Formaldehyd-gestützte Isolation regulatorischer Elemente auf die Maßnahme Chromatin Barrierefreiheit in Säugerzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Chromatinzugänglichkeit eines genetischen Locus durch kovalente Vernetzung der DNA mit den assoziierten Proteinen zu bestimmen, gefolgt von der Reinigung und Quantifizierung der freien DNA. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Chromatinbereich zu beantworten, da die Zugänglichkeit der DNA unabhängig vom Zelltyp in unbehandelten Zellen und auch in Zellen, die sich einem Chromatin-Remodeling unterziehen, bestimmt werden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass keine Enzyme zur Spaltung der DNA oder Antikörper verwendet werden müssen, die für jede Versuchsumgebung titriert werden müssen.

Dieses Protokoll hat den zusätzlichen Vorteil, dass es außer einem Ultraschallgerät keine spezielle Ausrüstung benötigt. Das Verfahren wird von Olesja Ritter und Tabea Riedlinger, Doktorandinnen aus meinem Labor, vorgeführt. Zu Beginn des Protokolls fügen Sie Formaldehyd direkt in das Wachstumsmedium von Zellen hinzu, die einen Tag zuvor ausgesät wurden, um eine Endkonzentration von 1 Vol.-% zu erreichen.

Inkubieren Sie das Medium 10 Minuten lang bei Raumtemperatur und schwenken Sie die Platten alle zwei Minuten manuell. Als nächstes fügen Sie Glycin bis zu einer Endkonzentration von 0,125 molar hinzu, um das Formaldehyd zu löschen. Inkubieren Sie die Lösung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur und schwenken Sie sie alle zwei Minuten.

Aspirieren Sie das Medium und geben Sie dann vorsichtig eiskaltes PBS an den Rand der Schüssel, um die Zellen zu waschen. Saugen Sie das Medium an und wiederholen Sie die Wäsche vorsichtig zweimal. Nach der dritten Wäsche die Zellen in einem Milliliter eiskaltem PBS wieder suspendieren und bei Bedarf mit einem Zellschaber die Zellen ablösen.

Übertragen Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen auf Eis. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 300 g und vier Grad Celsius in einer gekühlten Tischzentrifuge. Saugen Sie den Überstand vorsichtig ab und entsorgen Sie ihn.

Suspendieren Sie das Zellpellet wieder in einem Milliliter FAIRE-Lysepuffer, indem Sie mehrmals vorsichtig auf und ab pipettieren. Inkubieren Sie die Zellen 20 Minuten lang auf Eis. Nach der Inkubation wird die vernetzte DNA beschallt, um sie auf eine durchschnittliche Größe von 200 bis 300 Basenpaaren zu bringen, und die Proben während der Beschallung abgekühlt, um eine Erwärmung der Probe zu vermeiden.

Die Fragmentierung der DNA ist für dieses Experiment von entscheidender Bedeutung, da die Größe der Fragmente die Empfindlichkeit der Lösung der gesamten Technik beeinflusst, daher ist es wichtig, die Beschallungsbedingungen im Voraus sorgfältig festzulegen und die Größe der Chromatinfragmente in jedem einzelnen Experiment zu überprüfen. Zentrifugieren Sie die Probe 15 Minuten lang und 13.000 g bei vier Grad Celsius. Dann wird der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt.

Die Proben werden in 100 Mikroliter Aliquots aufgeteilt. Verwenden Sie ein 100-Mikroliter-Aliquot, um die Vernetzung umzukehren und als Referenz für die Gesamt-DNA verwendet zu werden. Fügen Sie 10 Mikroliter RNase A hinzu und inkubieren Sie die Probe eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius.

Als nächstes fügen Sie 10 Mikroliter Proteinase K hinzu. Verwenden Sie einen programmierbaren Thermoblock, um die Probe vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius und dann sechs Stunden lang bei 65 Grad Celsius zu inkubieren, um die Proteine zu spalten und die Vernetzungen umzukehren. Entnehmen Sie ein neues Aliquot von 100 Mikrolitern, fügen Sie 10 Mikroliter RNase A hinzu und inkubieren Sie die Probe eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation fahren Sie mit der nicht entvernetzten Probe und der entvernetzten Probe aus dem vorherigen Abschnitt parallel fort.

Fügen Sie H2O hinzu, um ein Endvolumen von 300 Mikrolitern zu erreichen. Geben Sie dann 300 Mikroliter Phenolchloroform-Isoamylalkohol in einen Abzug und wirbeln Sie kräftig ein. Zentrifugieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei 13.000 g und vier Grad Celsius.

Anschließend werden 280 Mikroliter der oberen wässrigen Phase vorsichtig in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Achten Sie darauf, keine Rückstände aus der Interphase zu entnehmen, die auch Proteine enthält, und entsorgen Sie die verbleibende untere Phase als organische Lösungsmittelabfälle. Wiederholen Sie die Behandlung und überführen Sie vorsichtig 270 Mikroliter der oberen wässrigen Phase in ein neues Reaktionsgefäß.

270 Mikroliter Chloroform in einen Abzug geben und kräftig vortexen. Zentrifugieren Sie die Probe. Nach der Zentrifugation werden 250 Mikroliter der oberen wässrigen Phase vorsichtig in ein neues Reaktionsröhrchen überführt, wobei darauf zu achten ist, dass keine Rückstände aus der Zwischenphase mitgenommen werden.

Entsorgen Sie die verbleibende Probe als organischen Lösungsmittelabfall. Fügen Sie dann 25 Mikroliter fünfmolares Natriumchlorid, 250 Mikroliter Isopropanol und fünf Mikroliter Glykogen als DNA-Träger hinzu. Drehen Sie die Röhrchen um und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur.

Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Probe, um die DNA auszufällen. Waschen Sie anschließend das DNA-Pellet mit 400 Mikrolitern 70 Vol.-% Ethanol und zentrifugieren Sie die Probe. Saugen Sie den Überstand vorsichtig an und lassen Sie das Pellet 10 Minuten bei Raumtemperatur trocknen.

Sobald das Pellet trocken ist, suspendieren Sie es wieder in 100 Mikrolitern TE-Puffer. Inkubieren Sie die nicht entvernetzte freie DNA-Probe vier Stunden lang bei 65 Grad Celsius, um Inter-DNA-Vernetzungen zu entfernen. Quantifizieren Sie abschließend die DNA-Menge mit einem Spektralphotometer und führen Sie ein kleines Aliquot durch, um die Fragmentgröße auf einem Agarosegel mit einem Volumen von 2 % zu überprüfen.

HeLA-Zellen wurden eine Stunde lang mit TNF stimuliert und mit FAIRE analysiert. Das Verhältnis zwischen freier und gesamter DNA wurde für den Promotor von ACTB, das Gen, das für Beta-Aktin kodiert, und die Positivkontrolle, eine Heterochromatinregion auf Chromosom 12, die Negativkontrolle und den IL8-Promotor bestimmt. Es wurde ein mit Ethidiumbromid gefärbtes Gel mit unterschiedlichen Beschallungszeiten erzeugt, das zeigt, dass die optimale Chromatingröße von 200 bis 300 Basenpaaren nach 20 Minuten Beschallung erreicht wurde.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Tagen durchgeführt werden. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. die Tiefensequenzierung, durchgeführt werden, um die Zugänglichkeit des Chromatins auf genomweiter Ebene zu bestimmen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Formaldehyd und Phenolchloroform äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Arbeiten in einem Abzug, das Tragen von Handschuhen und die ordnungsgemäße Entsorgung des Abfalls bei der Durchführung dieses Verfahrens sichergestellt werden sollten.