Eine schnelle Silber Färbung Protokoll ermöglicht einfache und effiziente Erkennung von SSR-Marker mit einem Non-denaturierenden Polyacrylamid-Gel

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist die Einführung einer optimierten Silberfärbemethode für den schnellen, einfachen und kostengünstigen Nachweis von SSR-Markern in nicht denaturierenden Polyacrylamid-Gelen. Die schnelle Genotypisierung von SSR-Markern kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in der genetischen Forschung und im Anwendungsbereich zu beantworten, wie z. B. die Analyse der genetischen Vielfalt und die markergestützte Selektion in molekularen Züchtungsprogrammen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie einfach durchzuführen ist, weniger Zeit in Anspruch nimmt und weniger chemische Reagenzien verwendet als andere Protokolle zum Nachweis von SSR-Markern.

Diese Methode vermeidet das Fixieren, Stoppen und mehrere Waschschritte, die in herkömmlichen Protokollen zu finden sind. Und erfordert nur die beiden Hauptschritte Imprägnierung und Entwicklung. Mit diesem Protokoll können klare Bilder erzeugt werden, da es kein Hintergrundrauschen für die eindeutige Erkennung von SSR-Bandenmustern gibt.

Mit dieser Technik kann man etwa 800 DNA-Proben pro Tag untersuchen und sie wurde erfolgreich in der Tabak- und Blütenforschung von Chinakohl eingesetzt. Nach der Zubereitung von PCR-Produkten und Gellösungen gemäß dem Textprotokoll verwenden Sie ein Reinigungsmittel in Leitungswasser, um einen Satz Glasplatten und Abstandshalter zu waschen, gefolgt von einer vollständigen Spülung mit destilliertem Wasser. Legen Sie die Platten zum Trocknen an der Luft auf einen Tellertrockenständer.

Dispergieren Sie einen Milliliter Bind-Silan-Lösung auf der Innenfläche einer rechteckigen Glasplatte und trocknen Sie sie fünf Minuten lang. Dispergieren Sie dann mit einem Tupfer einen Milliliter Repel-Silan auf der Innenfläche einer gekerbten Glasplatte und wischen Sie die überschüssige Lösung mit einem Seidenpapier ab, bevor Sie die Platte fünf Minuten lang an der Luft trocknen lassen. Montieren Sie die Glasplatten mit Abstandshaltern mit der gekerbten Platte oben.

Und verwenden Sie Gießklammern, um beide Seiten der Baugruppe zu klemmen. Gießen Sie anschließend eine angemessene Menge 6%iger nicht denaturierender Polyacrylamid-Gellösung in ein Becherglas für das Plattenset. 20 Mikroliter TEMED und 200 Mikroliter frisches 20%APS hinzufügen und vorsichtig mischen.

Gießen Sie die Lösung sofort und vorsichtig in die zusammengesetzten Glasplatten entlang des Randes der gekerbten Platte und füllen Sie den Raum fast bis zum Rand aus. Und stecken Sie den Kamm ein. Geben Sie dann eine kleine Menge Gellösung über den Kamm und lassen Sie das Gel 30 Minuten bei Raumtemperatur aushärten.

Wenn das Gel vollständig polymerisiert ist, entfernen Sie die Gießklammern und positionieren Sie die in der Elektrophorese-Tankeinheit eingesetzte Platte mit der gekerbten Platte in Richtung des oberen Pufferbehälters. Verwenden Sie große Klemmen, um das Plattenset an der Tankeinheit zu befestigen. Gießen Sie je einen Liter 0,5 x TBE-Puffer in die obere und untere Kammer.

Entfernen Sie dann den Kamm und verwenden Sie eine Pipette oder Spritze, die mit Puffer gefüllt ist, um alle Vertiefungen gründlich zu spülen. Um das Polyacrylamid-Gel zu betreiben, laden Sie etwa einen Mikroliter PCR-Produkt in jede Vertiefung. Laden Sie außerdem eine DNA-Leiter an beide Enden.

Befestigen Sie dann die Sicherheitsabdeckung an der oberen Pufferkammer. Schließen Sie die Kabel an die Stromversorgung an, wobei die Farbe Rot auf Rot und Schwarz auf Schwarz abgestimmt ist. Lassen Sie das Gel bei einer konstanten Spannung von 110 Volt laufen, bis der Farbstoff eine definierte Position erreicht.

Normalerweise für ca. 70 Minuten. Öffnen Sie nach der Elektrophorese das Ventil und lassen Sie den Puffer aus der oberen Kammer in ein großes Becherglas ab. Lösen Sie die Seitenklemmen und entfernen Sie die Platte aus dem Gerät.

Trennen Sie dann mit einem Spatel vorsichtig die gekerbte Glasplatte an einer Seite und stellen Sie sicher, dass das Gel an der anderen mit Bind-Silan beschichteten Glasplatte haftet. Bereiten Sie anschließend einen Liter frische Imprägnierlösung vor, indem Sie 1,5 Gramm Silbernitrat in einem Liter destilliertem Wasser auflösen. Bereiten Sie dann einen Liter frische Entwicklungslösung vor, indem Sie 10 Gramm Natriumhydroxid in 900 Millilitern destilliertem Wasser auflösen.

Fügen Sie einen Milliliter 37%iges Formaldehyd hinzu und verwenden Sie destilliertes Wasser, um ein Endvolumen von einem Liter einzustellen. Spülen Sie das Gel und die Glasplatte vorsichtig mit reichlich destilliertem Wasser ab, um den Elektrophoresepuffer zu entfernen. Legen Sie dann die Platte mit dem Gel nach oben in eine Plastikschale und tauchen Sie das Gel in einen Liter Imprägnierlösung.

Schütteln Sie das Tablett auf einem Shaker bei 60 U/min vorsichtig für drei bis vier Minuten. Übertragen Sie die Platte aus der Imprägnierlösung in eine andere Schale. Spülen Sie dann mit reichlich destilliertem Wasser die restliche Imprägnierlösung von der Oberfläche der Platte und das Gel zweimal für jeweils drei bis fünf Sekunden ab.

Der Schritt der Gelwäsche nach der Imprägnierung ist entscheidend. Unzureichendes Waschen kann die Ursache für eine unvollständige Entfernung der Imprägnierlösung sein. Und resultieren Sie in einem dunklen Hintergrund.

Legen Sie die Stelle mit dem Gel nach oben in eine andere Schale. Tauchen Sie die Platte in einen Liter Entwicklungslösung und schütteln Sie das Tablett dann vorsichtig bei 50 U/min für etwa drei Minuten. Überwachen Sie das Erscheinungsbild von DNA-Fragmenten und stoppen Sie die Entwicklung, wenn das höchste Verhältnis des Signals von DNA-Fragmenten zum Hintergrundrauschen beobachtet wird.

Die entsprechende Entwicklungszeit ist ein weiterer wichtiger Schritt. Eine Überentwicklung kann zu einem dunkelbraunen Hintergrund mit einem kontrastarmen Bild der DNA-Fragmente führen. Spülen Sie die Platte und das Gel zweimal mit reichlich destilliertem Wasser ab und trocknen Sie die Gelplatte mit Seidenpapier.

Verwenden Sie dann einen Scanner und die entsprechende Software, um das Gel bei 300 DPI zu scannen und die Helligkeit und den Kontrast anzupassen, um eine klare Visualisierung der DNA-Banden zu erhalten. Bewerten Sie abschließend das Bandenmuster der SSR-Marker basierend auf den DNA-Fragmentgrößen im Bild. Die hier vorgestellten PCR-Amplikons wurden unter Verwendung der entsprechenden SSR-Primerpaare in blühendem Chinakohl und Tabak hergestellt.

Nach der Elektrophorese wurden die Polyacrylamidgele mit dem in diesem Video gezeigten Silberfärbeprotokoll gefärbt. Dadurch wurden die Streifenmuster von SSR-Markern eindeutig detektiert. Um die Nachweiseffizienz verschiedener Silberfärbeprotokolle zu vergleichen, wurden PCR-Produkte von SSR-Markern mit PAGE getrennt und mit fünf veröffentlichten Silberfärbeprotokollen und einer sechsten Methode, die in diesem Video demonstriert wird, visualisiert.

Das hier demonstrierte Protokoll hatte das geringste Hintergrundrauschen und den höchsten Kontrast der DNA-Fragmente, so dass es die höchste Bildschärfe erzeugte. Von den sechs getesteten Protokollen nimmt die hier demonstrierte Methode den geringsten Zeitaufwand in Anspruch und erfordert die geringste Anzahl an chemischen Reagenzien und Prozessschritten. Schließlich zeigt diese Abbildung die Sensitivität des Protokolls, gemessen unter Verwendung einer seriellen Verdünnung eines DNA-Markers von 50 bis 2000 bp auf einem nicht denaturierenden Polyacrylamid-Gel von 10 Nanogramm pro Bande in Spur eins auf 9,8 Pikogramm pro DNA-Bande in Spur 11.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in sieben Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, eine Kreuzkontamination von Imprägnier- und Entwicklungslösungen zu vermeiden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher, SSR-Marker schnell zu genotypisieren.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie SSR-Marker in einem nicht denaturierenden Polyacrylamid-Gel mithilfe von Silberfärbung einfach und effizient nachweisen können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit chemischen Reagenzien äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie Handschuhe bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getragen werden sollten.