Name: Maus Fettgewebe Erhebung und Verarbeitung für die RNA-Analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Lernen Sie die Sammlung von weißem Fettgewebe bei Mäusen und die Isolierung hochwertiger RNA für Genexpressionsstudien in Stoffwechsel und Molekularbiologie. Diese Methode ermöglicht zuverlässige Analysen.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Fettleibige Mäusen ergab folgenden HF-Diät ernähren, Körper und weißen Fettgewebe Gewichte im Vergleich zu Mäusen eine N-Diät gefüttert zugenommen haben. RNA mit Phenol Lösung ergab Proben mit guter Reinheit extrahiert. Leptin ist ein Adipokine produziert in erster Linie von Fettgewebe und positiv korrelieren mit fat mass16bekannt. Wie erwartet erhöht Leptin mRNA Ausdruck bei fettleibigen Mäusen in Tateinheit mit ihrer Fettmasse.
Diese Methode hat mehrere wichtige Schri...

Adipositas ist eine weltweite Epidemie Komplikationen wie Typ 2 Diabetes1führen kann. Diät-induzierten fettleibig und gentechnisch veränderten Tiermodelle sind häufig in Übergewicht und die damit verbundenen Komplikationen für die Forschung verwendet. Traditionell weißen Fettgewebe ist bekannt als ein Ablagefach für überschüssige Energie und besteht hauptsächlich aus Lipiden während braunes Fettgewebe Energie in Wärme2,3 wandelt. Fettgewebe ist dynamisch erweitern und verkleinern abhängig von vielen Faktoren wie Ernährung und körperliche Aktivität. Um Faktoren auf diese Veränderungen zu bestimmen, sind daher ausreichend Fettgewebe Erhebung und Verarbeitung erforderlich4.
Unter weißen Fettgewebe ist es allgemein anerkannt, dass viszeralen und subkutanen Fettdepots unterschiedliche Eigenschaften wie die anatomische Lokalisierung haben und Funktion2,5. Folglich muss zur Vermeidung von widersprüchlichen Ergebnissen oder große Variabilität Aufmerksamkeit getroffen werden, um Kreuzkontaminationen zwischen diesen verschiedenen Fettdepots beim Fettpolster zu sammeln.
Darüber hinaus gibt es drei große Herausforderungen, wenn Sie RNS oder Protein aus Mäusen weißen Fettgewebe zu isolieren. Erstens ist die Fettpolster bei fettleibigen Mäusen sammeln nicht leichte Aufgabe wie die Grenze trennt verschiedene weiße Fettdepots nicht immer klar, im Gegensatz zu anderen Organen wie Niere und Herz6. Zweitens wegen der hohen Fettgehalt des Fettgewebes, während RNS oder Protein isoliert, eine Schicht von Lipiden obenauf schwimmt und verhindert den direkten Zugriff auf die Probe. Drittens: im Gegensatz zu braunen Fettgewebe oder anderen Geweben, weißen Fettgewebe hat erheblich niedrigeren Gehalt an RNA und Protein und dies ist von großer Bedeutung bei der Verwendung von junger Mäusen, Mäuse eine normale (N) Diät gefüttert und Mäuse, die voraussichtlich haben geringe Dicke Massen (d.h. KO Modelle, Behandlung mit Medikamenten, Übung, Training, etc..) 7 , 8.
Daher ist es wichtig, auswählen der geeigneten Methode, die RNA aus Fettgewebe zu isolieren. Alternative Methoden zur Phenol/Chloroform Extraktion sind kommerzielle Kits. Sie basieren in der Regel auf eine anfängliche Phenol Extraktionsschritt, gefolgt von RNA-Reinigung auf eine Spalte9. Diese Kits sind in der Regel teurer und Proben von geringeren Ertrag zu geben, während die RNA-Qualität Variable möglicherweise jedoch sind weniger zeitaufwändig. Einer der größten Vorteile der Phenol-Lösung/Chloroform Extraktion hier beschriebene ist jedoch die Möglichkeit der Isolierung von RNA, DNA und Proteine aus einer einzigen Probe10. Da Mäuse Fettpolster meist klein sind und kleine Menge von RNA und Proteinen (insbesondere schlanke Maus-Modellen geben), maximieren Sie diese Protokolle die Daten, die man aus einer kleinen Probe abbekommt.
Das Ziel dieses Papiers ist es, im Detail beschreiben eine Methode, um adäquate Probenentnahme aus drei Mäuse weißen Fettgewebe Depots sowie Menge und Qualität der RNA Isolierung zu gewährleisten. RNA durch Anschluss an dieses Protokoll erhalten kann verwendet werden, um Echtzeit-PCR-Tests durchzuführen. Dieses Protokoll dient nicht zur RNA-Isolierung aus kultivierten primäre Adipozyten.

<table><tbody><tr><td>1 mL Seringes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X TE Lösung (10 mM Tris-HCl und 1 mM EDTA&bull; Na2. pH 8,0)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 G Nadeln</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>26 G Nadeln</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>75% Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blockheizung (Trockenbad)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>C2432-500mL</td><td></td></tr><tr><td>dATP&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Thermowissenschaftliches</td><td>R0141</td><td></td></tr><tr><td>dCTP&nbsp; &nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>R0151</td><td></td></tr><tr><td>dGTP&nbsp; &nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>R0161</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (1 μμ; l)&nbsp;</td><td>Thermowissenschaftliche</td><td>Norm EN0521</td><td></td></tr><tr><td>dTTP&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>R0171</td> Faststart Universal SYBR grün Master (Rox)Roche 4913922001 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Faststart Universal SYBR Green Master (Rox) Fluoreszenzfarbstoff</td><td>Roche</td><td>4913914001</td><td></td></tr><tr><td>Gefilterte Spitzen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzetten&nbsp;</td><td>Instrumentarium</td><td>HB275</td><td></td></tr><tr><td>Mullhammer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diät für fettreiche Nagetiere</td><td>Bio-Serv, Frenchtown, NJ</td><td>F3282</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol&nbsp;</td><td>Laboratoire MAT</td><td>IH-0101</td><td></td></tr><tr><td>Leptin-Forward-PCR-Primer (5'-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3') 10 μM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leptin-Reverse-PCR-Primer (5'-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3') 10 μM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flüssigstickstoff</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maxima Reverse Transkriptase (Enzym und 5x Puffer)</td><td>Thermo scientific</td><td>EP0742</td><td></td></tr><tr><td>Nanoreines Wasser (als Reinstwasser bezeichnet)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitril-Untersuchungshandschuhe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitril-Handschuhe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normale Nagetierdiät</td><td>Harlan Laboratories, Madison, WI</td><td>Harlan 2018</td><td></td></tr><tr><td>P1000 Pipettierer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P2 Pipettierer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P20 Pipettierer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P200 Pipettierer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phenollösung (TRIzol)&nbsp;</td><td>Ambion Life Technologies</td><td>15598018</td><td></td></tr><tr><td>Voridentifizierte Aluminiumfolie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quarz-Spektralphotometer Küvettengestell</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>für PCR-Röhrchenstreifen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gestelle für RT-PCR-Röhrchenstreifen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zufällige Hexamere&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>58875</td><td></td></tr><tr><td>Echtzeit-PCR-Rotor-Gensystem&nbsp;</td><td>Corbett research</td><td>RG-3000 Rotor-Gene Thermocycler</td><td></td></tr><tr><td>Gekühlte Tischzentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RiboLock RNase Inhibitor</td><td>Thermo scientific</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>RNasefreie 1,5 mL Eppendorf Röhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNasefreie 1,5 mL Röhrchen</td><td></td><td></td><td></td>mit Schraubverschluss</tr><tr><td>RNasefreie PCR Röhrchenstreifen (0,2 mL) und Kappen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNasefreies Wasser</td><td>Hyclone</td><td>SH30538.02</td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR-Gerät</td><td>Qiagen</td><td>Rotor-Gene Corbett 3000</td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR-Röhrchenstreifen (0,1 mL) und Kappen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S16 Forward PCR Primer (5'-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3') 10 μM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S16 Reverse PCR Primer (5' ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3') 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td>Biochrom</td><td>Ultrospec 3100 pro</td><td></td></tr><tr><td>Mörser und Stößel</td><td></td><td></td><td></td>aus Edelstahl</tr><tr><td>Chirurgische Pads</td><td>Hausgemachte eine Schaumstoffplatte, die in eine saugfähige Einwegunterlage</td><td></td><td></td>eingewickelt</tr> ist <tr><td>Chirurgische Schere&nbsp;</td><td>Intrumentarium</td><td>130.450.11</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler&nbsp;</td><td>Biometra</td><td>Thermocycler</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Mischer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wiegespatel</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

maus fettgewebe erhebung und verarbeitung für die rna-analyse

Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis

Im Vergleich zu anderen Geweben, hat weißen Fettgewebe einen deutlich weniger RNA und Protein Inhalt für downstream-Anwendungen wie Real-Time PCR und Western-Blot, da es meist Lipide enthält. RNA Isolation aus Fettgewebe Proben ist auch herausfordernd, da zusätzliche Schritte erforderlich sind, um diese Lipide zu vermeiden. Hier präsentieren wir Ihnen ein Verfahren um drei anatomisch unterschiedlichen weißen Fettgewebe von Mäusen, verarbeiten diese Proben und durchführen von RNA Isolierung zu sammeln. Wir beschreiben weiter die Synthese der cDNA und gen-Ausdruck-Experimente mittels Real-Time PCR. Das hiermit beschriebene Protokoll ermöglicht die Reduzierung der Kontamination von Haar und Blut auf Fettpolster sowie Cross-Kontamination zwischen verschiedenen Fettpolster bei der Entnahme von Gewebe des Tieres. Es wurde auch optimiert, um angemessene Quantität und Qualität der extrahierten RNA zu gewährleisten. Dieses Protokoll kann weit angewendet werden, um jede Maus-Modell wo Fettgewebe Proben für routinemäßige Experimente wie Real-Time PCR erforderlich sind, aber ist nicht zur Isolation von primären Adipozyten Zellkultur.

Nach der Autopsie Prozedur wurden drei weißen Fettgewebe gesammelt und aus den zwei Gruppen von Mäusen (N und HF Diät gefüttert Mäuse) gewichtet. Wie erwartet, stieg Mäuse auf der HF-Diät endgültige Körpergewicht und Gewichtszunahme im Vergleich zu Wurfgeschwistern N Diät (Tabelle 1). Diese Beobachtungen wurden begleitet von mehr als eine 2-fache Erhöhung des Gewichts der SCF, PGF und PRF bei fettleibigen Mäusen im Vergleich zu den N-Diät.
<p class="jove_content" fo:k...

Dieses Papier soll eine schrittweise Anleitung zu sammeln verschiedene weißen Fettgewebe von Mäusen, die Fett Proben zu verarbeiten und RNA extrahieren zu präsentieren.

Maus Fettgewebe Erhebung und Verarbeitung für die RNA-Analyse

Compared to other tissues, white adipose tissue has a considerably less RNA and protein content for downstream applications such as real-time PCR and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine adäquate Probenentnahme von weißen Fettgewebedepots von verschiedenen Mäusen sicherzustellen und eine hohe Menge an qualitativ hochwertiger RNA aus dem Gewebe zu isolieren. Diese Methode kann zentrale Fragen aus den Bereichen Metabolismus, Biochemie und Molekularbiologie beantworten, die sich beispielsweise auf die Genexpression im Fettgewebe von behandelten oder genetisch veränderten Mäusen beziehen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Isolierung großer Mengen hochwertiger RNA aus Fettgewebe ermöglicht, das typischerweise einen niedrigen RNA-Gehalt aufweist.Emilie Pepin, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin aus meinem Labor, wird das Verfahren vorführen. Nach dem Einschläfern einer Maus schneiden Sie die Haut über der Linea alba gemäß dem Textprotokoll und machen dann zwei Schnitte von etwa zwei Zentimetern von der Mitte des Brustkorbs in Richtung des rechten Arms und in der Nähe der Geschlechtsorgane über der rechten Hintergliedmaße. Dehnen Sie eine Ecke der geöffneten Haut und stecken Sie sie mit einer 22-Gauge-Nadel auf das Pad.Stecke dann die andere Ecke fest. Führen Sie mit einer chirurgischen Scher

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Die Profilierung der RNA-Expression in diskreten Regionen des Mausgehirns erfordert eine präzise und reproduzierbare Strategie zur Gewinnung von Gewebeproben. Hier wird ein Protokoll beschrieben, das sowohl die koronare Schnittführung des Gehirns als auch die mikrodissektionsbasierte Gewebeentnahme mithilfe eines Gewebecorers nutzt. Die Ausbeute und Qualität der gesamten RNA aus den resultierenden Proben bestätigt die Eignung der dargestellten Methode.

Non-Laser Capture Microscopy Ansatz für die Mikrodissektion von Discrete-Maus Hirnregionen für Gesamt-RNA Isolierung und Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Wir berichten über ein Verfahren zur Isolierung von RNA mit hoher Integrität aus der Ribonuklease-reichen Bauchspeicheldrüse der Maus.

RNA-Isolierung aus Maus Pankreas: Eine Ribonuklease-reichen Gewebe

Aufeinanderfolgende Kryo-Abschnitte werden gesammelt, um histologische Anwendungen und Anreicherung von RNA für Genexpressionsmessungen mit benachbarten Regionen aus einer einzigen Maus Skelettmuskel ermöglichen. 30 mg gepoolt Kryoabschnitte und Messungen werden direkt im Vergleich über mehrere Anwendungen hinweg - Qualitativ hochwertige RNA wird aus 20 erhalten.

Kryoschneiden von benachbarten Regionen eines einzelnen Maus Skelettmuskel für die Genexpression und histologische Analysen

Hier beschreiben wir ein Protokoll für eine reproduzierbare Laser Capture Microdissection (LCM) zur Isolierung von trabekuläre Geflecht (TM) für die nachgelagerten RNA-Analyse. Die Fähigkeit, Veränderungen in der Genexpression im TM zu analysieren hilft beim Verständnis der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der TM-okulären Erkrankungen.

Laser Capture Microdissection von hochreinen trabekuläre Geflecht aus Maus Augen für Gene Expression Analysis

Eine kryogene Pulverisierungsmethode zur Verarbeitung von murinen Pfoten mit einer flüssigen Stickstoff-Gefriermühle wurde entwickelt, um die Ausbeute und Qualität der aus den Geweben extrahierten RNA oder Proteine zu verbessern und die Analyse molekularer Profile im Zusammenhang mit entzündlichen Antworten.

Ein Kryo-Pulverisierungsprotokoll zur Verarbeitung von Mauspfoten zur Bewertung molekularer Wege von Gewebeentzündungen in einem Kollagen-induzierten Arthritis-Modell

Diese Veröffentlichung beschreibt ein Protokoll zur Isolierung von Kernen aus ausgereiften Adipozyten, zur Reinigung durch fluoreszenzaktivierte Sortierung und zur einzelligen Transkriptomik.

Isolierung von Adipose-Gewebekernen für einzellige Genomanwendungen

Dieses Protokoll bietet eine effiziente Kollagenase-Verdauungsmethode für die Isolierung lebensfähiger Adipozyten und stromaler vaskulärer Fraktions-SVF-Zellen aus menschlichem viszeralem Fett in einem einzigen Prozess, einschließlich einer Methodik zur Gewinnung hochwertiger RNA aus Adipozyten und einer Phänotypisierung von SVF-Makrophagen durch Färbung mehrerer membrangebundener Marker für die Analyse durch Durchflusszytometrie.

Isolierung lebensfähiger Adipozyten und stromaler vaskulärer Fraktion aus menschlichem viszeralem Fettgewebe, geeignet für RNA-Analyse und Makrophagen-Phänotypisierung

Hier bieten wir ein praktisches Verfahren zur Präparierung und Durchführung histologischer und Genexpressionsanalysen von murinem supraklavikulärem braunem Fettgewebe.

Dissektion, histologische Verarbeitung und Genexpressionsanalyse von murinem supraklavikulärem braunem Fettgewebe

Dieses Protokoll beschreibt die Trennung des Epithels der Maus-Augenlinse und der Volumenmasse der Faserzelle, gefolgt von der RNA-Isolierung und der qPCR-Analyse. Diese Methode ermöglicht die Trennung von Linsenzellkompartimenten für eine detailliertere Analyse des Transkriptoms und der biologischen Prozesse in Epithelzellen im Vergleich zu differenzierten Faserzellen.

RNA-Isolierung aus dem Epithel der Augenlinse der Maus und den Massenmassen von Faserzellen

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung von RNA aus definierten histologischen Regionen von paraformaldehydfixiertem, mit Optimal Cutting Temperatur eingebettetem Mauslebergewebe mittels Laser-Capture-Mikrodissektion, was eine gezielte nachgeschaltete Genexpressionsanalyse ermöglicht.

Laser-Capture-Mikrodissektion von paraformaldehydfixiertem Mauslebergewebe zur RNA-Analyse

Lernen Sie die Sammlung von weißem Fettgewebe bei Mäusen und die Isolierung hochwertiger RNA für Genexpressionsstudien in Stoffwechsel und Molekularbiologie. Diese Methode ermöglicht zuverlässige Analysen.

Maus Fettgewebe Erhebung und Verarbeitung für die RNA-Analyse

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