Maus Fettgewebe Erhebung und Verarbeitung für die RNA-Analyse

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine adäquate Probenentnahme von weißen Fettgewebedepots von verschiedenen Mäusen sicherzustellen und eine hohe Menge an qualitativ hochwertiger RNA aus dem Gewebe zu isolieren. Diese Methode kann zentrale Fragen aus den Bereichen Metabolismus, Biochemie und Molekularbiologie beantworten, die sich beispielsweise auf die Genexpression im Fettgewebe von behandelten oder genetisch veränderten Mäusen beziehen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Isolierung großer Mengen hochwertiger RNA aus Fettgewebe ermöglicht, das typischerweise einen niedrigen RNA-Gehalt aufweist.

Emilie Pepin, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin aus meinem Labor, wird das Verfahren vorführen. Nach dem Einschläfern einer Maus schneiden Sie die Haut über der Linea alba gemäß dem Textprotokoll und machen dann zwei Schnitte von etwa zwei Zentimetern von der Mitte des Brustkorbs in Richtung des rechten Arms und in der Nähe der Geschlechtsorgane über der rechten Hintergliedmaße. Dehnen Sie eine Ecke der geöffneten Haut und stecken Sie sie mit einer 22-Gauge-Nadel auf das Pad.

Stecke dann die andere Ecke fest. Führen Sie mit einer chirurgischen Schere, die so flach wie möglich auf der Haut liegt, eine stumpfe Dissektion des subkutanen Bauchfetts (SCF) durch und übertragen Sie es dann auf ein vorgeschnittenes Stück Aluminiumfolie. Wiederholen Sie die Dissektion für die linke Seite des Tieres.

Ziehen Sie dann sowohl die linken als auch die rechten gesammelten Fettpolster in die Aluminiumfolie und frieren Sie die Probe mit flüssigem Stickstoff ein. Um Zugang zum viszeralen Fettgewebe zu erhalten, wird der Bauchmuskel entlang der Linea alba durchtrennt. Machen Sie dann auf beiden Seiten einen Schnitt in den Bauchmuskeln von den Genitalien zum Rücken der Maus.

Das Fett um die Fortpflanzungsorgane ist das perigonadale Fett oder PGF. Löse die linken und rechten Fettpolster vom Nebenhoden, den Hoden und dem Ductus deferens ab und übertrage sie auf die vorbeschriftete Alufolie. Frieren Sie die Probe dann in flüssigem Stickstoff ein.

Beginnen Sie mit der linken Seite und legen Sie die Nieren frei, indem Sie den Darm von der Bauchhöhle auf die rechte Seite bewegen. Das Fettgewebe, das hier die Niere und die Nebennieren umgibt, ist das perirenale Fett oder PRF. Isolieren und entfernen Sie die Nebennieren, bevor Sie das PRF sammeln.

Dies kann mühsam sein, da sie nur ein bisschen rosa sind als das Fettgewebe. Isolieren Sie nun das PRF von der hinteren Muskelwand und durchtrennen Sie den Harnleiter, die Nierenarterie und die Vene, die das PRF und die Niere vom Rest des Körpers trennt. Isolieren Sie dann das PRF von der Niere, indem Sie die Nierenkapsel durchtrennen und entfernen.

Nachdem Sie den rechten PRF isoliert haben, übertragen Sie die Probe mit dem Gewebe von der linken Seite auf die Aluminiumfolie und verwenden Sie flüssigen Stickstoff, um die Proben einzufrieren. 1,5 Milliliter RNasefreie konische Röhrchen, einen Mörser und Stößel sowie einen Spatel in flüssigem Stickstoff gemäß dem Textprotokoll kühlen. Legen Sie die Fettgewebeprobe in den Mörser und heben Sie den Stößel mit einigen Lagen braunem Papier aus dem flüssigen Stickstoff und setzen Sie ihn in den Mörser ein.

Während du den Stößel mit dem Papier hältst, schlage mit dem Hammer ein- oder zweimal auf die Oberseite des Stößels. Anschließend wird die Probe mit einer rotierenden Bewegung zerkleinert, bis ein feines Pulver entsteht. Entfernen Sie dann den Stößel, nehmen Sie den Spatel aus dem flüssigen Stickstoff und füllen Sie die Probe damit in das entsprechende vorgekühlte konische 1,5-Milliliter-Röhrchen um.

Tauchen Sie den Spatel von Zeit zu Zeit wieder in flüssigen Stickstoff, um ein Schmelzen der Probe zu verhindern. Bewahren Sie das konische Röhrchen außerdem auf Trockeneis auf, um ein Auftauen der Probe zu verhindern. Füllen Sie das konische Röhrchen zu etwa 2/3 mit gemahlener Probe, um eine ausreichende RNA-Ausbeute zu erzielen.

Bereiten Sie dann die restlichen Proben gemäß dem Textprotokoll vor. Entnehmen Sie unter einer Chemikalienhaube und mit einem Laborkittel, Handschuhen und einer Schutzbrille eine gemahlene Probe aus flüssigem Stickstoff. Öffnen Sie langsam das Röhrchen und fügen Sie 500 Mikroliter Phenollösung hinzu.

Schließen Sie den Deckel des Röhrchens und wirbeln Sie es etwa fünf Sekunden lang bei maximaler Geschwindigkeit auf, dann öffnen Sie das Röhrchen langsam und vorsichtig, um den Druck vom Stickstoff abzulassen. Das Geräusch von Luft, die aus der Röhre austritt, ist zu hören. Pipettieren Sie weitere 500 Mikroliter Phenollösung in das Röhrchen.

Wirbeln Sie es dann und öffnen Sie es langsam wie zuvor. Wirbeln Sie die Probe, bis sie vollständig aufgelöst ist. Öffnen Sie dann das Röhrchen, um den Druck abzulassen, bevor Sie weitere Proben verarbeiten.

Sind alle Proben verarbeitet, werden sie kurz bei maximaler Geschwindigkeit gewirbelt und fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 12.000 G und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Bringen Sie dann die Röhren wieder auf Raumtemperatur.

Um eine Kontamination zu vermeiden, verwenden Sie für jede Probe eine P1000-Pipette mit gefilterter Spitze, um so viel RNA wie möglich aus der mittleren rosa Schicht zu isolieren, indem Sie die Lipidphase in der Nähe der Seite des Röhrchens durchstechen. Geben Sie die RNA in die neuen konischen Röhrchen, ohne die Seiten der Röhrchen zu berühren, um eine Übertragung von Lipiden zu verhindern, die an der Außenseite der Spitze vorhanden sind. Geben Sie 200 Mikroliter reines Chloroform zu jeder Probe und mischen Sie die Röhrchen 15 Sekunden lang durch Inversion.

Nachdem Sie die Proben 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert haben, zentrifugieren Sie die Röhrchen 15 Minuten lang bei 12.000 G und vier Grad Celsius und bringen Sie die Röhrchen wieder auf Raumtemperatur. Verwenden Sie für jede Probe eine P1000-Pipette und filtrierte Spitzen, um so viel wässrige transparente RNA-haltige Top-Phase wie möglich in den zweiten Satz entsprechender konischer Röhrchen zu übertragen. Geben Sie anschließend 500 Mikroliter 100%iges Isopropanol zu jeder Probe und mischen Sie die Röhrchen 15 Sekunden lang durch Inversion.

Inkubieren Sie die Proben dann 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie die Röhrchen 10 Minuten lang bei 12.000 G und vier Grad Celsius, bevor Sie die Röhrchen wieder auf Raumtemperatur bringen. Entsorgen Sie das Isopropanol, indem Sie es aus jeder Tube gießen.

Geben Sie nun einen Milliliter 75%Ethanol zu jeder Probe und wirbeln Sie die Röhrchen kurz bei maximaler Geschwindigkeit durch. Zentrifugieren Sie die Proben dann fünf Minuten lang bei 7.500 G und vier Grad Celsius. Nachdem Sie die Proben geschleudert und auf Raumtemperatur gebracht haben, entsorgen Sie das 75%ige Ethanol, indem Sie jedes Röhrchen umdrehen und anzünden, indem Sie es gegen braunes Papier klopfen, um alle Ethanolreste zu entfernen.

Lassen Sie den Deckel offen und trocknen Sie das RNA-Pellet etwa 15 bis 20 Minuten an der Luft. Nachdem Sie die Größe der RNA-Pellets bewertet haben, fügen Sie jeder Probe 10 bis 25 Mikroliter RNase-freies Wasser hinzu. Inkubieren Sie die Proben in einem Wärmeblock bei 60 Grad Celsius für fünf Minuten.

Wirbeln Sie dann kurz in den Röhren. Inkubieren Sie die Proben weitere fünf Minuten lang im selben Heizblock. Drehen Sie dann schnell alle Proben und legen Sie sie sofort auf Eis.

Führen Sie die RT-PCR für die Genexpression im Fettgewebe gemäß dem Textprotokoll durch. Wie erwartet hatten Mäuse mit der fettreichen Diät im Vergleich zu Wurfgeschwistern mit der normalen Diät ein erhöhtes Körpergewicht und eine Gewichtszunahme. Diese Beobachtungen gingen einher mit einer mehr als zweifachen Zunahme des Gewichts von PGF, PRF und SCF bei adipösen Mäusen im Vergleich zu Mäusen mit normaler Ernährung.

Diese Tabelle zeigt, dass für jedes weiße Fettgewebe die RNA-Isolierung durch Phenollösung Proben mit einem OD260 über OD280 von etwa 2,0 ergab, was als rein für RNA gilt. Wie in diesem Balkendiagramm zu sehen ist, zeigten die Echtzeit-PCR-Daten, dass die Leptin-mRNA-Expression bei PGF, PRF und SCF von adipösen Mäusen signifikant höher war als bei Mäusen mit normaler Ernährung. Die beobachteten Unterschiede in der Leptin-mRNA-Expression waren nicht auf eine Variation von s16 zurückzuführen, dem Referenzgen, das zur Normalisierung der Ergebnisse zwischen den beiden Gruppen von Mäusen verwendet wurde, da die CT-Werte nicht verändert wurden.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in vier Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, während des RNA-Extraktionsverfahrens in einer RNase-freien Umgebung zu arbeiten. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die realtime PCR-Amplifikation durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie z.B. Genexpressionsmodifikationen zu beantworten.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet des Stoffwechsels, um die Modulation des Fettgewebes im Zusammenhang mit Fettleibigkeit und Diabetes bei Nagetieren zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie verschiedene Fettpolster isolieren und RNA aus ihnen isolieren können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit der Phenollösung äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen eines Laborkittels und von Handschuhen getroffen werden sollten.