Name: Formaldehyd-gestützte Isolation regulatorischer Elemente auf die Maßnahme Chromatin Barrierefreiheit in Säugerzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Erfahren Sie die FAIRE-Methode zur Bestimmung der Chromatin-Zugänglichkeit in Säugerzellen. Dieses kostengünstige Protokoll erfordert keine spezialisierte Ausrüstung und ermöglicht zuverlässige epigenetische Analysen.

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Die Autoren möchte Tilman Borggrefe (Universität Gießen) für das bitte teilen das Ultraschall-Gerät. Die Arbeit von M.L.S. wird unterstützt durch Zuschüsse von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (SCHM 1417/8-3), SFB/TRR81, SFB1021, SFB1213, das Excellence Cluster Cardio-Pulmonale System (ECCPS, EXC 147/2), der Deutschen Krebshilfe (111447) und der IMPRS-HLR-Programm der Max-Planck-Gesellschaft.

1. Tag 1: Zellkultur
<ol><li>Kultur der Zellen auf den gewünschten Wert analysiert werden. Zelle Kulturbedingungen und Medien hängen die Zelltypen untersucht. Hinweis: Grundsätzlich ist jeder eukaryontische Zelle eine Analyse der Chromatin-Zugänglichkeit durch FAIRE zugänglicher. Für dieses Experiment 4 x 106 HEK-293T Zellen in einem einzigen 10 cm Teller in DMEM Medium mit 10 % (V/V) FBS und 1 % (w/V) Penicillin/Streptomycin ergänzt und bei 5 % CO2 und 37 ° C für 24 Stunden, bis die Zellen 70-80 % Zusammenfluss erreichen inkubiert gesät werden (~ 8 x 10 6 Zellen pro Gericht).</li>
</ol>(2) Tag 2: Formaldehyd-Vernetzung und Zelle Ernte
Achtung: Formaldehyd ist hochgiftig und muss immer unter einem Abzug verwendet werden. Tragen Sie Schutzkleidung (Handschuhe und Kittel). Entsorgen Sie die Abfälle entsprechend.
<ol><li>Fügen Sie Formaldehyd direkt in Zellkulturmedium unter einem Abzug, eine Endkonzentration von 1 % (V/V) (270 µL 37 % (V/V) Formaldehyd, 10 mL von Zellkulturmedium) zu erreichen. 10 min bei Raumtemperatur (20-25 ° C) inkubieren und erschlug die Platten manuell alle 2 min. Hinweis: Die Vernetzung Zeit ist je nach Zelltyp einstellbar. Für die Mehrheit der Zell-Linien ist 10 min Vernetzungsgrad ausreichend. Für Gewebe möglicherweise längere Inkubationen erforderlich um die Fixierung aller Zellen zu ermöglichen.</li>
	<li>Hinzufügen von Glycin, eine Endkonzentration von 0,125 M das Formaldehyd zu stillen (10 mL Kulturmedium 500 µL einer 2,5 M Glycin Aktie hinzufügen). 5 min bei Raumtemperatur inkubieren Sie und töteten Sie alle 2 min.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen 3 X mit Eis kaltem PBS (8 g/L NaCl, 0,2 g/L KCl, 1,44 g/L Na2HPO4 · 2 H2O, 0,24 g/L KH2PO4, justieren pH bis 7.4 mit HCl oder NaOH). Aspirieren Sie das Medium und direkt in der Zelle Kulturschale oder Kolben durch Zugabe von 10 mL PBS waschen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal, sehr vorsichtig bei lose adhärente Zellen wie HEK-293T. Fügen Sie PBS sorgfältig auf die Seite der Schale um Loslösung der Zellen zu vermeiden.</li>
	<li>Nach der dritten Wäsche Aufschwemmen der Zelle in 1 mL Eis kaltem PBS und Übertragung auf einen 1,5 mL Reaktionsgefäß auf Eis. Verwenden Sie Zelle Schaber, um die Zellen bei Bedarf zu trennen. Hinweis: Beim Starten mit einem begrenzten Material verwenden Sie niedrigen DNA-bindende Röhren Probenverlust während des Verfahrens zu vermeiden.</li>
	<li>Zentrifuge für 5 min bei 300 X g bei 4 ° C in einer gekühlten Tabletop Zentrifuge. Verwerfen Sie den Überstand durch sorgfältig Absaugen es.</li>
</ol>(3) Zell-Lyse und Chromatin Fragmentierung
<ol><li>Aufschwemmen der Zelle Pellet in 1 mL FAIRE Lyse Puffer (1 % (w/V), 10 mM EDTA, 50 mM Tris HCl pH 8.1 10 µg/mL Leupeptin, 10 µg/mL Aprotinin, 2 mM PMSF) und Aufschwemmen der Zellen durch vorsichtig nach oben und unten mehrmals pipettieren. Inkubieren Sie für 20 min auf Eis. Speichern Sie die Proben bei-80 ° C bei diesem Schritt bei Bedarf.</li>
	<li>Beschallen Sie die vernetzte DNA, in einer durchschnittlichen Größe von 200-300 bp zu scheren. Die spezifischen Einstellungen der Sonikator müssen für jede Quelle von Proben und das verwendete Anwendung von Ultraschall-Gerät ermittelt werden. In jedem Fall sicherstellen Sie, dass die DNA effizient geschert wird. Ein Optimierungsschritt für DNA-Scheren ist unter Schritt 5.14 beschrieben. Kühlen Sie die Proben auf Eis während der Anwendung von Ultraschall zur Erwärmung der Probe zu vermeiden.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Probe für 15 min und 13.000 x g bei 4 ° C.</li>
	<li>Übertragen Sie den Überstand in ein neues Reaktionsgefäß. Die Proben in 100 µL-Aliquots aufgeteilt. Speichern Sie die Proben bei-80 ° C, bei Bedarf. Hinweis: Das Protokoll kann an dieser Stelle unterbrochen werden.</li>
</ol>4. de-Vernetzung des Steuerelements DNA
<ol><li>Nehmen Sie 100 µL aliquoten aus Schritt 3.4 die Crosslink umkehren und als Referenz für Gesamt-DNA verwendet werden. Fügen Sie 10 µL RNase-A (10 mg/mL) und 1 h bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Fügen Sie 10 µL Proteinase K (20 mg/mL). Verwenden Sie ein programmierbarer Thermoblock für 4 h bei 37 ° C und dann für 6 h bei 65 ° C, die Proteine Spalten und die Querverbindungen zu inkubieren. Zu guter Letzt die Proben bei 4 ° C zu halten, bis das Protokoll fortgesetzt wird und dann fahren Sie mit Schritt 5 fort. Hinweis: Andere FAIRE Protokolle verwenden Chromatin Proben aus Zellen, die nicht vernetzt als Referenz, damit Abschaffung der Notwendigkeit einer de-Vernetzung11gewesen. Die Tatsache, dass diese Beispiele nicht vernetzt zu Unterschieden in der Beschallung Effizienz oder DNA-Stabilität führen könnte, ist die Nutzung der gesamten DNA-Referenzproben, die das gleiche Verfahren wie der Prüflinge unterzogen wurden daher genauer.</li>
</ol>5. Tag 3: Phenol: Chloroform Reinigung der DNA
<ol><li>Nehmen Sie die de-unvernetzten aliquoten aus Schritt 3.4. Fügen Sie 10 µL RNase-A (10 mg/mL) und 1 h bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Nehmen Sie die de-unvernetzten aliquoten Form Schritt 5.1 und die de-vernetzt-Probe aus Schritt 4.2 und fahren Sie parallel. Fügen Sie H2O zu einem Endvolumen von 300 µL hinzu.</li>
	<li>Fügen Sie energisch 300 µL Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol (25:24:1) in einer Dampfhaube und Wirbel. Achtung: Phenol ist korrosiven und toxischen und muss immer unter einem Abzug verwendet werden. Tragen Sie Schutzkleidung (Handschuhe und Kittel), stellen Sie sicher die Reaktionsgefäße sind fest verschlossen, und den Abfall entsprechend zu entsorgen.</li>
	<li>Zentrifuge für 10 min bei 13.000 x g bei 4 ° C.</li>
	<li>Übertragen Sie 280 µL der oberen wässrigen Phase sorgfältig auf ein neues Reaktionsgefäß. Achten Sie darauf, dass keine Ablagerungen aus der Interphase nehmen, die auch Proteine enthält. Entsorgen Sie die verbleibende untere Phase als organischen Lösungsmittelabfälle.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 5.3 bis 5.5 und übertragen Sie 270 µL der oberen wässrigen Phase sorgfältig auf ein neues Reaktionsgefäß.</li>
	<li>Fügen Sie 270 µL Chloroform kräftig in einer Dampfhaube und Wirbel. Hinweis: Dieser Schritt wird verwendet, um alle verbleibenden Phenol aus der Probe zu beseitigen.</li>
	<li>Zentrifuge für 10 min bei 13.000 x g bei 4 ° C.</li>
	<li>Übertragen Sie sorgfältig 250 µL der oberen wässrigen Phase in ein neues Reaktionsgefäß, kümmert sich nicht um jeglichen Schmutz von der Interphase zu tragen. Entsorgen Sie die restlichen Probe als organischen Lösungsmittelabfälle.</li>
	<li>Fügen Sie 25 µL 5 M NaCl und 250 µL Isopropanol. Fügen Sie 5 µL von Glykogen (20 mg/mL) als DNA-Träger. Mischen Sie gut durch invertieren die Röhren und 20 min bei Raumtemperatur inkubieren. Zentrifuge für 10 min bei 13.000 x g bei 4 ° C, die DNA auszufällen.</li>
	<li>Waschen Sie das DNA-Pellet mit 400 µL Ethanol 70 % (V/V). Zentrifuge für 10 min bei 13.000 x g bei 4 ° C.</li>
	<li>Den Überstand vorsichtig abgesaugt und das Pellet für 10 min bei Raumtemperatur trocknen lassen. Aufschwemmen Sie in 100 µL TE-Puffer (10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA).</li>
	<li>Inkubieren Sie de-unvernetzten freie DNA-Probe für 4 h bei 65 ° C, Inter DNA-Querverbindungen zu entfernen. Speichern Sie die Proben bei-20 ° C.</li>
	<li>Quantifizieren Sie die Menge an DNA mit einem Spektralphotometer zu und führen Sie eine aliquote überprüfen die Fragmentgröße auf einem Agarose-Gel 2 % (w/V). Passen Sie die Scheren Zeit und Intensität, je nach den Ergebnissen der DNA Größe Analyse von Agarose gel Elektrophorese, um einer durchschnittlichen Größe von 200-300 bp zu erhalten.</li>
</ol>6. Bestimmung der freien Versus Gesamt-DNA durch Quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR)
<ol><li>Das Verhältnis der Nukleosom-freie DNA (im folgenden als freie DNA bezeichnet) im Vergleich zu insgesamt DNA sich nach qRT-PCR17,18 richtet. Proben können auch von Microarray-Hybridisierung oder Tiefe Sequenzierung für genomweite Bestimmungen quantitativ analysiert werden.</li>
	<li>QPCR Primer für die Regionen getestet werden und für positive und negative Kontrollen zu entwerfen. Hinweis: Geeignete Positivkontrollen sind Grundierungen befindet sich in der Promoter aktiv transkribierten Housekeeping-Gene wie ACTB, GAPDH, TPI1 oder TUBA1A (β-Aktin, GAPDH, TPI oder α-Tubulin-Kodierung). Entsprechende negative Steuerelemente befinden sich in Heterochromatin Regionen oder gen-Wüsten. Anderen geeigneten Negativkontrollen können genomische Regionen neben den dynamisch geregelten Locus untersuchten Steuern für lokale Kopie Nummer Unterschiede (Tabelle 1) gestaltet werden.</li>
	<li>Die DNA-Proben, eine Endkonzentration von 10 ng/µL mit TE-Puffer verdünnen und den Verdünnungsfaktor berücksichtigen bei der endgültigen Berechnungen (siehe Punkt 6.5).</li>
	<li>Richten Sie eine qPCR-Reaktion im Triplicates in eine 96-Well-Platte, mit der folgenden Reaktion Mischung pro Bohrloch: Schablone DNA: 20 ng (2 µL), forward Primer 200 nM (0.4 µL einer Aktie 5 µM), rückwärts-Primer 200 nM (0.4 µL einer Aktie 5 µM) , eine kommerzielle gebrauchsfertige Reaktion Mischung mit grünen Farbstoff (5 µL aus einem 2 X bestand) und H2O bis 10 µL.</li>
	<li>Laufen in Echtzeit qPCR Gerät, mit dem absoluten Quantifizierung-Modus und die Ct der Proben mit verschiedenen Primer-Paaren zu bestimmen. Berechnen Sie das Verhältnis der Wiederherstellung des freien DNA in Gesamt-DNA für jede Grundierung mit Hilfe der folgenden Formel unter Berücksichtigung der Verdünnungsfaktoren aus Schritt 6.3: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57272/57272eq1.jpg"> Repräsentative Ergebnisse und eine Beispielrechnung sind in Tabelle 2angegeben.</li>
	<li>Zum Ausgleich der Unterschiede zwischen den Proben der Positivkontrolle Erholung Verhältnis zu normalisieren: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57272/57272eq2.jpg">
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Jahrmarkt ist eine robuste und kostengünstige Methode zur Identifizierung von Nukleosom-freien Regionen. Es basiert auf dem Prinzip, dass DNA umwickelt Nukleosomen vernetzt an den Histonen problemlos. Eine Phenol: Chloroform Extraktion wird verwendet, um die unvernetzten und eiweißfreie DNA-Fragmente aus der Protein-gebundenen DNA trennen, die in der unteren Phenol-Phase und in gewissem Maße in der Interphase (Abbildung 1) zu finden ist. Daher sind die Nukleosom-freien Regionen in der wässrigen Phase in der Fraktion der freien DNA überrepräsentiert. Eine Anzahl von Publikationen beschreiben ausführliche Protokolle der FAIRE Methode23,24,25,26, die zur Ergänzung der hier beschriebenen Vorgehensweise konsultiert werden können.
Ähnlich wie bei anderen Methoden zur Bestimmung der Chromatinstruktur verwendet, hängt die FAIRE Methode auch optimale Scheren der DNA. Wenn die Fragmente zu lang sind, wird jeder Nukleosom-freie Region durch die angrenzenden Chromatin-gebundene DNA maskiert werden. Wenn die Fragmente zu klein sind, wird die Erkennung von qPCR oder Tiefe Sequenzierung sehr schwierig. Aus diesem Grund ist die Beschallung der DNA eine entscheidende Parameter, der muss kontrolliert und optimiert, um Fragmente um erhalten 200-300 bp Länge, die 1-2 Nukleosomen (Abbildung 4) darstellen.
Ein weiterer Parameter, der das Endergebnis beeinflussen kann ist die Vernetzung der Probe. Obwohl das hier beschriebene Verfahren der Fixierung für die meisten Zelllinien gilt, der Forscher muss sorgfältig bewerten diesen Schritt für die besondere Probe untersucht, insbesondere bei Verwendung von Geweben, wo möglicherweise länger Fixierung erforderlich, damit die Formaldehyd, die Zellen in der Gewebeprobe zu erreichen.
Im Gegensatz zu anderen Methoden, wie z. B. DNase I oder micrococcal Nuklease Überempfindlichkeit, ChIP oder ATAC, FAIRE verlässt sich nicht auf eine enzymatische Aktivität oder spezifische Antikörper, und daher benötigt es keine Titration oder Optimierung der Reaktionsbedingungen. Dadurch FAIRE eine ideale Methode, Chromatin Zugänglichkeit für Labore mit wenig Erfahrung auf dem Gebiet des Chromatins zu messen. Darüber hinaus Pilotprojekte sind nur erforderlich, um die DNA Scheren Schritt und gleichzeitig Vernetzung optimieren bei Bedarf.
Die Methode wurde ursprünglich in Hefe6entwickelt, aber auch für Säugerzellen erweitert. Die DNA mit der FAIRE Methode gereinigt einsetzbar für tiefe Sequenzierung die genomweiten Charakterisierung der Chromatin-Status ermöglicht. Dies hat bereits bewährt sich eine Reihe von Studien8,9,10,11,12,13,19,27, 28.
Ergebnisse aus Jahrmarkt-Seq Experimente zeigen eine große Überschneidung mit Ergebnissen aus anderen Methoden wie DNase-Seq14, obwohl einige Unterschiede entstehen. Dies ist aufgrund der methodischen Unterschiede wie zum Beispiel, dass Nukleosomen entspanntere oder umgebaute noch die Spaltung durch DNase behindern könnten, während diese DNA-Regionen weniger anfällig wäre für DNS-Eiweiß-Querverbindungen zu produzieren und somit werden als Nukleosom-frei bestimmt würde Regionen mit Jahrmarkt-9. Auch das Vorhandensein von nicht-Histon-Proteine wie RNA-Polymerasen oder Leser Proteine für die epigenetischen Markierungen kann dazu führen, dass die DNA/Protein Querverbindungen und somit als Protein verpackt Regionen FAIRE Experimente interpretiert werden würde. Diese Einschränkungen sind jede Methode für die Bestimmung des Staates Chromatin, wodurch die Notwendigkeit, eine Kombination von verschiedenen Methoden verwenden, um einen umfassenden Einblick zu erhalten.

Die genomische DNA eukaryotischer Zellen ist dicht gepackt in Nukleosomen, die entfernt oder umgestaltet, um die Interaktion mit der DNA anderer Proteine ermöglichen muss. Die transkriptionelle Aktivierung eines Gens führt typischerweise zu einer offeneren Konfiguration ihrer nucleosomal Struktur, besonders in der + 1-Nukleosom-1Transkription durch die RNA-Polymerase zu erleichtern. Auch unterziehen regulatorische Regionen wie Promotoren und Enhancer dynamische Veränderungen in deren Chromatin Erreichbarkeit für die Interaktion mit Chromatin Modifikatoren oder Transkription Faktoren2ermöglichen. Verschiedene Ansätze wurden entwickelt, um diese Nukleosom-freien Regionen zu identifizieren. Dazu gehören die Empfindlichkeit gegenüber Nukleasen wie DNase ich3 oder micrococcal Nuklease4, die nur die DNA zugreifen können, wenn es um Nukleosomen nicht straff gewickelt ist. Andere Methoden zur Identifizierung von offenen Chromatin oder freie DNA sind die Transposase-vermittelte Integration von Retrotransposable Elementen (Assay für Transposase zugänglichen Chromatin, ATAC)5oder Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) mit Antikörper gegen Histone. Die FAIRE Methode basiert nicht auf die Kapazität eines Enzyms, die DNA zu erreichen oder die Bindung eines Antikörpers an ein bestimmtes Protein, sondern stützt sich auf die Reinigung von Nukleosom-freien Regionen von einem Phenol: Chloroform Extraktion6,7. Bei dieser Methode wird die DNA ist kovalent gebunden an Chromatin Proteine durch die Vernetzung Agent Formaldehyd und ist anschließend in kleine Stücke durch Ultraschallbehandlung geschert. Dicht gepackten Chromatin Regionen werden reichlich DNA/Protein vernetzt haben, während DNA-Regionen mit keinen oder wenigen Nukleosomen werden wenig oder gar keine querverbunden DNA/Protein-komplexe. Eine Phenol: Chloroform Extraktion ermöglicht Reinigung von den unvernetzten freie DNA in der wässrigen Phase, während die DNA vernetzt an Proteine in den organischen Phenol Phase oder wässrigen organischen Interphase zusammen mit den Proteinen erfasst wird. Die Quantifizierung dieser freie DNA im Vergleich zu einer Referenz der Gesamtstichprobe DNA ermöglicht die Identifikation von Chromatin freie Regionen. Die FAIRE Methode eignet sich für die Charakterisierung der einzelnen genomische Regionen wie hier beschrieben, sondern eignet sich auch für die Identifizierung der genomweiten Chromatin Zugänglichkeit bei tiefen Sequenzierung gekoppelt wie in verschiedenen Modellen8 beschrieben , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. Ergebnisse von Jahrmarkt-Seq und anderen Methoden wie ATAC-Seq14weitgehend überlappen. Die FAIRE Methode ist eine sehr robuste, billig und einfach durchzuführen Methode um Nukleosom-freien Regionen zu identifizieren. Im Gegensatz zu anderen Methoden es erfordert keine Pilotprojekte zu bestimmen, die angemessene Höhe der Verdauung nach Bedarf für Nukleasen (DNase-Seq, MNase-Seq) oder Transposasen (ATAC-Seq) und ausführlich in einem letzten Beitrag15. Die einzigen Parameter angepasst werden, sind die Beschallung Bedingungen und in einigen Fällen die Fixierzeit. Dieser Artikel beschreibt eine einfache Protokoll, ist schematisch in Abbildung 1 dargestellt, und das erfordert keine spezielle Ausrüstung außer einem Sonikator. Das Protokoll kann in relativ kurzer Zeit durchgeführt werden und macht FAIRE eine einfache und zuverlässige Methode zum Testen von Chromatin Barrierefreiheit in einer Reihe von verschiedenen Zelltypen von Lunge Zellen11 bis hin zu Maus Lebern16gewonnenen Primärzellen.

<table><tbody><tr><td>Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol 25:24:1</td><td>Carl Roth</td><td>A156.1</td><td></td></tr><tr><td>Glykogen, 20 mg/ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>ABsolute QPCR Mix, SYBR-Green, Rox</td><td>Thermo Fisher</td><td>AB1162B</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K, 20 mg/ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>RNase A, 10 mg/ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L8511</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma</td><td>A1603</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>milliTUBE 1 ml AFA Faser</td><td>Covaris</td><td>520130</td><td></td></tr><tr><td>Halter milliTUBE 1ml</td><td>Covaris</td><td>500371</td><td></td></tr><tr><td>Covaris S220 Fokussierter Ultraschallgerät</td><td>Covaris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Real-Time PCR System</td><td>Angewandte Biosisteme</td><td>4376600</td><td></td></tr></tbody></table>

formaldehyd-gestützte isolation regulatorischer elemente auf die maßnahme chromatin barrierefreiheit in säugerzellen

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

Entsprechende Genexpression in Reaktion auf extrazelluläre Signale, d. h. Abstammung und gewebespezifischen Gentranskription hängt hoch definierte Zustände von Chromatin Organisation. Die dynamische Architektur des Kerns wird durch mehrere Mechanismen gesteuert und prägt die transkriptionelle Ausgabe-Programme. Es ist daher wichtig, Locus-spezifische Chromatin Zugänglichkeit auf zuverlässige Weise zu bestimmen, die vorzugsweise unabhängig von Antikörpern, die eine potenziell verwirrende experimentelle Variabilität sein können. Chromatin Zugänglichkeit kann durch verschiedene Methoden, einschließlich der Formaldehyde-Assisted Isolation von regulatorischen Elemente (FAIRE) Assay gemessen werden, die die Bestimmung des allgemeinen Chromatin Barrierefreiheit in einer relativ geringen Anzahl von Zellen zu ermöglichen. Hier beschreiben wir eine FAIRE-Protokoll, das einfache, zuverlässige und schnelle Identifizierung der genomischen Regionen mit einer niedrig-Protein-Belegung ermöglicht. Bei dieser Methode wird die DNA kovalent gebunden an das Chromatin Proteine mit Formaldehyd als ein Vernetzungsmittel und zu den kleinen Stücken geschert. Die freie DNA wird danach angereichert mit Phenol: Chloroform Extraktion. Das Verhältnis von freier DNA wird durch quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) oder DNA-Sequenzierung (DNA-Seq) im Vergleich zu einer Kontrollprobe Vertretung Gesamt-DNA bestimmt. Die Regionen mit lockerer Chromatinstruktur werden in freie DNA-Probe, so dass die Identifizierung der genomischen Regionen mit niedrigeren Chromatin Verdichtung bereichert.

Wir haben die FAIRE Methode verwendet, um Unterschiede in der Chromatin-Erreichbarkeit der MHC-Klasse-II-Gene in den HEK293T Zellen als veröffentlichte19messen. MHC-Klasse-II-Kodierung Gene werden in antigenpräsentierende Zellen (APCs), konstitutiv oder als Reaktion auf Cytokine signaling20ausgedrückt. Die Expression von Genen ARBEITSPLATZAUSSTATTUNG treibt einen Aktivator Komplex an spezifische DNA-Elemente, bezeichnet XY-Boxen, befindet sich in der Projektträger und der von diesen Genen21,22-Enhancer bindet. Dies spiegelt sich auf der Ebene der Chromatin, wie durch unsere FAIRE Analyse ausgewählter Regionen in den MHC-Klasse-II-Gene HLA-DPB1 und HLA-DMA offenbart. Diese Experimente zeigten, dass das Chromatin ist rund um die Regionen umfasst die XY-Boxen, während es kompakter in den gen-Gremien (Abbildung 2 ist).
Als Beispiel für die Berechnungen in diesem besonderen Experiment verdünnt wir die gesamte DNA-Probe 10 Mal (Verdünnungsfaktor 10), und die freie DNA-Probe wurde nicht verdünnt (Verdünnungsfaktor 1) für die qRT-PCR. Das Cts erhalten für die verschiedenen Regionen getestet und die Berechnungen, die endgültigen Verwertung Verhältnisse und relativen Erholung Verhältnisse zu erhalten finden Sie in Tabelle 2. Diese relativen Erholung-Verhältnisse wurden mittels des ACTB Projektträgers als die positive Kontrolle erhalten. Beachten Sie, dass diese Berechnungen für eines der Replikate verwendet, um die in Abbildung 2dargestellten Ergebnisse zu generieren.
In einem anderen Kontext wurde Chromatin Zugänglichkeit zu einem Modell für induzierbaren Genexpression getestet. In diesem Fall wurden die rasche Veränderungen des Chromatins Verdichtung als Reaktion auf die Pro-Entzündungsreiz Tumor Nekrose Faktor (TNF) gemessen. HeLa-Zellen blieben unbehandelt oder angeregt mit TNF für 1 h, gefolgt von Jahrmarkt, Chromatin Verdichtung an den Promotor Region steuernden Expression des Gens Codierung der TNF-responsive Zytokin Interleukin 8 (IL8) zu messen. Diese Ergebnisse zeigten eine stark erhöhte Chromatin Zugänglichkeit bei der IL8 Promotor des TNF-stimulierten Zellen (Abbildung 3). Die Erreichbarkeit auf der IL-8-Veranstalter nach TNF-Stimulation ist sogar höher als die in der ACTB Projektträger zeigt eine dramatische Chromatin Umbau in dieser regulatorischen Region gefunden. Wie die Wiederherstellung Verhältnis erhalten in diesem Fall höher als die in der Region als Positivkontrolle (ACTB Promotor) erhalten ist das relative Erholung Verhältnis größer als 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57272/57272fig1.jpg"> Abbildung 1: die FAIRE Workflow. Zellen sind vernetzt direkt in die Zelle Kultur Kolben oder Schüssel durch Zugabe von Formaldehyd (A). Zellen sind nach dem abschrecken von der Formaldehyd, mit Eis kaltem PBS (B) drei Mal gewaschen und in ein Reaktionsgefäß, wo sie Nukleinsäuretablette in FAIRE Lyse Puffer und beschallt, um die DNA (C) Scheren, übertragen. Ein Aliquot des extrahierten Chromatins ist de-querverbunden durch Erhitzen bei 65 ° C, um die gesamte DNA Referenz (D), zu erhalten und danach ist die freie DNA extrahiert, mit Phenol: Chloroform, sowohl aus der vernetzt und de-vernetzte Aliquote (E). Zu guter Letzt die DNA quantifiziert und das Verhältnis der freien vs. insgesamt, die DNA ist berechnet (F). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57272/57272fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57272/57272fig2.jpg"> Abbildung 2: Ermittlung der Chromatin-Barrierefreiheit in den MHC-Klasse-II-gen-cluster in HEK293T Zellen. HEK293T Zellen wurden durch FAIRE ausgewertet. Das Verhältnis zwischen frei versus Gesamt-DNA (i.e., das Verhältnis der relativen Erholung) wurde für den Promotor des Gens ACTB als Positivkontrolle, eine Heterochromatin Region auf Chr. 12 als Negativkontrolle, und die regulatorischen Regionen und gen Gremien des MHC ermittelt Klasse II-Gene HLA-DMA und HLA-DPB1. Der obere Teil zeigt eine schematische Darstellung der Ort und die Positionen der Primer. Fehlerbalken darzustellen Standardabweichungen von zwei biologischen Wiederholungen in Triplicates gemessen. Die Figur wurde aus einem veröffentlichten Bericht19geändert. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57272/57272fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57272/57272fig3.jpg"> Abbildung 3: Veränderungen der DNA-Barrierefreiheit bei der IL8 Projektträger in Reaktion auf die Behandlung von TNF. HeLa-Zellen wurden mit TNF stimuliert (20 ng/mL) für 1 h und durch FAIRE analysiert. Das Verhältnis zwischen kostenlos gegen insgesamt, die DNA für die Förderer der ACTB (Positivkontrolle), eine Heterochromatin Region auf Chr. 12 (Negativkontrolle) und dem IL8 Projektträger bestimmt war. Fehlerbalken darzustellen Standardfehler des Mittelwertes (SEM) aus drei biologische Wiederholungen in Duplikate gemessen. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57272/57272fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57272/57272fig4.jpg"> Abbildung 4: Optimierung der Beschallung Bedingungen. Chromatin aus 293T Zellen extrahiert wurde sonifiziert mit einer fokussierten Sonikator mit geeigneten Rohren (Table of Materials). Das Chromatin sonorisiert wurde, für die angegebene Zeit mit Wiederholungen von 30 s mit den folgenden Einstellungen: Spitzenleistung 150, Einschaltdauer 15 Zyklen pro Burst 500, gefolgt von 30 s: Spitzenleistung 2.5, Einschaltdauer 15 Zyklen pro 500 platzen. Die daraus resultierende Chromatin war de-vernetzt, durch Phenol: Chloroform Extraktion gereinigt und in einem 2 % Agarose-Gel geladen. Eine Interkalation-Bromid, die gebeizt Gel wird angezeigt, und die Positionen der Molekulargewicht Marker sind in bp angegeben. In diesem Experiment wurde die optimale Chromatin-Größe (200-300 bp) nach 20 min der Zellulite erhalten. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57272/57272fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Grundierung</td>
			<td>Sequenz</td>
		</tr>
<tr>
<td>ACTB-Promoter-F</td>
			<td>AAAGGCAACTTTCGGAACGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>ACTB-Promoter-R</td>
			<td>TTCCTCAATCTCGCTCTCGC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Chr. 12 negative Kontrolle-F</td>
			<td>ATGGTTGCCACTGGGGATCT</td>
		</tr>
<tr>
<td>Chr. 12 negative Kontrolle-R</td>
			<td>TGCCAAAGCCTAGGGGAAGA</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DMA-XY-Box-F</td>
			<td>CATCAGTCACTGGGGAGACG</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DMA-XY-Box-R</td>
			<td>GCTTCCCAGCCCAGTTACAT</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DMA-5'-F</td>
			<td>GGAGAGAACAATCTCCGCTTCA</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DMA-5'-R</td>
			<td>AGCTGCTATGTGTGGTTGGT</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DMA-3'-F</td>
			<td>TGGGGACCTAGTTAGGGAGC</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DMA-3'-R</td>
			<td>AGATCCATGGGAGGAGGCTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DPB1-XY-Box-F</td>
			<td>GTCCAATCCCAGGGTCACAG</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DPB1-XY-Box-R</td>
			<td>TGAAAAGAGCTGCAGTCAGGA</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DPB1-5'-F</td>
			<td>GCGTGTTCATGTCTGCATCC</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DPB1-5'-R</td>
			<td>TGATCCTCAGAGCCTGGACA</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DPB1-3'-F</td>
			<td>CCAGCCTAGGGTGAATGTTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DPB1-3'-R</td>
			<td>GCCTGGGTAGAAATCCGTCA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IL8 Promoter-F</td>
			<td>GTGATGACTCAGGTTTGCCCT</td>
		</tr>
<tr>
<td>IL8 Promoter-R</td>
			<td>CTTATGGAGTGCTCCGGTGG</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Primer für qPCR.
<img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/57272/57272table2.jpg"> Tabelle 2: Beispielrechnungen FAIRE Relative Erholung Verhältnisse. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57272/Table_2.xlsx">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>

Die Plastizität der nuklearen Architektur wird durch dynamische epigenetischen Mechanismen, einschließlich nicht-kodierende RNAs, DNA-Methylierung, Nukleosom Neupositionierung sowie Histon Zusammensetzung und Modifikation gesteuert. Hier beschreiben wir eine Formaldehyde-Assisted Isolation von regulatorischen Elemente (FAIRE) Protokoll ermöglicht die Bestimmung der Chromatin-Barrierefreiheit in gewissem Sinne reproduzierbar, preiswert und unkompliziert.

Formaldehyd-gestützte Isolation regulatorischer Elemente auf die Maßnahme Chromatin Barrierefreiheit in Säugerzellen

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Chromatinzugänglichkeit eines genetischen Locus durch kovalente Vernetzung der DNA mit den assoziierten Proteinen zu bestimmen, gefolgt von der Reinigung und Quantifizierung der freien DNA. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Chromatinbereich zu beantworten, da die Zugänglichkeit der DNA unabhängig vom Zelltyp in unbehandelten Zellen und auch in Zellen, die sich einem Chromatin-Remodeling unterziehen, bestimmt werden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass keine Enzyme zur Spaltung der DNA oder Antikörper verwendet werden müssen, die für jede Versuchsumgebung titriert werden müssen.Dieses Protokoll hat den zusätzlichen Vorteil, dass es außer einem Ultraschallgerät keine spezielle Ausrüstung benötigt. Das Verfahren wird von Olesja Ritter und Tabea Riedlinger, Doktorandinnen aus meinem Labor, vorgeführt. Zu Beginn des Protokolls fügen Sie Formaldehyd direkt in das Wachstumsmedium von Zellen hinzu, die einen Tag zuvor ausgesät wurden, um eine Endkonzentration von 1 Vol.-% zu erreichen.Inkubieren Sie das Medium 10 Minuten lang bei Raumtemperatur und schwenken Sie die Platten alle zwei Minuten manuell. Als nächstes fügen Sie Glycin bis zu einer Endkonzentration von 0,125 molar hinzu, um das Formaldehyd zu löschen. Inkubieren Sie die Lösung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur und schwenken Sie sie alle zwei Minuten.Aspirieren Sie das Medium und geben Sie dann vorsichtig eiskaltes PBS an den Rand der Schüssel, um die Zellen zu waschen. Saugen Sie das Medium an und wiederholen Sie die Wäsche vorsichtig zweimal. Nach der dritten Wäsche die Zellen in einem Milliliter eiskaltem PBS wieder suspendieren und bei Bedarf mit einem Zellschaber die Zellen ablösen.Übertragen Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen auf Eis. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 300 g und vier Grad Celsius in einer gekühlten Tischzentrifuge. Saugen Sie den Überstand vorsichtig ab und entsorgen Sie ihn.Suspendieren Sie das Zellpellet wieder in einem Milliliter FAIRE-Lysepuffer, indem Sie mehrmals vorsichtig auf und ab pipettieren. Inkubieren Sie die Zellen 20 Minuten lang auf Eis. Nach der Inkubation wird die vernetzte DNA beschallt, um sie auf eine durchschnittliche Größe von 200 bis 300 Basenpaaren zu bringen, und die Proben während der Beschallung abgekühlt, um eine Erwärmung der Probe zu vermeiden.Die Fragmentierung der DNA ist für dieses Experiment von entscheidender Bedeutung, da die Größe der Fragmente die Empfindlichkeit der Lösung der gesamten Technik beeinflusst, daher ist es wichtig, die Beschallungsbedingungen im Voraus sorgfältig festzulegen und die Größe der Chromatinfragmente in jedem einzelnen Experiment zu überprüfen. Zentrifugieren Sie die Probe 15 Minuten lang und 13.000 g bei vier Grad Celsius. Dann wird der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt.Die Proben werden in 100 Mikroliter Aliquots aufgeteilt. Verwenden Sie ein 100-Mikroliter-Aliquot, um die Vernetzung umzukehren und als Referenz für die Gesamt-DNA verwendet zu werden. Fügen Sie 10 Mikroliter RNase A hinzu und inkubieren Sie die Probe eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius.Als nächstes fügen Sie 10 Mikroliter Proteinase K hinzu. Verwenden Sie einen programmierbaren Thermoblock, um die Probe vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius und dann sechs Stunden lang bei 65 Grad Celsius zu inkubieren, um die Proteine zu spalten und die Vernetzungen umzukehren. Entnehmen Sie ein neues Aliquot von 100 Mikrolitern, fügen Sie 10 Mikroliter RNase A hinzu und inkubieren Sie die Probe eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation fahren Sie mit der nicht entvernetzten Probe und der entvernetzten Probe aus dem vorherigen Abschnitt parallel fort.Fügen Sie H2O hinzu, um ein Endvolumen von 300 Mikrolitern zu erreichen. Geben Sie dann 300 Mikroliter Phenolchloroform-Isoamylalkohol in einen Abzug und wirbeln Sie kräftig ein. Zentrifugieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei 13.000 g und vier Grad Celsius.Anschließend werden 280 Mikroliter der oberen wässrigen Phase vorsichtig in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Achten Sie darauf, keine Rückstände aus der Interphase zu entnehmen, die auch Proteine enthält, und entsorgen Sie die verbleibende untere Phase als organische Lösungsmittelabfälle. Wiederholen Sie die Behandlung und überführen Sie vorsichtig 270 Mikroliter der oberen wässrigen Phase in ein neues Reaktionsgefäß.270 Mikroliter Chloroform in einen Abzug geben und kräftig vortexen. Zentrifugieren Sie die Probe. Nach der Zentrifugation werden 250 Mikroliter der oberen wässrigen Phase vorsichtig in ein neues Reaktionsröhrchen überführt, wobei darauf zu achten ist, dass keine Rückstände aus der Zwischenphase mitgenommen werden.Entsorgen Sie die verbleibende Probe als organischen Lösungsmittelabfall. Fügen Sie dann 25 Mikroliter fünfmolares Natriumchlorid, 250 Mikroliter Isopropanol und fünf Mikroliter Glykogen als DNA-Träger hinzu. Drehen Sie die Röhrchen um und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur.Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Probe, um die DNA auszufällen. Waschen Sie anschließend das DNA-Pellet mit 400 Mikrolitern 70 Vol.-% Ethanol und zentrifugieren Sie die Probe. Saugen Sie den Überstand vorsichtig an und lassen Sie das Pellet 10 Minuten bei Raumtemperatur trocknen.Sobald das Pellet trocken ist, suspendieren Sie es wieder in 100 Mikrolitern TE-Puffer. Inkubieren Sie die nicht entvernetzte freie DNA-Probe vier Stunden lang bei 65 Grad Celsius, um Inter-DNA-Vernetzungen zu entfernen. Quantifizieren Sie abschließend die DNA-Menge mit einem Spektralphotometer und führen Sie ein kleines Aliquot durch, um die Fragmentgröße auf einem Agarosegel mit einem Volumen von 2 % zu überprüfen.HeLA-Zellen wurden eine Stunde lang mit TNF stimuliert und mit FAIRE analysiert. Das Verhältnis zwischen freier und gesamter DNA wurde für den Promotor von ACTB, das Gen, das für Beta-Aktin kodiert, und die Positivkontrolle, eine Heterochromatinregion auf Chromosom 12, die Negativkontrolle und den IL8-Promotor bestimmt. Es wurde ein mit Ethidiumbromid gefärbtes Gel mit unterschiedlichen Beschallungszeiten erzeugt, das zeigt, dass die optimale Chromatingröße von 200 bis 300 Basenpaaren nach 20 Minuten Beschallung erreicht wurde.Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Tagen durchgeführt werden. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. die Tiefensequenzierung, durchgeführt werden, um die Zugänglichkeit des Chromatins auf genomweiter Ebene zu bestimmen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Formaldehyd und Phenolchloroform äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Arbeiten in einem Abzug, das Tragen von Handschuhen und die ordnungsgemäße Entsorgung des Abfalls bei der Durchführung dieses Verfahrens sichergestellt werden sollten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Die molekularen Mechanismen der Dekondensation von hochverdichtetem mitotischem Chromatin sind unklar. Wir präsentieren einen zellfreien Assay, der auf mitotischen Chromatinclustern basiert, die aus HeLa-Zellen und Xenopus laevis-Eiextrakt isoliert wurden und den Dekondensationsprozess in vitro originalgetreu rekonstituieren.

Ein zellfreien Assay zu Chromatindekondensation Studieren am Ende der Mitose

Die Identifizierung von Molekülen, die mit spezifischen genomischen Regionen von Interesse assoziiert sind, ist erforderlich, um die Mechanismen der Regulation der Funktionen dieser Regionen zu verstehen. Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Durchführung einer technischen DNA-bindenden Molekül-vermittelten Chromatin-Imunopräzipitation (enChIP) zur Identifizierung von Proteinen und RNAs, die mit einer bestimmten genomischen Region assoziiert sind.

Isolierung von spezifischen genomischen Regionen und Identifizierung von assoziierten Moleküle durch enChIP

Sequentielle Salzgewinnung gebunden Chromatin Proteine ist ein nützliches Werkzeug für die Bestimmung der Bindungseigenschaften von großen Proteinkomplexen. Diese Methode kann verwendet werden, um die Rolle der einzelnen Untereinheiten oder Domänen in die allgemeine Affinität von einem Proteinkomplex, bulk-Chromatin zu bewerten.

Sequentielle Salz Extraktionen für die Analyse von Bulk-Chromatin bindenden Eigenschaften von Chromatin komplexe ändern

Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll für die Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) unter Verwendung einer reifen Maus-T-Zelllinie. Dieses Protokoll ist geeignet, um die Verteilung von spezifischen Histonmarken an bestimmten Promotorstellen oder genomweiten zu untersuchen.

Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) in Maus-T-Zell-Linien

Eine neuartige Protokoll für die Vorbereitung von Chromatin von Erwachsenen Maus Skelettmuskulatur zur Erforschung der Genregulation in Muskelfasern von Chromatin Immunopräzipitation angepasst präsentiert.

Verbesserte Protokoll für Chromatin Immunopräzipitation aus Maus skelettartiger Muskel

Wir präsentieren Ihnen eine effektive und reproduzierbare Methode zum isolieren und Kultur neurale Vorläuferzellen aus embryonalen und postnatale Hirngewebe für Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) von Histon 3 Lysin 79 Dimethylation (H3K79me2) - eine Histon-Markierung befindet sich innerhalb der globulären Domäne des Histon 3.

Isolierung und Kultivierung von neuronalen Vorläuferzellen gefolgt von Chromatin Immunopräzipitation Histon 3 Lysin 79 Dimethylation Marke

Dies ist eine Methode, um neuartige DNA-Interaktion Proteine an zielgruppenspezifischen Loci, unter Berufung auf Sequenz-spezifische Erfassung von querverbunden Chromatin für nachfolgende Proteomic Analysen zu identifizieren. Keine Vorkenntnisse über potenzielle Bindeproteine noch Zelle Änderungen sind erforderlich. Ursprünglich entwickelt für die Hefe, wurde die Technologie jetzt für Säugerzellen angepasst.

Anpassung der Hybridisierung erfassen der Chromatin-assoziierte Proteine für Proteomics für Säugerzellen

Verordnung der Chromatin-Umgebung ist ein wesentlicher Prozess erforderlich für die ordnungsgemäße Genexpression. Hier beschreiben wir eine Methode zur Steuerung der Genexpression durch die Rekrutierung von Chromatin-modifizierende Maschinen Gen-spezifischen und reversibel.

Gentranskription durch Umleiten zellulären Maschinerie mit chemischen epigenetische Modifikatoren zu unterdrücken

Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) ist ein leistungsfähiges Werkzeug zum Verständnis der molekularen Mechanismen der Genregulation. Das Verfahren birgt jedoch Schwierigkeiten bei der Erlangung reproduzierbarer Chromatinfragmentierung durch mechanisches Scheren. Hier bieten wir ein verbessertes Protokoll für einen ChIP-Assay mit enzymatischer Verdauung.

Chromatin Immunoprecipitation Assay mit Mikrokokken-Nukleasen in Säugetierzellen

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Chromatinpräparation aus tiefgefrorenem Gewebe und eignet sich für die Vernetzung der Chromatin-Immunpräzipitation (X-ChIP), gefolgt von einer quantitativen PCR-Analyse (X-ChIP-qPCR) oder einem Next-Generation-Sequencing-Ansatz (X-ChIP-seq).

Chromatinextraktion aus gefrorenem chimärem Lebergewebe für die Chromatin-Immunpräzipitationsanalyse

Hier stellen wir ein schnelles und einfaches ATAC-seq-Protokoll vor, das im L4-Stufen-Caenorhabditis elegans-Ganzwurm mit nur 30 μL Wurmpellet implementiert werden kann.

Chromatin-Barriereprofilierung bei ganzen L4-Larven von Caenorhabditis elegans

Erfahren Sie die FAIRE-Methode zur Bestimmung der Chromatin-Zugänglichkeit in Säugerzellen. Dieses kostengünstige Protokoll erfordert keine spezialisierte Ausrüstung und ermöglicht zuverlässige epigenetische Analysen.

Formaldehyd-gestützte Isolation regulatorischer Elemente auf die Maßnahme Chromatin Barrierefreiheit in Säugerzellen

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