Entwicklung von mikrofluidischen Geräten um die Dehnung Fähigkeit der Spitze wachsenden Pflanzenzellen in sehr kleinen Räumen zu studieren

Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Pflanzenzellbiologie zu beantworten, z. B. wie spitzenwachsende Pflanzenzellen physikalische Zellbarrieren durchdringen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Möglichkeit, hochauflösende Bilder aufzunehmen, die den Verformungsprozess einer Zelle im Mikrometerbereich unter einem herkömmlichen Mikroskop rekonstruieren. Um ein Gerät zur Untersuchung der wachsenden Pollenschläuche und des Moosprotonemata herzustellen, stellen Sie zuerst etwa 11 Gramm eines PDMS her und laden Sie es in eine vier Zoll große Form.

Entgasen Sie dann die Form 20 Minuten lang in einer Vakuumkammer. Als nächstes härten Sie die Form 90 Minuten lang bei 65 Grad Celsius aus. Ziehen Sie nach dem Aushärten die PDMS-Schicht von der Form ab und öffnen Sie die Zugangslöcher zum Kanal innerhalb des PDMS mit einem Biopsie-Stanzwerkzeug

Setzen Sie anschließend das PDMS und die fünf Zentimeter große Glasschale 50 Sekunden lang Luftplasma aus. Um das mikrofluidische Netzwerk abzudichten, drücken Sie die PDMS-Schicht auf die Glasschale und härten Sie sie 30 Minuten lang bei 65 Grad Celsius aus. Um ein Mikrogerät herzustellen, das für die Untersuchung von Wurzelhaaren entwickelt wurde, werden zwei Formen geladen und ausgehärtet.

Verwenden Sie beim Ausstanzen der Kanallöcher einen zwei Millimeter starken Stempel. Nachdem Sie beide Schichten 50 Sekunden lang Luftplasma ausgesetzt haben, fügen Sie sie einschließlich eines Deckglases unter einem Stereomikroskop zusammen. Verwenden Sie dazu das maßgeschneiderte Aligner-Werkzeug.

Härten Sie die Baugruppe 30 Minuten lang im Ofen aus, um das mikrofluidische Netzwerk abzudichten. Entfernen Sie nach dem Aushärten das Deckglas vom Gerät und geben Sie es in eine fünf Zentimeter große Glasschale. Bevor Sie das Pollenschlauch-Mikrogerät verwenden, entgasen Sie es 20 Minuten lang in einer Vakuumkammer.

Geben Sie mit einer Mikropipette mit feiner Spitze Wachstumsmedium in den Stempeleinlass. Beladen Sie die anderen Vertiefungen mit dem gleichen Medium. Warten Sie einige Minuten, bis sich die Kanäle gefüllt haben.

Legen Sie in der Zwischenzeit ein feuchtes Papiertuch in die Schüssel, um die lokale Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten. Sammeln Sie nun Pollenkörner von einer blau-weißen Blüte von T.fournieri. Übertragen Sie die Körner mit einer Präpariernadel auf die Narbe.

Schneiden Sie als Nächstes einen einen Zentimeter langen bestäubten Stil der Länge nach ab und führen Sie dann den Schnittstil in den Einlass des mikrofluidischen Geräts ein. Wenn der Schnittstil mit einer Pinzette in den Einlass des mikrofluidischen Geräts eingeführt wird, ist es wichtig, den Stil nicht zu fest zu halten, da dies den Stil beschädigen kann. Befestigen Sie dann einen Deckel mit Klebeband auf der Schale und stellen Sie die Schale in einen Inkubator bei 28 Grad Celsius, wo sie fünf bis sechs Stunden im Dunkeln bleiben muss.

Beginnen Sie unter einer Laminar-Flow-Haube mit der Sterilisation von transgenen A.thaliana Columbia-Samen. Weichen Sie sie fünf Minuten lang in Reinigungslösung ein. Spülen Sie die Samen dann gründlich in autoklaviertem Wasser ab.

Nach der Sterilisation lagerst Du die Samen 48 Stunden lang bei vier Grad Celsius in der Dunkelheit. Entgasen Sie das Mikrogerät einige Tage später 20 Minuten lang, bevor Sie es verwenden. Laden Sie dann das entsprechende Wachstumsmedium mit einer feinen Pipette in die Vertiefungen des Geräts und warten Sie einige Minuten, bis die Lösung durch alle Kanäle gezogen ist.

Legen Sie außerdem ein feuchtes Papiertuch auf die Schüssel, um die Feuchtigkeit zu erhalten. Übertragen Sie nun einen vorbereiteten Seed in den Einlass des Geräts. Befestigen Sie dann den Deckel mit Klebeband und bringen Sie die Schale in einen 22 Grad Celsius heißen Inkubator mit kontinuierlichem Licht.

Sterilisieren Sie das Mikrogerät vor seiner Verwendung über Nacht unter UV-Strahlung. Entgasen Sie das Mikrogerät am nächsten Tag für 20 Minuten. Nach der Entgasung beladen Sie die Mikrovertiefungen mit dem entsprechenden Nährmedium.

Während sich die Kanäle allmählich füllen, umgeben Sie das Mikrogerät mit etwas autoklaviertem Wasser, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten. Übertragen Sie ein kleines Stück Moos-Protonemata-Gewebe in den Einlass des Mikrogeräts. Kultivieren Sie das Gerät nun bei 25 Grad Celsius unter Dauerlicht.

Machen Sie nach zwei bis drei Wochen Wachstum Hellfeldbilder der Ergebnisse unter einem Mikroskop. Spitzenwachsende Pflanzenzellen stoßen auf ihrem Wachstumsweg in vivo auf eine Reihe von physikalischen Barrieren, wie z. B. im Übertragungstrakt und an der Mikropyle, ganz zu schweigen vom Weg der Wurzelhaare im Boden. Die vorgestellten mikrofluidischen in vitro Zellkulturplattformen ermöglichen die Untersuchung des Spitzenwachstumsprozesses in drei Arten von Pflanzenzellen: Pollenschläuche, Wurzelhaare und Moosprotonemata.

Die Betrachtung erfolgt durch Lücken von einem Mikrometer in den Geräten. Da Mikrolücken dieser Größe zerbrechlich sind, schließen sie sich manchmal, insbesondere nach wiederholtem Gebrauch. Daher ist es wichtig, vor der Durchführung der Experimente zu überprüfen, ob die Lücken intakt sind.

Für die Pollenschlauchstudie wurde die Bildgebung lebender Zellen verwendet, um morphologische Veränderungen im apikalen Bereich der Pollenschläuche sowie des vegetativen Kerns und der Spermien als Reaktion auf das Berühren eines extrem kleinen Raums zu überwachen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Pflanzenzellbiologie den Weg, um die Verlängerungsfähigkeit von spitzenwachsenden Pflanzenzellen wie Pollenschläuchen, Wurzelhaaren und Moosprotonemata auf extrem kleinem Raum zu erforschen.