Name: Eine schnelle Silber Färbung Protokoll ermöglicht einfache und effiziente Erkennung von SSR-Marker mit einem Non-denaturierenden Polyacrylamid-Gel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Lernen Sie ein optimiertes Silberfärbungsprotokoll zur schnellen SSR-Marker-Detektion in nicht-denaturierenden Polyacrylamidgelen. Diese kostengünstige Methode reduziert die Verarbeitungszeit auf nur sieben Minuten.

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Diese Arbeit wurde von der Guangdong Natural Science Foundation of China (2015A030313500), der provinziellen Key International Cooperative Forschungsplattform und der großen wissenschaftlichen Forschung Projekt von Guangdong Higher Education (2015KGJHZ015), die Wissenschaft finanziert und Technologieplan Guangdong Tobacco Monopoly Verwaltung (201403, 201705), der Wissenschaft und Technologieplan von Guangdong China (2016B020201001), der nationalen Innovationssysteme Ausbildungsprojekt für Studierende (201711078001). Erwähnung von Handelsnamen oder kommerzielle Produkte in dieser Publikation ist ausschließlich zum Zweck der Bereitstellung von spezifischen Informationen und bedeutet keine Empfehlung oder Billigung durch das US Department of Agriculture. USDA ist eine Chancengleichheit Anbieter und Arbeitgeber.

1. Vorbereitung der PCR-Produkte von SSR-Marker
<ol><li>Bereiten Sie alle Chemikalien und Reagenzien für PCR-Reaktionen einschließlich Vorlage DNA (30 ng/µL), 2 × PCR-master-Mix (mit 2 × PCR Puffer, 0,4 mM jedes dNTP, 3 mM MgCl2, 0,1 U/µL Taq-DNA-Polymerase und Farbstoffe), 10 µM jedes weiterleiten und reverse Primer , und destilliertem oder entionisiertem Wasser (dH2O). Hinweis: Die SSR-Marker verwendet, die in der vorliegenden Studie wurden PT51333 (Primer Sequenz vorwärts: 5 ' - GCACCTTTGGTTATCCGACA - 3' und rückwärts-Primer Sequenz: 5 "- TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA - 3") und PT50903 (Primer Sequenz vorwärts: 5 ' - AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG - 3' und Primer Sequenz umkehren: 5'-AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3 ") für Tabak und CX-43 (Primer Sequenz vorwärts: 5'-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3" und reverse Primer Sequenz: 5' - AGGGTTCCTTTGGGGTGATA-3 ") und CX-157 (Primer Sequenz vorwärts: 5"- TCGACGCTGACTTCACTGAC-3 ' und reverse Primer Sequenz: 5 "- GGACAGCTTCACACATTTGC - 3") für blühende Chinakohl.</li>
	<li>Verstärkung durch Zugabe von 2 µL der Schablone DNA, 5 µL 2 × PCR-master-Mix, 0,2 µL der einzelnen vorwärts Grundierung und rückwärts-Primer und 2,6 µL dH2O. bereiten Sie 10 µL des PCR-Mixes vor</li>
	<li>PCR-Amplifikation Reaktion in einem Thermocycler mit einem ersten Schritt von 94 ° C für 5 min durchführen, Folgen von 38 Zyklen 45 s bei 94 ° C Denaturierung, 45 s bei 55 ° C für Grundierung glühen und 1 min bei 72 ° C für Erweiterung und eine letzte Verlängerung Schritt von 10 min bei 72 ° C; Speichern Sie PCR-Produkte bei 4 ° C für die spätere Verwendung.</li>
</ol>2. Vorbereitung der Lösungen für Polyacrylamid Gele Gießen
<ol><li>Bereiten Sie 1 L 5 × TBE Puffer durch Auflösung 54 g Tris-base und 27,5 g Borsäure dH2O, 20 mL 0,5 M EDTA (pH 8,0) hinzufügen und anpassen die Lösung zu einem Endvolumen von 1 000 mL mit dH2O. Hinweis: TBE Puffer kann für Monate bei Raumtemperatur gelagert werden.</li>
	<li>2 L 0,5 × TBE Puffer durch Zugabe von 200 mL 5 × TBE-Puffer, dH2O zu einem Endvolumen von 2 L zubereiten und bei Zimmertemperatur aufbewahren.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 6 % nicht denaturierenden Polyacrylamid-Gel Lösung durch Auflösen von 29 g Molekulare Biologie Klasse Acrylamid und 1 g der molekularen Biologie Klasse N, N'-Methylenebisacrylamide in 0,5 × TBE-Puffer zu einem Endvolumen von 500 mL. Decken Sie die Lösung Flasche mit Aluminiumfolie und bei 4 ° C für die spätere Verwendung speichern. Achtung: Acrylamid gilt ein starkes Nervengift und sollte mit Vorsicht behandelt werden. Tragen Sie immer Handschuhe beim Verwiegen von Pulver und Handling-Lösungen, die sie enthalten.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 20 % Ammonium Bleichen (APS) Lösung durch Auflösen von 2 g APS mit dH2O zu einem Endvolumen von 10 mL. Es kann für Monate bei-20 ° C gespeichert werden. Hinweis: der Einfachheit halber können 10 mL APS-Lösung 20 % regelmäñig in 1,5 mL oder 2 mL der Zentrifuge Röhren für die Lagerung bei-20 ° c werden Auftauen und vor Gebrauch gut mischen.</li>
	<li>Bereiten Sie eine verdünnte Bind-Silan-Lösung durch 3 µL der Bind-Silan in 0,997 mL 95 % Ethanol enthält 0,5 % Essigsäure auflösen. Es kann bei 4 ° C wochenlang gespeichert werden. Achtung: Bind-Silan ist giftig, tragen Sie Handschuhe beim Umgang mit der Lösung und Zimmer belüftet zu halten.</li>
</ol>3. Vorbereitung der Polyacrylamid-Gele für Elektrophorese
<ol><li>Waschen Sie einen Satz von Glasplatten und Spacer mit Reinigungsmittel in Leitungswasser, gefolgt von eine komplette Spülung mit dH2O. Luft trocknen die Platten in einem Wäscheständer Teller setzen.</li>
	<li>1 mL der Bind-Silan-Lösung auf der inneren Oberfläche von einer rechteckigen Glasplatte und trocken für 5 min zu zerstreuen. Hinweis: Wenn die Bind-Silan-Lösung auf der Oberfläche der Platte nicht gleichmäßig verteilt ist, das Gel kann abgenommen werden, während der Färbung und eine unbefriedigende Färbung Wirkung zur Folge.</li>
	<li>1 mL abstoßen-Silan auf der Innenfläche einer gekerbten Glasplatte mit einem Tupfer zu zerstreuen, wischen Sie überschüssiges abstoßen-Silan mit Seidenpapier und an der Luft trocknen für 5 Minuten. Hinweis: Wenn das Abstoßen-Silan die Oberfläche der Glasplatte nicht gleichmäßig Beschichten, können sie das Gel beschädigen, durch teilweise entfernen.</li>
	<li>Montieren Sie die Glasplatten mit Abstandshalter mit der gekerbte Platte an der Spitze, und Klemmen Sie beide Seiten der Baugruppe mit casting Klemmen.</li>
	<li>Gießen Sie entsprechende Menge (40 mL) 6 % nicht denaturierenden Polyacrylamid-Gel-Lösung in ein Becherglas auf die Platte 33 cm Breite × 10 cm Höhe und Abstandhalter Dicke von 1,5 mm, 20 µL Tetramethylethylenediamine (TEMED) und 200 µLfresh 20 % APS und vorsichtig mischen. Hinweis: Der entsprechende Betrag (40 mL) Gel-Lösung wurde aus das innere Volumen der beiden Platten mit einer Dicke von Abstandshalter (30 cm × 8,5 cm × 0,15 cm) berechnet. Für die Menge an TEMED und APS für Gel-Polymerisation ist eine Standardverhältnis Gel Lösung TEMED und APS basierend auf dem Referenz-17. Die Gel-Lösung oben beschriebenen ist bei 4 ° c aufbewahrt. Gel-Lösung Lagerung bei Raumtemperatur 20 µL TEMED und 100 µL 20 % APS sollte verwendet werden. Rühren Sie vorsichtig die Mischung der Gel-Lösung mit einem Glas-Stock, Luftblasen in der Lösung zu vermeiden.</li>
	<li>Gießen Sie die Lösung sofort und füllen Sie sorgfältig in die montierten Glasplatten entlang der Kante der gekerbte Platte, den Raum fast bis zum Gipfel, und legen Sie den Kamm. Fügen Sie eine kleine Menge Gel-Lösung über den Kamm. Hinweis: Halten Sie die Glasplatten horizontal zu verhindern, dass das Gel undicht. Entfernen Sie alle Bläschen mit einer Blase Haken, ggf..</li>
	<li>Lassen Sie das Gel für 30 min bei Raumtemperatur festgelegt. Hinweis: Die Zeit für die Polymerisation kann mit Temperaturen von Gel-Lösung und Umgebung ändern.</li>
	<li>Nachdem das Gel vollständig Polymerisation ist, entfernen Sie die Casting-Klammern Positionieren des Platte Satzes in der Elektrophorese tankeinheit mit der gekerbte Platte mit Blick in Richtung des oberen Puffer-Stausees und mit großen Klemmen der Platte soll die Tank-Einheit befestigt.</li>
	<li>Gießen Sie 1 L 0,5 × TBE-Puffer in jede der oberen und unteren Kammern. Entfernen Sie den Kamm und spülen Sie alle Brunnen mit Puffer mit einer Pipette oder Spritze gründlich. Hinweis: Sicherstellen Sie, dass das Gel-Sandwich an der Unterseite der Platte vollständig im Puffer blasenfrei getränkt ist.</li>
</ol>4. Lauf Gele
<ol><li>Laden Sie etwa 1 µL des PCR-Produktes in jede Vertiefung der Polyacrylamid-Gel. Laden Sie eine DNA-Größe Leiter beidseitig auf das Gel zusammen mit Proben von PCR-Produkten. Befestigen Sie die Sicherheitsabdeckung an der oberen Sperrkammer.</li>
	<li>Schließen Sie die Leitungen an die Stromversorgung, passend die farbcodierten rot an Rot und schwarz an schwarz. Führen Sie das Gel bei einer Konstanten Spannung von 110 V, bis der Farbstoff eine definierte Position, normalerweise für ~ 70 min erreicht. Hinweis: Die Spannung und laufen Zeit kann je nach Größe der PCR Produkte eingestellt werden.</li>
</ol>5. Silber-Färbung zum Nachweis von SSR-Marker in ein nicht-Polyacrylamid-Gel
<ol><li>Nach Elektrophorese Ablassen des Puffers von der oberen Kammer in ein großes Becherglas über das Ventil. Lösen Sie die Spannpratzen, entfernen Sie die Platten aus dem Gerät, sorgfältig trennen Sie die eingekerbte Glasplatte entlang einer Seite mit einem Spatel und stellen Sie sicher, dass das Gel bleibt mit der anderen Glasplatte verbunden mit Bind Silan beschichtet.</li>
	<li>Machen Sie 1 L frische Imprägnierung Lösung durch Auflösen von 1,5 g von AgNO3 in 1 L dH2O. bereiten 1 L frische Entwicklung Lösung durch Auflösen von 10 g NaOH in 900 mL dH2O zu, fügen Sie 1 mL 37 % Formaldehyd , und passen Sie zu einem Endvolumen von 1 L mit dH2O. Hinweis: Tragen Sie Handschuhe und behandeln Sie die oben genannten Chemikalien und Lösungen mit Sorgfalt zu. Es ist nicht notwendig, die Lösungen und die entsprechenden Schritte mit den Lösungen im Dunkeln zu halten.</li>
	<li>Spülen Sie sorgfältig die Gel und Glas Platte mit reichlich dH2O zum Entfernen des Elektrophorese Puffers, dann die Platte mit dem Gel nach oben auf ein Kunststoff-Tablett und Tauchen Sie das Gel in 1 L Imprägnierung Lösung. Stellte das Tablett auf einem Boston-Shaker.</li>
	<li>Schütteln Sie das Fach bei 60 u/min für ca. 3-4 min leicht. Hinweis: Schütteln Mal nach Gel Stärke und Konzentration von Silbernitrat in der Imprägnierung Lösung einstellbar.</li>
	<li>Bewegen Sie die Platte aus der Imprägnierung Lösung und setzen Sie es auf einem anderen Fach. Spülen Sie die restliche Imprägnierung Lösung Weg von der Oberfläche der Platte und das Gel mit reichlich dH2O zweimal für 3-5 s.</li>
	<li>Legen Sie die Platte mit dem Gel nach oben auf einem anderen Fach, Tauchen Sie die Platte in 1 L Lösung für die Entwicklung, dann schütteln Sie das Fach vorsichtig bei 50 u/min für ~ 3 min. Monitor die Darstellung von DNA-Fragmenten und stoppen Sie Entwicklung zu, wenn das höchste Verhältnis des Signals von DNA-Fragmenten um den Lärm der Hintergrund beobachtet (dieser Schritt dauert ca. 3 min).</li>
	<li>Spülen Sie die Platte und das Gel mit reichlich dH2O zweimal, und trocknen Sie die Gelplatte mit einem Papiertuch.</li>
	<li>Das Gel mit einem geeigneten Scanner zu scannen. Eine Auflösung von 300 dpi bietet eine übersichtliche Visualisierung von DNA-Fragmenten. Das Gel kann auch mit einer Kamera fotografiert werden.</li>
	<li>Bandenmuster von SSR-Marker kann basierend auf der DNA-Fragmente im Bild bewertet werden.</li>
</ol>

<ol><li>Jiang, G. L. Molecular markers and marker-assisted breeding in plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJiang%2C+GL+%22Plant+breeding+from+laboratories+to+fields%22">Plant breeding from laboratories to fields</a>. Anderson, S. B. , InTech Press. Croatia. 45-83 (2013).</li>
<li>Powell, W., Machray, G. C., Provan, J. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/1360138596868981">Polymorphism revealed by simple sequence repeats.</a> Trend Plant Sci. 1, 215-222 (1996).</li>
<li>Varshney, R. K., Graner, A., Sorrells, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genic+microsatellite+markers+in+plants%3A+features+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Trend+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genic microsatellite markers in plants: features and applications.</a> Trend Biotechnol. 23, 48-55 (2005).</li>
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<li>Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+protein+silver+staining+in+polyacrylamide+gels%3A+a+10-year+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis.</a> Electrophoresis. 11, 785-794 (1990).</li>
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<li>Switzer, R. C., Merril, C. R., Shifrin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+sensitive+silver+stain+for+detecting+proteins+and+peptides+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels.</a> Anal. Biochem. 98, 231-237 (1979).</li>
<li>Sanguinetti, C., Dias, N., Simpson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+silver+staining+and+recovery+of+PCR+products+separated+on+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels.</a> Biotechniques. 17, PMID:7840973 915-919 (1994).</li>
<li>Ji, Y., Qu, C., Cao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimal+method+of+DNA+silver+staining+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">An optimal method of DNA silver staining in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 28, 1173-1175 (2007).</li>
<li>Qu, L., Li, X., Wu, G., Yang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+sensitive+method+of+DNA+silver+staining+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Efficient and sensitive method of DNA silver staining in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 26, 99-101 (2005).</li>
<li>An, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+silver+staining+procedure+for+nucleic+acids+in+polyacrylamide+gels+without+fixation+and+pretreatment%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A silver staining procedure for nucleic acids in polyacrylamide gels without fixation and pretreatment.</a> Anal. Biochem. 391, 77-79 (2009).</li>
<li>Byun, S. O., Fang, Q., Zhou, H., Hickford, J. G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+effective+method+for+silver-staining+DNA+in+large+numbers+of+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">An effective method for silver-staining DNA in large numbers of polyacrylamide gels.</a> Anal. Biochem. 385, 174-175 (2009).</li>
<li>Kumar, M., Kim, S. R., Sharma, P. C., Pareek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+efficient+way+to+detect+small+polymorphic+bands+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Data%22%5BJournal%5D)">Simple and efficient way to detect small polymorphic bands in plants.</a> Genome Data. 5, 218-222 (2015).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+simple+and+effective+silver+staining+protocol+for+detection+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Development of a simple and effective silver staining protocol for detection of DNA fragments.</a> Electrophoresis. 38, 1175-1178 (2017).</li>
<li>Wang, D., Shi, J., Carlson, S. R., Cregan, P. B., Ward, R. W., Diers, B. W. <a target="_blank" href="https://scholars.opb.msu.edu/en/publications/a-low-cost-high-throughput-polyacrylamide-gel-electrophoresis-sys-3">A low-cost, high-throughput polyacrylamide gel electrophoresis system for genotyping with microsatellite DNA markers.</a> Crop Sci. 43, 1828-1832 (2003).</li>
<li>Echt, C. S., May-Marquardt, P., Hseih, M., Zahorchak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+microsatellite+markers+in+eastern+white+pine%5BTitle%5D)+AND+%22Genome%22%5BJournal%5D)">Characterization of microsatellite markers in eastern white pine.</a> Genome. 39, PMID: 8983182 1102-1108 (1996).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Das Waschen von Gel nach der Imprägnierung ist ein entscheidender Schritt. Unzureichende Reinigung Zeit und Wasser Volumen kann dazu führen, dass die unvollständige Entfernung der Imprägnierung Lösung auf der Oberfläche der Platte und das Gel und führen zu einem dunklen Hintergrund. Die entsprechenden Entwicklungszeit ist ein weiterer wichtiger Schritt, übermäßige Entwicklung kann dazu führen, dass ein dunkel-braunen Hintergrund mit kontrastarmen Bild von DNA-Fragmenten. Darüber hinaus beeinflusst die Imprägnierung Schri...

Die Entwicklung von PCR-basierten Markern revolutioniert die Wissenschaft der Pflanzengenetik und Zucht1. Einfach wiederholende (SSR) Sequenzmarken gehören zu den vielseitigsten und am häufigsten verwendeten DNA-Markern. Ihre breiten Genom Abdeckung, Fülle, Genom Spezifität und Reproduzierbarkeit sind nur einige von den Vorzügen des SSR-Marker neben ihrer Vererbung Vererbung für die Erkennung von heterozygote Genotypen2. Mehrere Studien haben SSR-Marker zu untersuchen genetischen Vielfalt, Abstammung zu verfolgen, genetische kopplungskarten zu konstruieren, und ordnen Sie Gene für wirtschaftlich wichtige Eigenschaften3,4verwendet.
PCR-Produkte von SSR-Marker werden häufig getrennt, mit Agarose oder Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese und dann visualisiert mit silbernen Färbung oder unter UV-Licht nach der Färbung mit Interkalation Bromid. Silberne Färbung der DNA-Fragmente in den Polyacrylamid-Gelen ist empfindlicher als die anderen Färbung Methoden5,6 und wurde weithin verwendet, um DNA-Fragmente wie SSR Marker7erkennen.
Wie viele biologische Labor-Techniken verbesserte silberne Färbung Polyacrylamid-Gele kontinuierlich seit seiner zuerst als ein Fragment Visualisierungstechnik in 19798berichtet. Die Technik wurde ursprünglich zum Nachweis von DNA-Fragmenten von Bassam Et Al. geändert. 6 im Jahr 1991 und dann im Jahr 1994 von Sanguinetti und Kollegen9 verbessert. Die Methode wurde in den letzten paar Jahrzehnten6,7,9,10,11,12,13,14 weiter optimiert , 15. jedoch haben die meisten dieser aktualisierten Versionen der Protokolle noch einige Nachteile wie hohen technischen Anspruch und lange Bearbeitungszeit zur Befestigung und Montage6, die die Anwendung dieser Protokolle7zu beschränken, 11. Eine optimale Protokoll, die kostengünstige mit hohem Wirkungsgrad von DNA-Fragment Nachweis kombiniert ist für die routinemäßige Anwendung von Silber-Färbung in der biologischen Forschung dringend notwendig.
Darüber hinaus Polyacrylamid-Gel können Geruchsstoffen und nicht denaturierenden Polyacrylamid-Gele unterteilt werden, und beide können zur Erkennung von SSR-Marker mit der Silber-Färbung Methode verwendet werden. Die Wirkung und die Auflösung von denen nicht unterscheiden sich erheblich, aber nicht denaturierenden Polyacrylamid-Gele lassen sich besser verarbeiten und nehmen weniger Zeit16.
Das Ziel der aktuellen Studie soll auf der Grundlage der bisherigen Forschung15eine optimierte Silber Färbeprotokoll für schnelle, einfache und kostengünstige Erkennung von SSR-Marker in einem nicht denaturierenden Polyacrylamid-Gel im Detail zu beschreiben.

<table><tbody><tr><td>PCR-Mastermix (Green Taq Mix)</td><td>Vazyme Biotech Co. Ltd, China</td><td>#P131-03</td><td></td></tr><tr><td>50-2000 bp DNA Ladder</td><td>Bio-Rad, USA</td><td>#170-8200</td><td></td></tr><tr><td>DL500 DNA-Marker</td><td>Takara Bio Inc., Japan</td><td>#3590A Tris-Base</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sangon Biotech Shanghai, China</td><td>#77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Borsäure</td><td>Sangon Biotech Shanghai, China</td><td>#10043-35-3</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-Na2</td><td>Guangzhou Chemical Reagent Factory, China</td><td>#6381-92-6</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamid</td><td>Sangon Biotech Shanghai, China</td><td>#79-06-1</td><td></td></tr><tr><td>N,N'-Methylen-bis-acrylamid</td><td>Sangon Biotech Shanghai, China</td><td>#110-26-9</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin</td><td>Sangon Biotech Shanghai, China</td><td>#110-18-9</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat</td><td>Guangzhou Chemische Reagenzfabrik, China</td> <td># 7727-54-0</td><td></td></tr><tr><td>Bind-Silan</td><td>Solarbio Beijing, China</td><td>#B8150</td><td></td></tr><tr><td>AgNO3</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz Beijing Co., Ltd, China</td> <td># 7761-88-8</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Tianjin DaMao Chemische Reagenzfabrik, China</td> <td># 50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Guangzhou Chemische Reagenzfabrik, China</td><td>#1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Guangzhou Chemische Reagenzfabrik, China</td><td>#64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>Na2CO3</td><td>Tianjin DaMao Chemische Reagenzfabrik, China</td><td>#497-19-8</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Guangzhou Chemische Reagenzfabrik, China</td><td>#64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>HNO3</td><td>Guangzhou Chemische Reagenzfabrik, China</td><td>#7697-37-2</td><td></td></tr><tr><td>Na2S2O3.5H2O</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz Beijing Co., Ltd, China</td><td>#10102-17-7</td><td></td></tr><tr><td>Eriochromschwarz T (EBT)</td><td>Tianjin DaMao Chemische Reagenzfabrik, China</td><td>#1787-61-7</td><td></td></tr><tr><td>Kunststofftablett</td><td>Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd,</td> <td>China-TS-1</td><td></td></tr> <tr><td>Shaker</td><td>Qilinbeter JiangSu,</td> <td>China-BenQ</td><td></td></tr> <tr><td>M800 Scanner</td><td>BenQ,</td><td></td> China-DYY-6C <td></td></tr><tr><td>Stromversorgung</td><td>Beijing Liuyi Instrument Factory,</td> <td>China-High</td><td></td></tr> <tr><td>durch vertikale Gelsysteme, JY-SCZF</td><td>Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, China</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

eine schnelle silber färbung protokoll ermöglicht einfache und effiziente erkennung von ssr-marker mit einem non-denaturierenden polyacrylamid-gel

A Fast Silver Staining Protocol Enabling Simple and Efficient Detection of SSR Markers using a Non-denaturing Polyacrylamide Gel

Einfache Sequenz wiederholen (SSR) ist eine der effektivsten Marker in pflanzlichen und tierischen Genforschung und molekulare Zuchtprogramme verwendet. Silberne Färbung ist eine weit verbreitete Methode zur Erkennung von SSR-Marker in einem Polyacrylamid-Gel. Konventionelle Protokolle für die silberne Färbung sind jedoch technisch anspruchsvoll und zeitaufwändig. Wie viele andere biologische Labor wurden Techniken, silberne Färbung Protokolle stetig optimiert, um nachweiseffizienz zu verbessern. Hier berichten wir über eine vereinfachte silberne Färbung Methode, die deutlich reduziert Reagenz Kosten und verbessert die Erkennung Auflösung und Bildqualität. Die neue Methode erfordert zwei wesentliche Schritte (Imprägnierung und Entwicklung) und drei Reagenzien (Silbernitrat, Natriumhydroxid und Formaldehyd) und nur 7 min Verarbeitung für ein nicht denaturierenden Polyacrylamid-Gel. Im Vergleich zu bereits gemeldeten Protokolle, diese neue Methode ist einfacher, schneller und verwendet weniger chemische Reagenzien für SSR-Erkennung. Somit profitieren diese einfache, kostengünstige und effektive Silber Färbeprotokoll genetische Zuordnung und markergestützte Züchtung durch eine schnelle Erzeugung von SSR-Marker-Daten.

Der PCR-Amplifikate wurden mit den korrespondierenden SSR Grundierung Paare in Blüte Chinakohl und Tabak hergestellt. Nach Elektrophorese waren die Polyacrylamid-Gele befleckt mit dem oben genannten Silber Färbeprotokoll, die eindeutig die Streifenbildung Muster des SSR-Marker (Abbildung 1) entdeckt.
Um die nachweiseffizienz verschiedene Silber Färbung Protokolle vergleichen, PCR-Produkte von SSR-Ma...

Hier berichten wir über eine einfache und kostengünstige Silber Färbeprotokoll erfordert nur drei Reagenzien und 7 min von Verarbeitung und eignet sich für schnelle Generierung von qualitativ hochwertigen SSR Daten in der genetischen Analyse.

Eine schnelle Silber Färbung Protokoll ermöglicht einfache und effiziente Erkennung von SSR-Marker mit einem Non-denaturierenden Polyacrylamid-Gel

Simple Sequence Repeat (SSR) is one of the most effective markers used in plant and animal genetic research and molecular breeding programs. Silver ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist die Einführung einer optimierten Silberfärbemethode für den schnellen, einfachen und kostengünstigen Nachweis von SSR-Markern in nicht denaturierenden Polyacrylamid-Gelen. Die schnelle Genotypisierung von SSR-Markern kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in der genetischen Forschung und im Anwendungsbereich zu beantworten, wie z. B. die Analyse der genetischen Vielfalt und die markergestützte Selektion in molekularen Züchtungsprogrammen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie einfach durchzuführen ist, weniger Zeit in Anspruch nimmt und weniger chemische Reagenzien verwendet als andere Protokolle zum Nachweis von SSR-Markern.Diese Methode vermeidet das Fixieren, Stoppen und mehrere Waschschritte, die in herkömmlichen Protokollen zu finden sind. Und erfordert nur die beiden Hauptschritte Imprägnierung und Entwicklung. Mit diesem Protokoll können klare Bilder erzeugt werden, da es kein Hintergrundrauschen für die eindeutige Erkennung von SSR-Bandenmustern gibt.Mit dieser Technik kann man etwa 800 DNA-Proben pro Tag untersuchen und sie wurde erfolgreich in der Tabak- und Blütenforschung von Chinakohl eingesetzt. Nach der Zub

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Nach der Trennung durch elektrophoretische Methoden können Proteine ​​in einem Gel durch mehrere Färbemethoden nachgewiesen werden. Die Färbung von Proteinen mit Coomassie Blue, Silver Färbung, SYPRO Orange, SYPRO Ruby sind in diesem Video demonstriert.

Die Färbung Proteine ​​in Gelen

Dieses Video ist eine kolloidale Coomassie G-250 Färbung Protokoll nach Kang...

Schnell und feinfühlig Kolloidale Coomassie G-250 Färbung für Proteine ​​in Polyacrylamidgelen

Wir haben vor kurzem einen neuartigen Ansatz zur Erzeugung von fluorogenen DNAzym Sonden, die angewendet zur Einrichtung eine einfache, "Mix-and-read" Fluoreszenz-Assay für die bakterielle Nachweis kann berichtet werden. Diese speziellen DNA-Sonden katalysieren die Spaltung eines Chromophors-modifizierten DNA-RNA-chimären Substrat in Gegenwart von rohem extrazellulären Mischung (CEM) von einem bestimmten Bakteriums fort, wodurch Nachweis von Bakterien in Fluoreszenz-Erzeugungseinheit erzeugt...

Nachweis von Bakterien mit fluorogenen DNAzyme

In diesem Video demonstrieren wir eine Silberfärbemethode von Polyacrylamid-Gelen zur Visualisierung des Gesamtproteins mit fluorogenen Sonden.

Fluoreszierende Silberfärbung: Eine Technik zur Visualisierung des Gesamtproteins in Polyacrylamid-Gelen

In diesem Video demonstrieren wir ein Verfahren zur kombinierten Alcian-Blau- und Silberfärbung von sulfatierten Glykosaminoglykan-Oligosaccharid-Fragmenten. Diese kombinierte Färbetechnik verstärkt die Banden von Glykosaminoglykan-Polymeren unterschiedlicher Länge in Polyacrylamid-Gelen erheblich.

Silberfärbung von sulfatierten Glykosaminoglykanen: Eine Färbemethode zur Visualisierung von sulfatierten Glykosaminoglykanen in Polyacrylamidgelen

Dieses Video zeigt eine denaturierende Polyacrylamid-basierte Trenntechnik für Proteine. Diese Technik hilft bei der vorläufigen Identifizierung von Proteinen anhand ihres Molekulargewichts.

Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese für die Proteinanalyse: Eine Technik zur Trennung und Visualisierung von Proteinen auf der Grundlage des Molekulargewichts

Wir beschreiben hier ein optimiertes Protokoll von fluoreszierenden elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assays (FEMSA) gereinigtes SOX-2-Proteine ​​zusammen mit Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-markierten DNA-Sonden als Fallstudie eine wichtige biologische Frage zu bekämpfen.

Ein optimiertes Protokoll für die elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay unter Verwendung von Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-markierten Oligonukleotide

Am häufigsten Darm Inhaltsanalysen der Makroinvertebraten sind visuell. Intensive Kenntnisse über morphologische Vielfalt der Beute Organismen erfordern, sie vermissen weichen vollmundigen Beute und durch starke Zerkleinerung von Beute, sind fast unmöglich für einige Organismen, einschließlich Amphipoden. Wir bieten detaillierte, neuartigen gentechnische Ansätze für Soisgrabenbaches Identifikation in der Ernährung der Amphipoden Beute.

Laborprotokoll für genetische Darm Inhaltsanalysen der aquatischen Makroinvertebraten Using gruppenspezifische rDNA Primer

Diese Methode erlaubt selektive Färbung und Quantifizierung der DNA in den Gelen durch Einweichen das Gel in einem SYBR Grün ich / Nitro blau Tetrazoliumsalz Lösung und setzen Sie sie dem Sonnenlicht oder eine blaue Lichtquelle. Dies erzeugt einen sichtbaren Niederschlag und erfordert fast keine Ausrüstung, wodurch es ideal für den mobilen Einsatz.

DNA-Färbung Methode basiert auf Formazan Niederschlag induziert durch blaues Licht aussetzen

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll umreißt eine neue fluoreszierende Färbung Technik für Gesamt-Protein Nachweis in Polyacrylamid-Gele. Das Protokoll nutzt eine Sonde, Silber Ionen-spezifische Fluoreszenz Turn-on, die Ag+erkennt-Proteinkomplexe, und gewisse Einschränkungen der traditionellen chromogenen Silber Flecken beseitigt.

Fluoreszierende silberne Färbung von Proteinen im Polyacrylamid-Gele

Dieser Bericht beschreibt Techniken zur Isolierung und Reinigung von sulfatierten Glykosaminoglykanen (GAGs) aus biologischen Proben und einen Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Ansatz, um ihre Größe anzunähern. GAGs tragen zur Gewebestruktur bei und beeinflussen Signalprozesse durch elektrostatische Interaktion mit Proteinen. Die GAG-Polymerlänge trägt zu ihrer Bindungsaffinität für verwandte Liganden bei.

Nachweis von Glykosaminoglykanen durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Silberfärbung

Lernen Sie ein optimiertes Silberfärbungsprotokoll zur schnellen SSR-Marker-Detektion in nicht-denaturierenden Polyacrylamidgelen. Diese kostengünstige Methode reduziert die Verarbeitungszeit auf nur sieben Minuten.

Eine schnelle Silber Färbung Protokoll ermöglicht einfache und effiziente Erkennung von SSR-Marker mit einem Non-denaturierenden Polyacrylamid-Gel (Video) | JoVE Journal

Eine schnelle Silber Färbung Protokoll ermöglicht einfache und effiziente Erkennung von SSR-Marker mit einem Non-denaturierenden Polyacrylamid-Gel

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