Erkennung von Waschmittel-Sensitive Interaktionen zwischen Membranproteine

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, detergenzienempfindliche Wechselwirkungen zwischen Membranproteinen oder anderen Proteinen zu detektieren. Dieses Verfahren erfordert, dass ein Protein Histidin-markiert und in den Zellen überexprimiert wird, während das andere ein Myc-markiertes Peptid ist. Diese Methode kann helfen, Fragen im Bereich der Biochemie zu beantworten, die wichtige Studien zur Proteininteraktion beinhalten.

Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Fähigkeit, die Wechselwirkung zwischen Membranproteinen auf detergenzienempfindliche Weise zu detektieren. Das Verfahren ist schnell und einfach. Obwohl diese Methode Einblicke in die Wechselwirkungen von Membranproteinen geben kann, kann sie auch zur Untersuchung schwacher Proteininteraktionen verwendet werden.

Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmals, als wir die Interaktion zwischen den Membranproteinen Saltilin und GLUT4 überprüfen wollten, aber Versuche, sie aus der Säugetierlyse zu co-immunpräzipitieren, blieben erfolglos. Um eine Bestellung für das Peptid aufzugeben, wählen Sie die Zielsequenz des Peptids aus, die für die Interaktion entscheidend ist, und fügen Sie ein myc-Epitop am Ende oder C-Terminus der Sequenz hinzu. Sobald das Peptid angekommen ist, pepare 100 Mikrogramm pro Milliliter Arbeitslösung des Peptids in ultrareinem Wasser.

Drei 3T3-L1-Präadipozytenzellen in vier 10-Zentimeter-Kulturschalen aussäen und im Inkubator aufbewahren. Als nächstes transfizieren Sie zwei Kulturschalen, wobei das Zielprotein mit 6X-Histodyn markiert ist, und markieren Sie es als HISP in den anderen beiden Schalen mit zwei Kontrollplasmiden und markieren Sie es als WT. Lassen Sie die Zellen nach der Transfektion 48 Stunden lang im Inkubator, um eine Konfluenz von 80 bis 90 % zu erreichen. Um das Zelllysat herzustellen, waschen Sie die Zellen dreimal auf Eis mit 10 Millilitern 1X gepufferter Kochsalzlösung, die um vier Grad Celsius gekühlt wird.

Fügen Sie dann jedem von ihnen 500 Mikroliter Lysepuffer hinzu. Lösen Sie dann die Zellen mit einem Zellschaber von den Schalen, um das Lysat vorzubereiten. Übertragen Sie das aus jeder Kulturschale vorbereitete Zelllysat in vier separate 1,5-Millimeter-Röhrchen und beschriften Sie alle Röhrchen.

Führen Sie dann das Zelllysat fünfmal durch eine Spritze mit einer 26-Gauge-Nadel auf und ab, um die gesamte Zelllyse zu gewährleisten. Zentrifugieren Sie dann die zellulären Lysate bei 16000xg für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Die Überstände werden in vier identisch beschriftete neue Röhrchen überführt.

Für zukünftige Experimente zur Fehlerbehebung und Kontrolle aliquotieren Sie 20 Mikroliter des Zelllysats und lagern Sie es bei 20 Grad Celsius. Für die spätere Verwendung titern Sie den Waschpuffer bei PH8 mit Salzsäure, um PH6 zu erhalten, und lagern den Puffer bei vier Grad Celsius. Um eine homogene Suspension der Kobaltkügelchen herzustellen, schwenken Sie die Flasche vorsichtig.

Übertragen Sie dann 40 Mikroliter Kobaltperlensuspension auf alle einzeln gekennzeichneten vier Röhrchen. Geben Sie nach dem Hinzufügen der Kobaltkügelchen einen Milliliter Lysepuffer in die Röhrchen. Zentrifugieren Sie dann die Röhrchen fünf Sekunden lang bei 1000 xg.

Entsorgen Sie den Überstand und pipettieren Sie 40 Mikroliter Lysepuffer in die abgesetzten Kügelchen. Dann wird das Zelllysat in die entsprechenden Röhrchen überführt und 90 Minuten lang bei vier Grad Celsius auf einem Röhrchenrotator inkubiert. Nach 90 Minuten zentrifugieren Sie die Proben fünf Sekunden lang bei 1000 x g.

Sammeln Sie dann den Überstand mit der Bezeichnung Flowthrough-1 und lagern Sie ihn bei 20 Grad Celsius. Geben Sie anschließend 500 Mikroliter des Waschpuffers mit PH8 zu den einzelnen Röhrchen und suspendieren Sie die Kügelchen vorsichtig wieder. Zentrifugieren Sie die Röhrchen fünf Sekunden lang bei 1000xg und stoßen Sie die Überstände aus.

Geben Sie dann Waschpuffer mit PH8 mit oder sechs zu den Röhrchen, entsprechend den Etiketten, und suspendieren Sie die Kügelchen gut. Zentrifugieren Sie die Röhrchen fünf Sekunden lang bei 1000xg und stoßen Sie die Überstände aus. Bereiten Sie ein Mikrogramm pro Milliliter Arbeitslösung des Peptids und einen Wasserpuffer mit PH6 oder acht vor.

Geben Sie dann 100 Mikroliter der Peptidlösung zu den gewaschenen Kügelchen, die einem ähnlichen pH-Wert entsprechen. Inkubieren Sie die Kügelchen dann 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius auf einem Röhrenrotator. Nehmen Sie dann vier Mikrosäulen, beschriften Sie sie und legen Sie die Säulen in Sammelröhrchen mit der Bezeichnung Flowthrough-2. Nachdem die Inkubation beendet ist, fügen Sie die Inkubationsmischung zu den Säulen hinzu.

Lassen Sie die Lösung durch die Schwerkraft passieren und sammeln Sie die Probe aus der Strömung. Legen Sie die Säulen in neue Auffangröhrchen und lagern Sie sie bei 20 Grad Celsius. Lassen Sie dann 500 Mikroliter Waschpuffer mit entweder PH6 oder acht durch Gravitationsströmung durch die einzelnen Säulen und verwerfen Sie den Durchfluss.

Wiederholen Sie diesen Schritt viermal. Zentrifugieren Sie die Röhrchen fünf Sekunden lang bei 1000xg. Setzen Sie die Säule in das neue Entnahmeröhrchen mit der Bezeichnung Elution ein.

Es ist wichtig, die Kügelchen in allen Röhrchen sehr sorgfältig und gleichmäßig zu waschen, um das ungebundene Peptid loszuwerden. Zu den gewaschenen Kügelchen fügen Sie 40 Mikroliter Tricin-Probenpuffer mit Beta-Mercaptoethanol hinzu. Lassen Sie es 20 Minuten bei Raumtemperatur ziehen.

Zentrifugieren Sie die Säule zwei Minuten lang bei 8000 xg. Entsorgen Sie die Säulen und erhitzen Sie die Sammelrohre 10 Minuten lang bei 100 Grad Celsius. Und dann zentrifugieren Sie es fünf Sekunden lang bei 1000xg.

Alternativ können Sie 40 Mikroliter Elutions-Imidazol-Puffer zu den gewaschenen Kügelchen geben und 20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Nachdem die Inkubation beendet ist, zentrifugieren Sie die Röhrchen zwei Minuten lang bei 8000xg. Entsorgen Sie die Säulen und fügen Sie 40 Mikroliter Tricinprobe hinzu.

Erhitzen Sie die Auffangröhrchen 10 Minuten lang bei 100 Grad Celsius und zentrifugieren Sie sie dann fünf Sekunden lang bei 1000 xg. Verwenden Sie die handelsüblichen 10-20%igen Tricin-Gradientengele. Verwenden Sie Tris/Tricine/SDS-Laufpuffer, laden Sie dann jeweils 20 Mikroliter der eluierten Proben und Gesamtlysate auf das Gel und starten Sie den Betrieb der Elektrophoreseeinheit.

Sobald die Elektrophorese abgeschlossen ist, verwenden Sie einen mit 20 % Methanol zugesetzten Transferpuffer, um das Material aus dem Gel auf eine 0,45 Mikrometer große Nitrozellulosemembran zu übertragen. Nachdem Sie die Membran blockiert haben, schneiden Sie sie horizontal ab. Als nächstes untersuchen Sie den oberen Teil der Membran mit Anti-His-P-Antikörper in der unteren Hälfte der Membran mit Anti-Myc.

Um die Wechselwirkung zwischen immobilisiertem Sortilin auf Kobaltkügelchen in GLUT4 zu untersuchen, wurde eine Immunoblot-Analyse durchgeführt. Zelluläre Lysate und Eluate wurden aus Wildtyp- und Sortilin-myc/His-markierten transfizierten 3T3-L1-Zellen gewonnen und dann auf die SDS-Seite geladen. Der Blot wurde mit einem Anti-Myc-Antikörper untersucht.

Der Blot zeigt eine 110 Kilodotin Sortili-myc/His-markierte und fünf Kilotin myc-first luminale Schleife-GLUT4 aus den transfizierten Eluaten. Um die Bedeutung des PH-Werts und die Wechselwirkung zwischen Sortilin immobilisiert auf Kobaltkügelchen und GLUT4 zu untersuchen, wurde eine Immunoblot-Analyse durchgeführt. In diesem Assay wurde die Myc-first luminale Schleife GLUT4 mit Kügelchen inkubiert, die mit Sortilin-myc/His-markierten Proteinen sowohl bei PH6 als auch bei acht immobilisiert waren.

Der Blot zeigt eine deutliche Wechselwirkung zwischen Sortilin-myc/His und myc-first luminaler Schleife GLUT4 sowohl bei PH6 als auch bei acht aus den Eluaten, die aus den Sortilin-myc/His-markierten transfizierten 3T3-L1-Zellen gewonnen wurden. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in drei bis vier Stunden durchgeführt werden, bis die Proben für die westliche Blutanalyse bereit sind. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, ein Peptid zu entwickeln, das löslich ist, vorzugsweise in Wasser.

Um Ihre Ergebnisse zu verbessern, können andere Methoden wie Immunpräzipitation nach Vernetzung durchgeführt werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Membranprotein- und Proteinwechselwirkungen in einem waschmittelempfindlichen Verfahren erkannt werden können. Es ermöglicht auch, die Wechselwirkung zwischen Proteinfragmenten zu untersuchen.

Sanfter rhythmischer Jazz.