusammenhang mit entzündlichen12, weniger als ideal ist 13. Darüber hinaus sind im Vergleich zu der natürlichen Größe der Inseln, die zwischen 100 bis 200 µm, die Alginat-Inselchen Mikrokapseln größer, zwischen 400 und 800 µm, die überschreiten der physiologische diffundierende Entfernung von Sauerstoff. Winkeltreue Inselchen Kapselung, dh., Verkapselung Inseln ohne wesentliche Änderung des Inselchen Volumen, dann entwickelt wurde. So, Ablagerung von Nanomembranes bestehend aus PEG, Tetrafluorethylen, silikonmembrane oder mehrschichtige NanoCoatings (auch bekannt als die "Schicht für Schicht" [LBL] Technik) wurde berichtet, was zu verbesserter in-vitro- Insel überleben14 ,15,16,17,18, obwohl die LBL nähern oft erfordert umfangreiche Inselchen Übergabe Periode zur Abscheidung von mehreren Schichten, welche Insel Lebensfähigkeit gefährden können . Instabilität des Nanomembranes, von die abhängt, elektrostatische oder kovalente Wechselwirkungen zwischen Biomembran Schichten oder hydrophobe Wechselwirkungen zwischen Nanomembranes und der kleinen Insel Oberfläche wirft darüber hinaus auch Bedenken9,14 , 15 , 16 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26.
Ein weiterer begrenzender Faktor, der das therapeutische Ergebnis der intraportal inselversetzung überfüllt ist die sofortige Blut-vermittelte entzündliche Reaktion (IBMIR) verursacht durch direkten Kontakt der implantierten Inselchen mit Blut, wodurch die Thrombozytenaggregation, Koagulation und Immunsystem negativ oder unerwünschte zellulären Aktivierung9. Um diese Probleme zu beheben, wurde eine ultradünne NanoCoatings bestehend aus sternförmigen Polyethylenglykol (StarPEG) für seine etablierten Biokompatibilität und Vielseitigkeit als Gehäusematerial Insel vorbereitet. Heparin, eine höchst sulfatierte Glykosaminoglykan, wurde auch die StarPEG NanoCoatings für seine entzündungshemmende, Antigerinnungsmittel Eigenschaften und Fähigkeit, Vaskularisation zu erleichtern durch die Rekrutierung von Pro-angiogene Wachstumsfaktoren22enthalten, 23.

<table><tbody><tr><td>Reagenz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>AAJ207798</td><td></td></tr><tr><td>Streptozototin</td><td>Sigma</td><td>S0130</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td><td>10831</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>31800022</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Zelldissoziationslösung</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>13150-016</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>12800017</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoselösung</td><td>Sigma</td><td>G8644</td><td></td></tr><tr><td>488 Phalloidin</td><td>Sigma</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Sigma</td><td>21888-25mg-F</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V/PI Apoptose-Kit</td><td>Dojindo</td><td>AD10</td><td></td></tr><tr><td>DAPI Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase aus Clostridium, Typ XI</td><td>Sigma</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>NHS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56480</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3449</td><td></td></tr><tr><td>8-armiges PEG</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>1685176</td><td></td></tr><tr><td>FAM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M041100</td><td></td></tr><tr><td>5(6)-carboxyfluorescein N-succinimidylester</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21888</td><td></td></tr><tr><td>KBr</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>32036</td><td></td></tr><tr><td>3-Aminopropyl-triethoxysilan&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>Toluol</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>S-15497-20X</td><td></td></tr><tr><td>Lebend-/Totfärbeset</td><td>Biovision, US</td><td>K501</td><td></td></tr><tr><td>BD MatrigelTM, Basalmembranmatrix, Wachstumsfaktor reduziert</td><td>BD Bioscience</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid, 99,5%</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>105864</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid, 99%, extra reines</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>991468</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat, 99,7%, ACS-Reagenz</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>988639</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid-Hexahydrat, 99%, ACS-Reagenz</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>182158</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumdihydrogenphosphat, 99%, extra reines</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>128839</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat-Heptahydrat, 99%, für die Analyse</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>119370</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchloridlösung volumetrisch, 1,0 M CaCl2</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>21114</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900933</td><td></td></tr><tr><td>Ratte/Maus Insulin ELISA Kit</td><td>Millipore-linco</td><td>EZRMI-13K</td><td></td></tr></tbody></table>

oberflächentechnik von pankreatischen kleinen inseln mit einer heparinisierten starpeg nanocoatings

Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating

Zelle Oberflächentechnik kann implantierte Zellen vor Gastgeber immun Angriffen schützen. Es kann auch Umformen, zelluläre Landschaft zur Verbesserung der Organfunktion und Überleben nach Transplantation. Dieses Protokoll zielt auf Oberflächentechnik der pankreatischen kleinen Inseln mit einer ultradünnen Heparin enthalten StarPEG (Hep-PEG) NanoCoatings. Um die Hep-PEG NanoCoatings für Bauchspeicheldrüsenkrebs Inselchen Oberflächentechnik zu generieren, Heparin Succinimidyl Succinat (Heparin-NHS) wurde erstmals synthetisiert durch Änderung seiner carboxylat-Gruppen mit N-(3-dimethylamino propyl) -N'-Ethyl Carbodiimide Hydrochlorid (EDC) und N- Hydroxysuccinimide (NHS). Die Hep-PEG-Mischung wurde dann durch Vernetzung der amino Ende funktionalisiert achtarmigen StarPEG (StarPEG-(NH2)8) und Heparin-NHS gebildet. Zur Insel Oberflächenbeschichtung waren Maus Inselchen über Kollagenase Verdauung und gradient Reinigung mit Histopaque isoliert. Isolierte Inseln wurden dann mit Eis kalt Hep-PEG-Lösung für 10 min kovalente Bindung zwischen NHS und Amin Gruppen der Insel Zellmembran ermöglichen behandelt. NanoCoatings mit Hep-PEG verursacht minimale Änderung Inselchen Größe und Volumen und Heparinisierung der Inseln mit Hep-PEG können auch sofort Blut-vermittelte entzündliche Reaktion während der inselversetzung verringern. Dieser "einfach zu erlassen" Ansatz ist ohne Kompromisse bei der Zellviabilität mild genug für Oberflächentechnik lebender Zellen. Wenn man bedenkt, dass Heparin Bindungsaffinität zu mehreren Zytokinen gezeigt hat, die Hep-PEG NanoCoatings auch bietet eine offene Plattform, die Einbeziehung der unbegrenzten funktionale biologische Mediatoren und vielschichtige Flächen für Wohnen ermöglicht Zelloberfläche Bioengineering.

Die Heparin-PEG NanoCoatings wurde durch Konjugation von StarPEG-(NH2)8 und Heparin mit EDC und NHS als Kopplung Agenten (Abbildung 1) synthetisiert. Chemische Struktur der Heparin-PEG NanoCoatings wurde von FT-IR untersucht und wie in Abbildung 2dargestellt, zeichnete charakteristische Gipfel von Heparin bei 3.300 – 3.600 cm-1, entspricht die Hydroxylgruppen des Heparins (Abbildung 2 Rote). Die Abnahme der Amplitude des Peaks bei 3.300 – 3.600 cm-1 (Abbildung 2 blau) stellt Konjugation zwischen der StarPEG-(NH2)8 amidgruppen und Heparin Carbonylgruppe. Amplitude der Gipfel 1.650 cm-1 entspricht dem Amid Carbonyl stretching Vibration wurde ebenfalls reduziert, ausreichende Reaktion zwischen dem carboxylat-Gruppen von Heparin mit Succinimidyl Succinat und Amin StarPEG-(NH2) angibt 8. Oberflächenstruktur der Heparin-PEG NanoCoatings wurde durch Rasterkraftmikroskopie untersucht und nachgewiesen wird von Lou Et Al., die NanoCoatings war etwa 30 nm in der Höhe und 2 µm Breite mit kleinen porösen Features (dunkle Flecken) bis hin zwischen 100 bis 200 nm im Durchmesser10. Daten aus gescannten elektronische Mikroskopie bestätigen auch die stark vernetzte poröse Struktur von Heparin-PEG (Abbildung 3), was darauf hindeutet, dass es für Überleben der Zellen während der in-vivo Geburt geeignet sein könnte.
Oberflächenbeschichtung von isolierten Maus Inselchen wurde untersucht und wie in Abbildung 4dargestellt, dünne Schicht NanoCoatings, durch grüne Fluoreszenz gezeigt wurde gleichmäßig über die Oberfläche der beschichteten Inselchen ohne dass offensichtliche Änderungen auf Insel Volumegröße hinterlegt. Bei der Beschichtung empfiehlt es sich, die kleinen Inseln auf Eis, um ihre Lebensfähigkeit zu erhalten zu halten. In ähnlicher Weise wurde der Beschichtung Periode, 10 min in diesem Fall auch optimiert, um Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Inseln ermöglichen. Es ist erwähnenswert, dass für bessere Beobachtung der NanoCoatings, Elektronenmikroskopie, die die Querschnitte der beschichteten Inselchen als zuvor gemeldeten9,16 untersucht mehr angebracht wäre, obwohl die Daten generiert werden würden von den festen und embedded Inseln statt lebenden Inselchen in der Kultur.
Zu überleben und Funktion des beschichteten Inseln, Inselchen Revaskularisation und Funktionen in wurden bewertet in Vitro. In Anbetracht der positiven Eigenschaften des Heparins könnte Heparin Funktionalisierung auf die Oberfläche der Insel Insel Revaskularisation in Kultur und folglich das Überleben erleichtern. Wir haben beobachtet, dass die Heparin-PEG beschichtet Maus Inselchen robuste Inselchen Lebensfähigkeit in Kultur (Abbildung 5) ausgestellt. Wesentlich weiter fortgeschritten vaskulären Bildung wurde auch von Endothelzellen Inselzellen (MS1), die zusammen mit Heparin-PEG gezüchtet wurden offensichtlich Inselchen, angezeigt durch längliche kapilläre-ähnliche Strukturen und netzwerkartige vaskulären Strukturen (Abbildung 6 beschichtet ).
NanoCoatings Prozess entstehen keine Wirkung Glukose stimuliert Insulin sekretorischen Fähigkeit der Heparin-PEG beschichtet Inselchen. Niedrige Niveau der Insulin-Sekretion wurde in allen Behandlungsgruppen beobachtet, wenn Inselchen mit physiologischer Kochsalzlösung, ergänzt mit sub-stimulatory Niveau der Glukose (2 Mmol/L; durchblutet waren ( Abbildung 7). Wenn Inselchen mit einer supra-physiologischen Niveau der Glukose (20 Mmol/L Glucose) angeregt wurden, wurde die Erhöhung der Insulin-Sekretion in allen Behandlungsgruppen beobachtet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig1v2.jpg"> Abbildung 1: Chemische Struktur der Hep-PEG NanoCoatings für Oberflächentechnik pancreatic Islet. Insel-Beschichtung wurde durch kovalente Vernetzung zwischen den Heparin-NHS und primäre Amine innerhalb der Zellmembran und Sterne - PEG-(NH2)8erreicht. Jedes Molekül Heparin besitzt mehrere Carboxylgruppen, die verändert wurden, um eine NHS-Gruppe haben. Der NHS-aktivierten Carboxylgruppen reagiert mit primären Aminen des Proteins zu Form Amid Verbindungen, über die NanoCoatings von Hep-PEG und Inselchen stabilisiert wird. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig2v2.jpg"> Abbildung 2 : Infrarot-Spektrum der Sterne - PEG-(NH2)8, Heparin und Hep-PEG NanoCoatings im getrockneten Zustand. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig2v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig3.jpg"> Abbildung 3: Gescannte elektronische Mikroskopie Bilder von Hep-PEG in getrocknetem Zustand. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig4.jpg"> Abbildung 4: Repräsentative Bilder von Heparin-PEG beschichtet Inselchen unter Fluoreszenzmikroskop. Heparin wurde bereits beschriftet mit FAM (grün dargestellt). Bilder sind repräsentativ für 100 Inseln. Maßstabsleiste = 100 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig5.jpg"> Abbildung 5: Heparin-PEG beschichtet Inselchen ausgestellt robuste Inselchen Lebensfähigkeit. (A) Daten als Mean± Standard-Fehler bedeutet, n = 50 Inseln pro Gruppe. (B) lebenden Zellen wurden in grün und tote Zellen in rot dargestellt. Maßstabsleiste = 100 µm. Bilder sind repräsentativ für 50 Inseln. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig6.jpg"> Abbildung 6: Heparin-PEG NanoCoatings erleichtert Intra-Inselchen Revaskularisation. Matrigel Rohr Neubildung von MS1 Co kultiviert mit Heparin-PEG beschichtet, kleinen Inseln und Inselchen noncoated Kontrolle. Bilder wurden an 4 und 24 h. Skala Bar = 100 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig7.jpg"> Abbildung 7: Heparin-PEG NanoCoatings verursacht keine Veränderung auf Insel Sekretion Insulinfunktion. Heparin-PEG beschichtete Inselchen und noncoated Kontrolle Inselchen (30) 2 Mmol/L (weißer Balken) ausgesetzt waren oder 20 Mmol/L (schwarze Balken) Glukose für 30 min. Insulin-Sekretion in Reaktion auf 20 Mmol/L Glucose war vergleichbar zwischen der beschichteten und Inselchen zu kontrollieren. Daten erscheinen als Mittelwert ± Standardfehler des Mittel, n = 10. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Dieses Protokoll soll die Oberflächentechnik der pankreatischen Inselchen mit ein Heparin-integriert StarPEG NanoCoatings über Pseudo-Bioorthogonal Chemie zwischen N- Hydroxysuccinimide-Gruppen der NanoCoatings und Amin Gruppen der Insel Zellmembran.

Oberflächentechnik von pankreatischen kleinen Inseln mit einer Heparinisierten StarPEG NanoCoatings

Cell surface engineering can protect implanted cells from host immune attack. It can also reshape cellular landscape to improve graft function and ...

Diese Methode kann dazu beitragen, große Herausforderungen bei der Transplantation von Pankreasinseln zu lösen, wie z. B. Immunabstoßung, Revaskularisierung von Inselzellen nach der Transplantation und Überleben. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass dieser einfach anzuwendende Ansatz das Oberflächen-Engineering lebender Zellen ermöglicht, indem er die zelluläre Landschaft der Pankreasinsel umformt, wodurch die Transplantatfunktion, das Überleben und letztendlich die therapeutische Wirksamkeit der Inselzelltransplantation verbessert werden. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auch auf zellbasierte Therapien, da das therapeutische Ergebnis zellbasierter Therapien auch durch eine geringe Zellretention und ein schlechtes Überleben begrenzt ist.Jingyi Yang, eine Doktorandin aus meinem Labor, demonstriert dieses Verfahren. Wiegen Sie zunächst 6,9 Gramm Heparin ab und lösen Sie es in 2 Millilitern eiskaltem, entionisiertem Wasser in einem Eppendorf-Röhrchen auf. Lösen Sie 0,23 Gramm NHS in 0,5 Millilitern eiskaltem, deionisiertem Wasser in einem Eppendorf-Röhrchen auf.Lösen Sie dann 0,77 Gramm EDC in 0,5 Millilitern eiskaltem, deionisiertem Wasser in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen auf. Mischen Sie die NHS- und EDC-Lösungen in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen. Nachdem Sie die gemischte Lösung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gelassen haben, zentrifugieren Sie sie 10 Minuten lang bei 12.000 U/min, um das überschüssige EDC und NHS zu entfernen.Geben Sie anschließend 30 Milliliter kaltes Ethanol in die Lösung und zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 12.000 U/min. Geben Sie nun 1 Milliliter 10%starPEG MI Aid in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie dann 0,67 Milliliter 10%ige Heparin-NHS-Lösung in das gleiche konische 50-Milliliter-Röhrchen.Geben Sie die gemischte Lösung 20 Minuten lang bei 25 Grad Celsius in einen Inkubator, um eine viskose, klare Lösung zu erhalten. Entnehmen Sie 200 zuvor extrahierte Mausinseln unter einem Präpariermikroskop und geben Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie 500 Mikroliter PBS zu den Inseln und zentrifugieren Sie eine Minute lang bei 1.200 U/min bei vier Grad Celsius.Entfernen Sie den Überstand, fügen Sie 250 Mikroliter der Heparin-PEG-Lösung hinzu und legen Sie die Mischung 10 Minuten lang auf Eis. Pipettieren Sie auf und ab, damit sich die Inseln gut mit der Heparin-PEG-Lösung vermischen können. Anschließend zentrifugieren Sie die Mischung eine Minute lang bei 1.200 U/min.Entfernen Sie dann den Überstand und fügen Sie 500 Mikroliter PBS hinzu. Pipettieren Sie auf und ab, um es gut zu vermischen. Nach dem Zentrifugieren bei 1.200 U/min für eine Minute wird der Überstand entfernt und die Inseln für die weitere Verwendung aufbewahrt.Als nächstes fügen Sie ein bis zwei Milliliter RPM I 1640 hinzu, ergänzt mit 10 % FBS auf die beschichteten Inseln. Und überführen Sie diese Inseln in eine ungeladene sterile Bakterienkulturschale. Beobachten Sie schließlich die Morphologie und die Fluoreszenzsignale der FAM-Heparin-PEG-beschichteten Inselzellen unter einem inversen Fluoreszenzmikroskop.Charakteristische Heparin-Peaks, die den HYDROXAL-Gruppen entsprechen, wurden im Heparin-PEG-Nanobeschichtungs-FTIR-Spektrum beobachtet. Die Abnahme der Amplitude dieser Peaks stellt eine Konjugation zwischen den Stern-PEG MI-Hilfsamidgruppen und der Heparin-Karbongruppe dar. Der Peak, der der Amid-Kohlenstoff-Dehnungsschwingung entspricht, war ebenfalls reduziert, was auf eine ausreichende Reaktion zwischen den Heparincarboxylatgruppen mit dem Succynimidal-Suxsonat und dem Star-PEG MI Aid-Amin hinweist.Raster- und Elektronenmikroskopiedaten zeigen die stark vernetzte poröse Struktur der Heparin-PEG-Nanobeschichtung, was darauf hindeutet, dass sie für das Überleben der Zellen während der In-vivo-Verabreichung geeignet sein könnte. Eine dünne Schicht aus Nanobeschichtung, die durch grüne Fluoreszenz gekennzeichnet ist, wurde gleichmäßig auf der Oberfläche der beschichteten Inseln abgeschieden, ohne offensichtliche Veränderungen des Inselvolumens oder der Inselgröße zu verursachen. Heparin-PEG-beschichtete Mausinseln zeigten eine robuste Lebensfähigkeit der Inselzellen in Kultur.Eine signifikant fortgeschrittenere Gefäßbildung zeigte sich bei Insel-Endothelzellen, die mit Heparin-PEG-beschichteten Inselzellen co-kultiviert wurden, was durch längliche mikrogefäßähnliche Strukturen und netzwerkartige Gefäßstrukturen gekennzeichnet war. In allen Behandlungsgruppen wurde eine geringe Insulinsekretion beobachtet, wenn die Inselzellen mit einer physiologischen Salzlösung durchblutet wurden, die mit einem substimulatorischen Glukosespiegel ergänzt wurde. Wenn die Inselzellen mit einem superphysiologischen Glukosespiegel stimuliert wurden, wurde ein Anstieg der Insulinsekretion beobachtet.Einmal gemeistert, kann die Beschichtung in einer Minute durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird, um die Lebensfähigkeit der Inselzellen zu erhalten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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Oberflächentechnik von pankreatischen kleinen Inseln mit einer Heparinisierten StarPEG NanoCoatings

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