Name: Maus Fettgewebe Erhebung und Verarbeitung für die RNA-Analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Lernen Sie die Sammlung von weißem Fettgewebe bei Mäusen und die Isolierung hochwertiger RNA für Genexpressionsstudien in Stoffwechsel und Molekularbiologie. Diese Methode ermöglicht zuverlässige Analysen.

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Diese Arbeit wurde von Diabetes Kanada unterstützt.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Fettleibige Mäusen ergab folgenden HF-Diät ernähren, Körper und weißen Fettgewebe Gewichte im Vergleich zu Mäusen eine N-Diät gefüttert zugenommen haben. RNA mit Phenol Lösung ergab Proben mit guter Reinheit extrahiert. Leptin ist ein Adipokine produziert in erster Linie von Fettgewebe und positiv korrelieren mit fat mass16bekannt. Wie erwartet erhöht Leptin mRNA Ausdruck bei fettleibigen Mäusen in Tateinheit mit ihrer Fettmasse.
Diese Methode hat mehrere wichtige Schri...

Adipositas ist eine weltweite Epidemie Komplikationen wie Typ 2 Diabetes1führen kann. Diät-induzierten fettleibig und gentechnisch veränderten Tiermodelle sind häufig in Übergewicht und die damit verbundenen Komplikationen für die Forschung verwendet. Traditionell weißen Fettgewebe ist bekannt als ein Ablagefach für überschüssige Energie und besteht hauptsächlich aus Lipiden während braunes Fettgewebe Energie in Wärme2,3 wandelt. Fettgewebe ist dynamisch erweitern und verkleinern abhängig von vielen Faktoren wie Ernährung und körperliche Aktivität. Um Faktoren auf diese Veränderungen zu bestimmen, sind daher ausreichend Fettgewebe Erhebung und Verarbeitung erforderlich4.
Unter weißen Fettgewebe ist es allgemein anerkannt, dass viszeralen und subkutanen Fettdepots unterschiedliche Eigenschaften wie die anatomische Lokalisierung haben und Funktion2,5. Folglich muss zur Vermeidung von widersprüchlichen Ergebnissen oder große Variabilität Aufmerksamkeit getroffen werden, um Kreuzkontaminationen zwischen diesen verschiedenen Fettdepots beim Fettpolster zu sammeln.
Darüber hinaus gibt es drei große Herausforderungen, wenn Sie RNS oder Protein aus Mäusen weißen Fettgewebe zu isolieren. Erstens ist die Fettpolster bei fettleibigen Mäusen sammeln nicht leichte Aufgabe wie die Grenze trennt verschiedene weiße Fettdepots nicht immer klar, im Gegensatz zu anderen Organen wie Niere und Herz6. Zweitens wegen der hohen Fettgehalt des Fettgewebes, während RNS oder Protein isoliert, eine Schicht von Lipiden obenauf schwimmt und verhindert den direkten Zugriff auf die Probe. Drittens: im Gegensatz zu braunen Fettgewebe oder anderen Geweben, weißen Fettgewebe hat erheblich niedrigeren Gehalt an RNA und Protein und dies ist von großer Bedeutung bei der Verwendung von junger Mäusen, Mäuse eine normale (N) Diät gefüttert und Mäuse, die voraussichtlich haben geringe Dicke Massen (d.h. KO Modelle, Behandlung mit Medikamenten, Übung, Training, etc..) 7 , 8.
Daher ist es wichtig, auswählen der geeigneten Methode, die RNA aus Fettgewebe zu isolieren. Alternative Methoden zur Phenol/Chloroform Extraktion sind kommerzielle Kits. Sie basieren in der Regel auf eine anfängliche Phenol Extraktionsschritt, gefolgt von RNA-Reinigung auf eine Spalte9. Diese Kits sind in der Regel teurer und Proben von geringeren Ertrag zu geben, während die RNA-Qualität Variable möglicherweise jedoch sind weniger zeitaufwändig. Einer der größten Vorteile der Phenol-Lösung/Chloroform Extraktion hier beschriebene ist jedoch die Möglichkeit der Isolierung von RNA, DNA und Proteine aus einer einzigen Probe10. Da Mäuse Fettpolster meist klein sind und kleine Menge von RNA und Proteinen (insbesondere schlanke Maus-Modellen geben), maximieren Sie diese Protokolle die Daten, die man aus einer kleinen Probe abbekommt.
Das Ziel dieses Papiers ist es, im Detail beschreiben eine Methode, um adäquate Probenentnahme aus drei Mäuse weißen Fettgewebe Depots sowie Menge und Qualität der RNA Isolierung zu gewährleisten. RNA durch Anschluss an dieses Protokoll erhalten kann verwendet werden, um Echtzeit-PCR-Tests durchzuführen. Dieses Protokoll dient nicht zur RNA-Isolierung aus kultivierten primäre Adipozyten.

<table><tbody><tr><td>1 mL Seringes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X TE Lösung (10 mM Tris-HCl und 1 mM EDTA&bull; Na2. pH 8,0)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 G Nadeln</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>26 G Nadeln</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>75% Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blockheizung (Trockenbad)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>C2432-500mL</td><td></td></tr><tr><td>dATP&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Thermowissenschaftliches</td><td>R0141</td><td></td></tr><tr><td>dCTP&nbsp; &nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>R0151</td><td></td></tr><tr><td>dGTP&nbsp; &nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>R0161</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (1 μμ; l)&nbsp;</td><td>Thermowissenschaftliche</td><td>Norm EN0521</td><td></td></tr><tr><td>dTTP&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>R0171</td> Faststart Universal SYBR grün Master (Rox)Roche 4913922001 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Faststart Universal SYBR Green Master (Rox) Fluoreszenzfarbstoff</td><td>Roche</td><td>4913914001</td><td></td></tr><tr><td>Gefilterte Spitzen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzetten&nbsp;</td><td>Instrumentarium</td><td>HB275</td><td></td></tr><tr><td>Mullhammer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diät für fettreiche Nagetiere</td><td>Bio-Serv, Frenchtown, NJ</td><td>F3282</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol&nbsp;</td><td>Laboratoire MAT</td><td>IH-0101</td><td></td></tr><tr><td>Leptin-Forward-PCR-Primer (5'-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3') 10 μM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leptin-Reverse-PCR-Primer (5'-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3') 10 μM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flüssigstickstoff</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maxima Reverse Transkriptase (Enzym und 5x Puffer)</td><td>Thermo scientific</td><td>EP0742</td><td></td></tr><tr><td>Nanoreines Wasser (als Reinstwasser bezeichnet)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitril-Untersuchungshandschuhe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitril-Handschuhe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normale Nagetierdiät</td><td>Harlan Laboratories, Madison, WI</td><td>Harlan 2018</td><td></td></tr><tr><td>P1000 Pipettierer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P2 Pipettierer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P20 Pipettierer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P200 Pipettierer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phenollösung (TRIzol)&nbsp;</td><td>Ambion Life Technologies</td><td>15598018</td><td></td></tr><tr><td>Voridentifizierte Aluminiumfolie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quarz-Spektralphotometer Küvettengestell</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>für PCR-Röhrchenstreifen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gestelle für RT-PCR-Röhrchenstreifen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zufällige Hexamere&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>58875</td><td></td></tr><tr><td>Echtzeit-PCR-Rotor-Gensystem&nbsp;</td><td>Corbett research</td><td>RG-3000 Rotor-Gene Thermocycler</td><td></td></tr><tr><td>Gekühlte Tischzentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RiboLock RNase Inhibitor</td><td>Thermo scientific</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>RNasefreie 1,5 mL Eppendorf Röhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNasefreie 1,5 mL Röhrchen</td><td></td><td></td><td></td>mit Schraubverschluss</tr><tr><td>RNasefreie PCR Röhrchenstreifen (0,2 mL) und Kappen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNasefreies Wasser</td><td>Hyclone</td><td>SH30538.02</td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR-Gerät</td><td>Qiagen</td><td>Rotor-Gene Corbett 3000</td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR-Röhrchenstreifen (0,1 mL) und Kappen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S16 Forward PCR Primer (5'-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3') 10 μM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S16 Reverse PCR Primer (5' ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3') 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td>Biochrom</td><td>Ultrospec 3100 pro</td><td></td></tr><tr><td>Mörser und Stößel</td><td></td><td></td><td></td>aus Edelstahl</tr><tr><td>Chirurgische Pads</td><td>Hausgemachte eine Schaumstoffplatte, die in eine saugfähige Einwegunterlage</td><td></td><td></td>eingewickelt</tr> ist <tr><td>Chirurgische Schere&nbsp;</td><td>Intrumentarium</td><td>130.450.11</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler&nbsp;</td><td>Biometra</td><td>Thermocycler</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Mischer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wiegespatel</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

maus fettgewebe erhebung und verarbeitung für die rna-analyse

Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis

Im Vergleich zu anderen Geweben, hat weißen Fettgewebe einen deutlich weniger RNA und Protein Inhalt für downstream-Anwendungen wie Real-Time PCR und Western-Blot, da es meist Lipide enthält. RNA Isolation aus Fettgewebe Proben ist auch herausfordernd, da zusätzliche Schritte erforderlich sind, um diese Lipide zu vermeiden. Hier präsentieren wir Ihnen ein Verfahren um drei anatomisch unterschiedlichen weißen Fettgewebe von Mäusen, verarbeiten diese Proben und durchführen von RNA Isolierung zu sammeln. Wir beschreiben weiter die Synthese der cDNA und gen-Ausdruck-Experimente mittels Real-Time PCR. Das hiermit beschriebene Protokoll ermöglicht die Reduzierung der Kontamination von Haar und Blut auf Fettpolster sowie Cross-Kontamination zwischen verschiedenen Fettpolster bei der Entnahme von Gewebe des Tieres. Es wurde auch optimiert, um angemessene Quantität und Qualität der extrahierten RNA zu gewährleisten. Dieses Protokoll kann weit angewendet werden, um jede Maus-Modell wo Fettgewebe Proben für routinemäßige Experimente wie Real-Time PCR erforderlich sind, aber ist nicht zur Isolation von primären Adipozyten Zellkultur.

Nach der Autopsie Prozedur wurden drei weißen Fettgewebe gesammelt und aus den zwei Gruppen von Mäusen (N und HF Diät gefüttert Mäuse) gewichtet. Wie erwartet, stieg Mäuse auf der HF-Diät endgültige Körpergewicht und Gewichtszunahme im Vergleich zu Wurfgeschwistern N Diät (Tabelle 1). Diese Beobachtungen wurden begleitet von mehr als eine 2-fache Erhöhung des Gewichts der SCF, PGF und PRF bei fettleibigen Mäusen im Vergleich zu den N-Diät.
<p class="jove_content" fo:k...

Dieses Papier soll eine schrittweise Anleitung zu sammeln verschiedene weißen Fettgewebe von Mäusen, die Fett Proben zu verarbeiten und RNA extrahieren zu präsentieren.

Maus Fettgewebe Erhebung und Verarbeitung für die RNA-Analyse

Compared to other tissues, white adipose tissue has a considerably less RNA and protein content for downstream applications such as real-time PCR and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine adäquate Probenentnahme von weißen Fettgewebedepots von verschiedenen Mäusen sicherzustellen und eine hohe Menge an qualitativ hochwertiger RNA aus dem Gewebe zu isolieren. Diese Methode kann zentrale Fragen aus den Bereichen Metabolismus, Biochemie und Molekularbiologie beantworten, die sich beispielsweise auf die Genexpression im Fettgewebe von behandelten oder genetisch veränderten Mäusen beziehen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Isolierung großer Mengen hochwertiger RNA aus Fettgewebe ermöglicht, das typischerweise einen niedrigen RNA-Gehalt aufweist.Emilie Pepin, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin aus meinem Labor, wird das Verfahren vorführen. Nach dem Einschläfern einer Maus schneiden Sie die Haut über der Linea alba gemäß dem Textprotokoll und machen dann zwei Schnitte von etwa zwei Zentimetern von der Mitte des Brustkorbs in Richtung des rechten Arms und in der Nähe der Geschlechtsorgane über der rechten Hintergliedmaße. Dehnen Sie eine Ecke der geöffneten Haut und stecken Sie sie mit einer 22-Gauge-Nadel auf das Pad.Stecke dann die andere Ecke fest. Führen Sie mit einer chirurgischen Schere, die so flach wie möglich auf der Haut liegt, eine stumpfe Dissektion des subkutanen Bauchfetts (SCF) durch und übertragen Sie es dann auf ein vorgeschnittenes Stück Aluminiumfolie. Wiederholen Sie die Dissektion für die linke Seite des Tieres.Ziehen Sie dann sowohl die linken als auch die rechten gesammelten Fettpolster in die Aluminiumfolie und frieren Sie die Probe mit flüssigem Stickstoff ein. Um Zugang zum viszeralen Fettgewebe zu erhalten, wird der Bauchmuskel entlang der Linea alba durchtrennt. Machen Sie dann auf beiden Seiten einen Schnitt in den Bauchmuskeln von den Genitalien zum Rücken der Maus.Das Fett um die Fortpflanzungsorgane ist das perigonadale Fett oder PGF. Löse die linken und rechten Fettpolster vom Nebenhoden, den Hoden und dem Ductus deferens ab und übertrage sie auf die vorbeschriftete Alufolie. Frieren Sie die Probe dann in flüssigem Stickstoff ein.Beginnen Sie mit der linken Seite und legen Sie die Nieren frei, indem Sie den Darm von der Bauchhöhle auf die rechte Seite bewegen. Das Fettgewebe, das hier die Niere und die Nebennieren umgibt, ist das perirenale Fett oder PRF. Isolieren und entfernen Sie die Nebennieren, bevor Sie das PRF sammeln.Dies kann mühsam sein, da sie nur ein bisschen rosa sind als das Fettgewebe. Isolieren Sie nun das PRF von der hinteren Muskelwand und durchtrennen Sie den Harnleiter, die Nierenarterie und die Vene, die das PRF und die Niere vom Rest des Körpers trennt. Isolieren Sie dann das PRF von der Niere, indem Sie die Nierenkapsel durchtrennen und entfernen.Nachdem Sie den rechten PRF isoliert haben, übertragen Sie die Probe mit dem Gewebe von der linken Seite auf die Aluminiumfolie und verwenden Sie flüssigen Stickstoff, um die Proben einzufrieren. 1,5 Milliliter RNasefreie konische Röhrchen, einen Mörser und Stößel sowie einen Spatel in flüssigem Stickstoff gemäß dem Textprotokoll kühlen. Legen Sie die Fettgewebeprobe in den Mörser und heben Sie den Stößel mit einigen Lagen braunem Papier aus dem flüssigen Stickstoff und setzen Sie ihn in den Mörser ein.Während du den Stößel mit dem Papier hältst, schlage mit dem Hammer ein- oder zweimal auf die Oberseite des Stößels. Anschließend wird die Probe mit einer rotierenden Bewegung zerkleinert, bis ein feines Pulver entsteht. Entfernen Sie dann den Stößel, nehmen Sie den Spatel aus dem flüssigen Stickstoff und füllen Sie die Probe damit in das entsprechende vorgekühlte konische 1,5-Milliliter-Röhrchen um.Tauchen Sie den Spatel von Zeit zu Zeit wieder in flüssigen Stickstoff, um ein Schmelzen der Probe zu verhindern. Bewahren Sie das konische Röhrchen außerdem auf Trockeneis auf, um ein Auftauen der Probe zu verhindern. Füllen Sie das konische Röhrchen zu etwa 2/3 mit gemahlener Probe, um eine ausreichende RNA-Ausbeute zu erzielen.Bereiten Sie dann die restlichen Proben gemäß dem Textprotokoll vor. Entnehmen Sie unter einer Chemikalienhaube und mit einem Laborkittel, Handschuhen und einer Schutzbrille eine gemahlene Probe aus flüssigem Stickstoff. Öffnen Sie langsam das Röhrchen und fügen Sie 500 Mikroliter Phenollösung hinzu.Schließen Sie den Deckel des Röhrchens und wirbeln Sie es etwa fünf Sekunden lang bei maximaler Geschwindigkeit auf, dann öffnen Sie das Röhrchen langsam und vorsichtig, um den Druck vom Stickstoff abzulassen. Das Geräusch von Luft, die aus der Röhre austritt, ist zu hören. Pipettieren Sie weitere 500 Mikroliter Phenollösung in das Röhrchen.Wirbeln Sie es dann und öffnen Sie es langsam wie zuvor. Wirbeln Sie die Probe, bis sie vollständig aufgelöst ist. Öffnen Sie dann das Röhrchen, um den Druck abzulassen, bevor Sie weitere Proben verarbeiten.Sind alle Proben verarbeitet, werden sie kurz bei maximaler Geschwindigkeit gewirbelt und fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 12.000 G und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Bringen Sie dann die Röhren wieder auf Raumtemperatur.Um eine Kontamination zu vermeiden, verwenden Sie für jede Probe eine P1000-Pipette mit gefilterter Spitze, um so viel RNA wie möglich aus der mittleren rosa Schicht zu isolieren, indem Sie die Lipidphase in der Nähe der Seite des Röhrchens durchstechen. Geben Sie die RNA in die neuen konischen Röhrchen, ohne die Seiten der Röhrchen zu berühren, um eine Übertragung von Lipiden zu verhindern, die an der Außenseite der Spitze vorhanden sind. Geben Sie 200 Mikroliter reines Chloroform zu jeder Probe und mischen Sie die Röhrchen 15 Sekunden lang durch Inversion.Nachdem Sie die Proben 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert haben, zentrifugieren Sie die Röhrchen 15 Minuten lang bei 12.000 G und vier Grad Celsius und bringen Sie die Röhrchen wieder auf Raumtemperatur. Verwenden Sie für jede Probe eine P1000-Pipette und filtrierte Spitzen, um so viel wässrige transparente RNA-haltige Top-Phase wie möglich in den zweiten Satz entsprechender konischer Röhrchen zu übertragen. Geben Sie anschließend 500 Mikroliter 100%iges Isopropanol zu jeder Probe und mischen Sie die Röhrchen 15 Sekunden lang durch Inversion.Inkubieren Sie die Proben dann 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie die Röhrchen 10 Minuten lang bei 12.000 G und vier Grad Celsius, bevor Sie die Röhrchen wieder auf Raumtemperatur bringen. Entsorgen Sie das Isopropanol, indem Sie es aus jeder Tube gießen.Geben Sie nun einen Milliliter 75%Ethanol zu jeder Probe und wirbeln Sie die Röhrchen kurz bei maximaler Geschwindigkeit durch. Zentrifugieren Sie die Proben dann fünf Minuten lang bei 7.500 G und vier Grad Celsius. Nachdem Sie die Proben geschleudert und auf Raumtemperatur gebracht haben, entsorgen Sie das 75%ige Ethanol, indem Sie jedes Röhrchen umdrehen und anzünden, indem Sie es gegen braunes Papier klopfen, um alle Ethanolreste zu entfernen.Lassen Sie den Deckel offen und trocknen Sie das RNA-Pellet etwa 15 bis 20 Minuten an der Luft. Nachdem Sie die Größe der RNA-Pellets bewertet haben, fügen Sie jeder Probe 10 bis 25 Mikroliter RNase-freies Wasser hinzu. Inkubieren Sie die Proben in einem Wärmeblock bei 60 Grad Celsius für fünf Minuten.Wirbeln Sie dann kurz in den Röhren. Inkubieren Sie die Proben weitere fünf Minuten lang im selben Heizblock. Drehen Sie dann schnell alle Proben und legen Sie sie sofort auf Eis.Führen Sie die RT-PCR für die Genexpression im Fettgewebe gemäß dem Textprotokoll durch. Wie erwartet hatten Mäuse mit der fettreichen Diät im Vergleich zu Wurfgeschwistern mit der normalen Diät ein erhöhtes Körpergewicht und eine Gewichtszunahme. Diese Beobachtungen gingen einher mit einer mehr als zweifachen Zunahme des Gewichts von PGF, PRF und SCF bei adipösen Mäusen im Vergleich zu Mäusen mit normaler Ernährung.Diese Tabelle zeigt, dass für jedes weiße Fettgewebe die RNA-Isolierung durch Phenollösung Proben mit einem OD260 über OD280 von etwa 2,0 ergab, was als rein für RNA gilt. Wie in diesem Balkendiagramm zu sehen ist, zeigten die Echtzeit-PCR-Daten, dass die Leptin-mRNA-Expression bei PGF, PRF und SCF von adipösen Mäusen signifikant höher war als bei Mäusen mit normaler Ernährung. Die beobachteten Unterschiede in der Leptin-mRNA-Expression waren nicht auf eine Variation von s16 zurückzuführen, dem Referenzgen, das zur Normalisierung der Ergebnisse zwischen den beiden Gruppen von Mäusen verwendet wurde, da die CT-Werte nicht verändert wurden.Einmal gemeistert, kann diese Technik in vier Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, während des RNA-Extraktionsverfahrens in einer RNase-freien Umgebung zu arbeiten. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die realtime PCR-Amplifikation durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie z.B. Genexpressionsmodifikationen zu beantworten.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet des Stoffwechsels, um die Modulation des Fettgewebes im Zusammenhang mit Fettleibigkeit und Diabetes bei Nagetieren zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie verschiedene Fettpolster isolieren und RNA aus ihnen isolieren können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit der Phenollösung äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen eines Laborkittels und von Handschuhen getroffen werden sollten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Wir berichten über ein Verfahren zur Isolierung von RNA mit hoher Integrität aus der Ribonuklease-reichen Bauchspeicheldrüse der Maus.

RNA-Isolierung aus Maus Pankreas: Eine Ribonuklease-reichen Gewebe

Aufeinanderfolgende Kryo-Abschnitte werden gesammelt, um histologische Anwendungen und Anreicherung von RNA für Genexpressionsmessungen mit benachbarten Regionen aus einer einzigen Maus Skelettmuskel ermöglichen. 30 mg gepoolt Kryoabschnitte und Messungen werden direkt im Vergleich über mehrere Anwendungen hinweg - Qualitativ hochwertige RNA wird aus 20 erhalten.

Kryoschneiden von benachbarten Regionen eines einzelnen Maus Skelettmuskel für die Genexpression und histologische Analysen

Hier beschreiben wir ein Protokoll für eine reproduzierbare Laser Capture Microdissection (LCM) zur Isolierung von trabekuläre Geflecht (TM) für die nachgelagerten RNA-Analyse. Die Fähigkeit, Veränderungen in der Genexpression im TM zu analysieren hilft beim Verständnis der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der TM-okulären Erkrankungen.

Laser Capture Microdissection von hochreinen trabekuläre Geflecht aus Maus Augen für Gene Expression Analysis

Ein Lasercapture Microdissection (LCM) Protokoll wurde entwickelt, um eine ausreichende Menge an hochwertiger RNA für die Genexpressionsanalyse in Knochenzellen zu erhalten. Die aktuelle Studie konzentriert sich auf Mausfemurabschnitte. Das hier berichtete LCM-Protokoll kann jedoch verwendet werden, um die Genexpression in Zellen von hartgeweben zu untersuchen.

Ein Laser Capture Microdissection Protocol, das hochwertige RNA aus frisch gefrorenen Mausknochen liefert

Eine kryogene Pulverisierungsmethode zur Verarbeitung von murinen Pfoten mit einer flüssigen Stickstoff-Gefriermühle wurde entwickelt, um die Ausbeute und Qualität der aus den Geweben extrahierten RNA oder Proteine zu verbessern und die Analyse molekularer Profile im Zusammenhang mit entzündlichen Antworten.

Ein Kryo-Pulverisierungsprotokoll zur Verarbeitung von Mauspfoten zur Bewertung molekularer Wege von Gewebeentzündungen in einem Kollagen-induzierten Arthritis-Modell

Dieses Verfahren beschreibt die Sammlung diskreter gefrorener Hirnregionen, um hochwertiges Protein und RNA mit kostengünstigen und allgemein verfügbaren Werkzeugen zu erhalten.

Sammlung von gefrorenen Nagetier-Hirnregionen für Downstream-Analysen

Diese Veröffentlichung beschreibt ein Protokoll zur Isolierung von Kernen aus ausgereiften Adipozyten, zur Reinigung durch fluoreszenzaktivierte Sortierung und zur einzelligen Transkriptomik.

Isolierung von Adipose-Gewebekernen für einzellige Genomanwendungen

Dieses Protokoll bietet eine effiziente Kollagenase-Verdauungsmethode für die Isolierung lebensfähiger Adipozyten und stromaler vaskulärer Fraktions-SVF-Zellen aus menschlichem viszeralem Fett in einem einzigen Prozess, einschließlich einer Methodik zur Gewinnung hochwertiger RNA aus Adipozyten und einer Phänotypisierung von SVF-Makrophagen durch Färbung mehrerer membrangebundener Marker für die Analyse durch Durchflusszytometrie.

Isolierung lebensfähiger Adipozyten und stromaler vaskulärer Fraktion aus menschlichem viszeralem Fettgewebe, geeignet für RNA-Analyse und Makrophagen-Phänotypisierung

Hier bieten wir ein praktisches Verfahren zur Präparierung und Durchführung histologischer und Genexpressionsanalysen von murinem supraklavikulärem braunem Fettgewebe.

Dissektion, histologische Verarbeitung und Genexpressionsanalyse von murinem supraklavikulärem braunem Fettgewebe

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung von RNA aus definierten histologischen Regionen von paraformaldehydfixiertem, mit Optimal Cutting Temperatur eingebettetem Mauslebergewebe mittels Laser-Capture-Mikrodissektion, was eine gezielte nachgeschaltete Genexpressionsanalyse ermöglicht.

Laser-Capture-Mikrodissektion von paraformaldehydfixiertem Mauslebergewebe zur RNA-Analyse

Lernen Sie die Sammlung von weißem Fettgewebe bei Mäusen und die Isolierung hochwertiger RNA für Genexpressionsstudien in Stoffwechsel und Molekularbiologie. Diese Methode ermöglicht zuverlässige Analysen.

Maus Fettgewebe Erhebung und Verarbeitung für die RNA-Analyse

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