Entwicklung von mikrofluidischen Geräten um die Dehnung Fähigkeit der Spitze wachsenden Pflanzenzellen in sehr kleinen Räumen zu studieren
22. Mai 2018
Wir beschreiben eine Methode, um die Fähigkeit der Spitze wachsenden Pflanzenzellen, einschließlich der pollenschläuche, Wurzelhaare, untersuchen und Moos Protonemata, zu verlängern, durch extrem schmale Lücken (~ 1 µm) in einem mikrofluidischen Gerät.
Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Pflanzenzellbiologie zu beantworten, z. B. wie spitzenwachsende Pflanzenzellen physikalische Zellbarrieren durchdringen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Möglichkeit, hochauflösende Bilder aufzunehmen, die den Verformungsprozess einer Zelle im Mikrometerbereich unter einem herkömmlichen Mikroskop rekonstruieren. Um ein Gerät zur Untersuchung der wachsenden Pollenschläuche und des Moosprotonemata herzustellen, stellen Sie zuerst etwa 11 Gramm eines PDMS her und laden Sie es in eine vier Zoll große Form.
Entgasen Sie dann die Form 20 Minuten lang in einer Vakuumkammer. Als nächstes härten Sie die Form 90 Minuten lang bei 65 Grad Celsius aus. Ziehen Sie nach dem Aushärten die PDMS-Schicht von der Form ab und öffnen Sie die Zugangslöcher zum Kanal innerhalb des PDMS mit einem Biopsie-Stanzwerkzeug
.Setzen Sie anschließend das PDMS und die fünf Zentimeter große Glasschale 50 Sekunden lang Luftplasma aus. Um das mikrofluidische Netzwerk abzudichten, drücken Sie die PDMS-Schicht auf die Glasschale und härten Sie sie 30 Minuten lang bei 65 Grad Celsius aus. Um ein Mikrogerät herzustellen, das für die Untersuchung von Wurzelhaaren entwickelt wurde, werden zwei Formen geladen und ausgehärtet.
Verwenden Sie beim Ausstanzen der Kanallöcher einen zwei Millimeter starken Stempel. Nachdem Sie beide Schichten 50 Sekunden lang Luftplasma ausgesetzt haben, fügen Sie sie einschließlich eines Deckglases unter einem Stereomikroskop zusammen. Verwenden Sie dazu das maßgeschneiderte Aligner-Werkzeug.
Härten Sie die Baugruppe 30 Minuten lang im Ofen aus, um das mikrofluidische Netzwerk abzudichten. Entfernen Sie nach dem Aushärten das Deckglas vom Gerät und geben Sie es in eine fünf Zentimeter große Glasschale. Bevor Sie das Pollenschlauch-Mikrogerät verwenden, entgasen Sie es 20 Minuten lang in einer Vakuumkammer.
Geben Sie mit einer Mikropipette mit feiner Spitze Wachstumsmedium in den Stempeleinlass. Beladen Sie die anderen Vertiefungen mit dem gleichen Medium. Warten Sie einige Minuten, bis sich die Kanäle gefüllt haben.
Legen Sie in der Zwischenzeit ein feuchtes Papiertuch in die Schüssel, um die lokale Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten. Sammeln Sie nun Pollenkörner von einer blau-weißen Blüte von T.fournieri. Übertragen Sie die Körner mit einer Präpariernadel auf die Narbe.
Schneiden Sie als Nächstes einen einen Zentimeter langen bestäubten Stil der Länge nach ab und führen Sie dann den Schnittstil in den Einlass des mikrofluidischen Geräts ein. Wenn der Schnittstil mit einer Pinzette in den Einlass des mikrofluidischen Geräts eingeführt wird, ist es wichtig, den Stil nicht zu fest zu halten, da dies den Stil beschädigen kann. Befestigen Sie dann einen Deckel mit Klebeband auf der Schale und stellen Sie die Schale in einen Inkubator bei 28 Grad Celsius, wo sie fünf bis sechs Stunden im Dunkeln bleiben muss.
Beginnen Sie unter einer Laminar-Flow-Haube mit der Sterilisation von transgenen A.thaliana Columbia-Samen. Weichen Sie sie fünf Minuten lang in Reinigungslösung ein. Spülen Sie die Samen dann gründlich in autoklaviertem Wasser ab.
Nach der Sterilisation lagerst Du die Samen 48 Stunden lang bei vier Grad Celsius in der Dunkelheit. Entgasen Sie das Mikrogerät einige Tage später 20 Minuten lang, bevor Sie es verwenden. Laden Sie dann das entsprechende Wachstumsmedium mit einer feinen Pipette in die Vertiefungen des Geräts und warten Sie einige Minuten, bis die Lösung durch alle Kanäle gezogen ist.
Legen Sie außerdem ein feuchtes Papiertuch auf die Schüssel, um die Feuchtigkeit zu erhalten. Übertragen Sie nun einen vorbereiteten Seed in den Einlass des Geräts. Befestigen Sie dann den Deckel mit Klebeband und bringen Sie die Schale in einen 22 Grad Celsius heißen Inkubator mit kontinuierlichem Licht.
Sterilisieren Sie das Mikrogerät vor seiner Verwendung über Nacht unter UV-Strahlung. Entgasen Sie das Mikrogerät am nächsten Tag für 20 Minuten. Nach der Entgasung beladen Sie die Mikrovertiefungen mit dem entsprechenden Nährmedium.
Während sich die Kanäle allmählich füllen, umgeben Sie das Mikrogerät mit etwas autoklaviertem Wasser, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten. Übertragen Sie ein kleines Stück Moos-Protonemata-Gewebe in den Einlass des Mikrogeräts. Kultivieren Sie das Gerät nun bei 25 Grad Celsius unter Dauerlicht.
Machen Sie nach zwei bis drei Wochen Wachstum Hellfeldbilder der Ergebnisse unter einem Mikroskop. Spitzenwachsende Pflanzenzellen stoßen auf ihrem Wachstumsweg in vivo auf eine Reihe von physikalischen Barrieren, wie z. B. im Übertragungstrakt und an der Mikropyle, ganz zu schweigen vom Weg der Wurzelhaare im Boden. Die vorgestellten mikrofluidischen in vitro Zellkulturplattformen ermöglichen die Untersuchung des Spitzenwachstumsprozesses in drei Arten von Pflanzenzellen: Pollenschläuche, Wurzelhaare und Moosprotonemata.
Die Betrachtung erfolgt durch Lücken von einem Mikrometer in den Geräten. Da Mikrolücken dieser Größe zerbrechlich sind, schließen sie sich manchmal, insbesondere nach wiederholtem Gebrauch. Daher ist es wichtig, vor der Durchführung der Experimente zu überprüfen, ob die Lücken intakt sind.
Für die Pollenschlauchstudie wurde die Bildgebung lebender Zellen verwendet, um morphologische Veränderungen im apikalen Bereich der Pollenschläuche sowie des vegetativen Kerns und der Spermien als Reaktion auf das Berühren eines extrem kleinen Raums zu überwachen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Pflanzenzellbiologie den Weg, um die Verlängerungsfähigkeit von spitzenwachsenden Pflanzenzellen wie Pollenschläuchen, Wurzelhaaren und Moosprotonemata auf extrem kleinem Raum zu erforschen.
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Überblick
Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Untersuchung der Dehnfähigkeit von spitzenwachsenden Pflanzenzellen, wie Pollenschläuche und Moos-Protonemata, durch enge Spalten in einem mikrofluidischen Gerät. Die Technik ermöglicht eine hochauflösende Bildgebung von Zelldeformationsprozessen im Mikrometerbereich.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Pflanzenzellbiologie
- Mikrofluidik
- Zelluläre Mechanik
Hintergrund
- Spitze-wachsende Pflanzenzellen spielen eine entscheidende Rolle in der Pflanzenentwicklung.
- Das Verständnis, wie diese Zellen physische Barrieren durchdringen, ist für die Weiterentwicklung der Pflanzenbiologie unerlässlich.
- Mikrofluidische Geräte können enge Umgebungen für die Zellenstudie simulieren.
- Hochauflösende Bildgebungstechniken sind für die Beobachtung zellulärer Prozesse unerlässlich.
Zweck der Studie
- Um die Fähigkeit von spitzenwachsenden Pflanzenzellen zu untersuchen, sich durch enge Spalten zu verlängern.
- Um Einblicke in die Mechanismen der Zelldurchdringung durch Barrieren zu gewinnen.
- Um eine zuverlässige Methode zur Untersuchung der Zelldeformation in kontrollierten Umgebungen zu entwickeln.
Verwendete Methoden
- Herstellung einer PDMS-Mikrofluidik-Vorrichtung.
- Entgasung der Form in einer Vakuumkammer.
- Aushärten des PDMS bei 65 Grad Celsius.
- Erstellen von Zugangslöchern im PDMS mithilfe eines Biopsie-Stanzwerkzeugs.
Hauptergebnisse
- Die Methode ermöglicht erfolgreich die Beobachtung von Pollenschläuchen und Moos-Protonemata.
- Hochauflösende Bilder zeigen die Deformationsprozesse der Zellen.
- Zellen können sich durch Spalten von bis zu 1 µm verlängern.
- Die Technik liefert wertvolle Daten zum Verständnis des Zellverhaltens in begrenzten Räumen.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode verbessert das Verständnis von spitzenwachsenden Pflanzenzellen.
- Sie bietet einen neuen Ansatz zur Untersuchung der zellulären Mechanik in der Pflanzenbiologie.
- Die Ergebnisse könnten Auswirkungen auf die landwirtschaftliche und biologische Forschung haben.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Studying tip-growing plant cell behavior in physically constrained environments provides mechanistic insights into cellular adaptation under mechanical stress, relevant for understanding growth regulation in complex tissues. This microfluidic platform enables high-resolution visualization of subcellular dynamics during barrier penetration, supporting hypothesis testing in cellular mechanics and predictive modeling of growth responses. The approach offers a scalable in vitro system to de-risk target validation in plant developmental pathways by linking physical constraints to molecular readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of how physical constraints influence tip growth dynamics and subcellular reorganization in live cells.
- Operational Value: Provides a reproducible platform to correlate gap size with elongation success rates across cell types.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by revealing whether cytoskeletal or nuclear positioning changes are required for barrier transit.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative readouts on penetration efficiency and morphological changes under controlled micron-scale confinement.
- Operational Value: Standardizes gap dimensions (e.g., ~1 µm) to ensure assay consistency across experiments and laboratories.
- Scalability: Permits parallel testing of multiple cell lines or genetic variants in identical microfluidic networks.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects cellular responses to physical stress with potential biomarkers of growth adaptation or failure.
- Operational Value: Enables time-lapse tracking of fluorescently labeled components (e.g., nucleus, sperm cells) to correlate structural changes with functional outcomes.
- Predictive Confidence: Offers a disease-relevant system analog for studying how cells navigate restrictive microenvironments, analogous to extracellular matrix penetration in mammalian systems.
Pipeline & Workflow Integration
The microfluidic elongation assay fits within early discovery workflows where understanding cellular responses to physical cues informs target selection and pathway validation.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on how mechanical confinement alters tip growth kinetics and intracellular trafficking.
- Screening: Delivers standardized, quantifiable outputs on cell deformation and transit success for compound or genetic perturbation studies.
- Analytics: Enables measurement of elongation rates, nuclear displacement, and shape recovery as dependent variables for condition comparison.
- Translational Research: Provides a disease-relevant system to model how cells adapt to spatial constraints, supporting extrapolation to invasive growth phenotypes.
- Enterprise Reuse: Reusable PDMS-glass platforms allow longitudinal studies and cross-project standardization in mechanobiology screening.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces ambiguity in linking physical stimuli to cellular responses by enabling direct observation of deformation processes.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized fabrication, plasma bonding, and gap verification steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in target validation by clarifying whether observed growth defects stem from intrinsic capacity or extrinsic barrier resistance.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on their resilience to mechanical stress in confined microenvironments.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic design, PDMS handling, and sterile cell culture techniques.
- Depends on access to vacuum degassing equipment, plasma treatment systems, and precision punch tools for channel formation.
- Necessitates standardized protocols for gap integrity verification prior to each experiment to prevent false-negative results.
- Involves adaptation considerations when transferring the system between pollen tubes, root hairs, and moss protonemata due to differing growth rates and medium needs.
- Limited by the fragility of sub-micron gaps, which may deform or close after repeated use, requiring routine inspection.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:28
Fabricating the PDMS Microdevices
2:11
In Vitro Culturing of T. fournieri Pollen Tubes in the Microdevice
3:31
In Vitro Culturing of A. thaliana Root Hairs in the Microdevice
4:40
In Vitro Culturing of P. patens (moss) Protonemata in the Microfluidic Device
5:31
Results: Microfluidic Device Design and Time-lapse Imaging of Pollen Tube Growth
6:37
Conclusion
