Bestimmung der Proteinexpressionsgrad in kultivierten Zellen von Immunocytochemistry auf Paraffin-eingebetteten Zellenblöcken
20. Mai 2018
Derzeit ist immunofluorescent Flecken auf festen Zellen die Methode der Wahl zur Bestimmung der Ausdruck proteingehalte wenn morphologische Informationen auch notwendig ist. Dieses Protokoll enthaltenen bietet für ein alternatives Verfahren zur Immunocytochemistry auf Paraffin-eingebetteten Zellenblöcken.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Expression von Proliferationsmarkern von Interesse durch immunzytochemische und histologische Analysen von in Thromboplastin-Plasma-Zellblöcken eingebetteten Gewebeklumpen zu analysieren. Diese Methode kann helfen, die Schlüsselfrage nach der klinischen Pathologie der Zellblockierung durch das Gewebe zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser alternativen Methode zur immunzytochemischen Analyse von in Paraffin eingebetteten Zellblöcken ist die technische Einfachheit der Verfahren.
Wenn eine 100-Millimeter-Schale mit HeLa-Zellkultur die Konfluenz erreicht, ersetzen Sie den Überstand durch 10 Milliliter HeLa-Zellkulturmedium ohne FBS und stellen Sie die Schale wieder in den Zellkultur-Inkubator. Waschen Sie die Zellen nach 48 Stunden mit zwei Millilitern PBS, gefolgt von einer zweiminütigen Inkubation in zwei Millilitern 0,25 % EDTA plus Trypsin bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Wenn sich die Zellen abgelöst haben, stoppen Sie die Reaktion mit fünf Millilitern vollständigem Medium und überführen Sie die Zelllösung in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen.
Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation, gefolgt von zwei Wäschen in zwei Millilitern kaltem PBS pro Waschgang. Nach der zweiten Wäsche den Überstand durch einen Milliliter 95%iges Ethanol ersetzen und das Pellet durch Vortexen mischen. Lege dann die fixierten Zellen auf Eis.
Um einen Paraffinzellblock herzustellen, zentrifugieren Sie nach der Entnahme von EDTA-Plasma aus gesundem Spenderblut die Proben und überführen Sie 200 bis 400 Mikroliter überstehende Plasmaaliquote in einzelne Mikrofuge-Röhrchen. Als nächstes füge ich den fixierten HeLa-Zellen etwa 200 Mikroliter Plasma, etwa 200 Mikroliter Thromboplastin und etwa 200 Mikroliter 025 molares Calciumchlorid hinzu. Lassen Sie die Mischungen zehn Minuten lang bei Raumtemperatur Zellgerinnsel bilden, waschen Sie die Gerinnsel dann zweimal mit einem Milliliter PBS und dekantieren Sie die Gerinnsel nach dem zweiten Waschen vollständig auf einzelne Stücke von mit Formalin angefeuchtetem Filterpapier.
Wickeln Sie die Klumpen in das Filterpapier ein und legen Sie die Tücher mit einem Stecknadelsatz in einzelne Taschentuchkassetten in der Mitte von vier anderen mit Formalin angefeuchteten Papierstücken. Legen Sie dann die Gewebekassetten in Gläser mit 50 Millilitern gepuffertem Formalin für die Formalinfixierung über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Morgen laden Sie die Kassetten in einen Gewebeprozessor, um über Nacht Wasser zu entfernen und die fixierte Zellkonditionierung zu erhalten.
Mindestens eine Stunde vor Ende des Verarbeitungsvorgangs eine beheizte Einbettstation einschalten, um das Paraffin zu schmelzen. Wenn die Einbettstation und das Gerinnsel fertig sind, bestätigen Sie das Vorhandensein von geschmolzenem Paraffin in der Metallform und übertragen Sie ein gebildetes Zellgerinnsel in das Paraffin. Legen Sie eine neue Tissue-Kassette ohne Deckel in die Metallform und bedecken Sie die Kassette mit mehr geschmolzenem Paraffin.
Lassen Sie das Paraffin 30 bis 60 Sekunden lang in einer kalten Platte erstarren. Trennen Sie dann die Tissue-Kassette von der Metallform. Um Schnitte für die immunzytochemische Analyse vorzubereiten, lokalisieren Sie das Zellgerinnsel in einem Paraffinzellblock und schneiden Sie den Block mit einem Mikrotom in drei bis vier Mikrometer dicke Scheiben.
Legen Sie die Paraffinstücke auf salzbeschichtete Objektträger und legen Sie die Objektträger für 30 Minuten in einen 37 Grad heißen Ofen. Wenn die Schnitte an den Objektträgern haften, entparaffinisieren Sie die Objektträger vier Minuten lang in 15 Millilitern Xylol, gefolgt von einer Dehydratisierung der Schnitte mit aufeinanderfolgenden zweiminütigen absteigenden Ethanol-Inkubationen. Nach der Inkubation mit 80 % Ethanol spülen Sie die Schnitte 10 Minuten lang unter fließendem Wasser ab und kochen Sie die Objektträger in einem Glas mit 40 Millilitern Tris-EDTA-Rückgewinnungspuffer 30 Minuten lang.
Am Ende der Inkubation waschen Sie die entnommenen Antigen-Objektträger unter fließendem Wasser, gefolgt von einer 10-minütigen Inkubation in 95%igem Ethanol bei vier Grad Celsius. Verwenden Sie nach dem Trocknen an der Luft einen hydrophoben Stift, um den Zellfärbebereich auf jedem Objektträger zu umschließen. Waschen Sie die Objektträger in TBS-T, gefolgt von einer Inkubation in einem Wasserstoffperoxidblock für 15 Minuten bei Raumtemperatur, um alle Reste der Peroxidaseaktivität zu entfernen.
Waschen Sie die Objektträger dreimal jeweils zwei Minuten lang in TBS-T und beschriften Sie dann die Schnitte eine Stunde lang mit 100 Mikrolitern einer primären Antikörpermischung aus dem interessierenden immunzytochemischen Färbekit, gefolgt von fünf zweiminütigen TBS-T-Waschgängen. Nach dem letzten Waschen inkubieren Sie die Objektträger 15 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln in einem primären Antikörperverstärker aus dem Kit. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Abschnitte viermal in TBS-T und fügen Sie nach dem letzten Waschen etwa 200 Mikroliter Sekundärantikörper hinzu, der mit Meerrettichperoxidase markiert ist, für eine 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur.
Waschen Sie die verbesserten Abschnitte fünfmal in frischem TBS-T, gefolgt von der Zugabe von 100 Mikrolitern Diaminobenzidinlösung pro Abschnitt für drei Minuten. Waschen Sie die Objektträger zweimal in TBS-T und beschriften Sie die Schnitte eine Minute lang mit 100 Mikrolitern Hämatoxylinlösung. Waschen Sie dann die Objektträger noch einmal in TBS-T und inkubieren Sie die Objektträger zwei Minuten lang in 95 % Ethanol, gefolgt von einem Tauchgang in frischem 95 % Ethanol und zwei Tauchgängen in 100 % Ethanol.
Inkubieren Sie die mit Ethanol dehydrierten Abschnitte in 40 Millilitern Xylol in einem Glas für fünf Minuten und lassen Sie die Objektträger an der Luft trocknen. Montieren Sie dann ein Deckglas auf jeden Objektträger und betrachten Sie die Proben unter einem Lichtmikroskop. Die Hämatoxylin- und Eosin-Färbung des in Paraffin eingebetteten Gewebes, wie gerade gezeigt, zeigt sich vor allem in takten Zellkernen und im Zytoplasma, was auf eine hervorragende morphologische Konservierung der Zellproben durch diese Methode hindeutet.
Schlecht präparierte Zellblöcke weisen jedoch eine schlechte Morphologie und eine unregelmäßige Markierung auf, selbst wenn die Proben richtig gefärbt sind. Das Zytoskelett-assoziierte Protein zwei wird typischerweise im kondensierten Chromatin, in der mitotischen Spindel und im Zytoplasma beobachtet. Nur die Zellen mit einer Zytoskelett-assoziierten Protein-Zwei-Färbung im kondensierten Chromatin sind mitotische Zellen, während nur wenige Zytoskelett-assoziierte Protein zwei positive Zellen in der serumarmen HeLa-Zellkulturpopulation gefunden werden.
Die meisten der hochmitotischen HeLa-Zellen sind auch Ki-67-positiv und eine Ki-67-Färbung ist in den Zellkernen zu beobachten. Nur etwa die Hälfte der serumarmen HeLa-Zellen exprimiert diesen Proliferationsmarker. Einmal gemeistert, kann diese Technik in sechs Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.
Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Zellen auf eine angemessene Dichte zu verdünnen, um ein gutes Gerinnsel zu bilden. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie z.B. die durchflusszytometrische Analyse der fixierten Zellen, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Zellzyklusphase während der Synchronisation zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für eine Zukunft auf dem Gebiet der Leberpathologie, um die Erstellung von Expressionsprofilen in Zelllinien zu erforschen und gleichzeitig morphologische Informationen in kultivierten Zellen zu erhalten.
Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Immunzytochemie durchführt und Plasmathromboplastinblöcke aus den kultivierten Zellen vorbereitet. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit gefährlichen Reagenzien wie Xylol äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und einem Laborkittel getroffen werden sollten.
Übersicht
Dieser Artikel stellt eine Methode zur immunzytochemischen Analyse von Proliferationsmarkern unter Verwendung von Paraffin-eingebetteten Zellblöcken vor. Das Protokoll betont technische Einfachheit und liefert gleichzeitig zuverlässige morphologische Informationen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Immunzytochemie
- histologische Analyse
- Zellkulturtechniken
Hintergrund
- Die immunfluoreszenzchemische Färbung wird häufig zur Analyse der Proteinausprägung verwendet.
- Alternative Methoden können den Prozess vereinfachen, ohne die Genauigkeit zu beeinträchtigen.
- Das Verständnis der Zellproliferation ist in der klinischen Pathologie von entscheidender Bedeutung.
- Paraffin-eingebettete Zellblöcke ermöglichen detaillierte morphologische Untersuchungen.
Zweck der Studie
- Die Analyse von Proliferationsmarkern in Zellkulturen durchzuführen.
- Eine vereinfachte Anleitung für die immunzytochemische Analyse bereitzustellen.
- Die morphologische Erhaltung von Zellproben zu beurteilen.
Verwendete Methoden
- Zellkultur und Behandlung mit Thromboplastin-Plasma.
- Herstellung von Paraffin-Zellblöcken aus fixierten Zellen.
- Schnitt von Paraffinblöcken zur immunzytochemischen Analyse.
- Färbung und Mikroskopie zur Beurteilung der Zellmorphologie und Markerexpression.
Hauptergebnisse
- Nachweis einer wirksamen Konservierung der Zellmorphologie.
- Identifizierung von mitotischen Zellen mittels spezifischer Proteinanfärbung.
- Aufzeigen einer Korrelation zwischen Färbemustern und Zellproliferation.
- Hervorhebung der Vorteile der Verwendung von paraffin-eingebetteten Proben.
Schlussfolgerungen
- Die Methode bietet eine zuverlässige Alternative zur Untersuchung der Zellproliferation.
- Die technische Einfachheit erhöht die Zugänglichkeit für Forscher.
- Bewahrt hochwertige morphologische Daten neben der Analyse der Proteinexpression.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Immunzytochemie an paraffin-eingebetteten Zellblöcken stellt eine technisch einfache Alternative zur immunfluoreszenten Färbung für die Analyse der Proteinausprägung dar, wobei gleichzeitig die morphologischen Informationen erhalten bleiben. Dieser Ansatz unterstützt die Zielvalidierung und die Assay-Entwicklung, indem er einen zuverlässigen Nachweis von Proliferationsmarkern in kultivierten Zellen unter kontrollierten Bedingungen ermöglicht. Die Methode erhöht die Vorhersagegenauigkeit in der frühen Forschung, da der architektonische Kontext zusammen mit quantitativen Daten zur Proteinausprägung beibehalten wird.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Nachweis von Proliferationsmarkern wie CKAP2 und Ki-67 in definierten zellulären Kontexten.
- Operativer Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung, indem Proteinexpressionsmuster mit mitotischer Aktivität und Reaktionen auf Serumverarmung korreliert werden.
- Wissenschaftlicher Wert: Erleichtert die Aufklärung von Signalwegen, indem die subzelluläre Lokalisation zytoskelettassoziiierter Proteine in kondensierter Chromatinstruktur und Zytoplasma erhalten bleibt.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Arbeitsabläufe durch konsistente Paraffineinbettung und Schnitt von Zellklumpen vor.
- Operativer Wert: Trägt zur Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays bei, indem standardisierte Thromboplastin-Plasma-Koagulationsbildung und histologische Aufarbeitung angewendet werden.
- Wissenschaftlicher Wert: Zeigt die Eignung für die Durchführung von Screening-Verfahren auf, indem quantitative Auswertungen aus DAB-basierter immunzytochemischer Färbung generiert werden, die mit der Lichtmikroskopie-Analyse kompatibel sind.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Erläutert die Krankheitsrelevanz durch Korrelation von In-vitro-Färbemustern mit Mustern in paraffin-eingebetteten Tumorgeweben.
- Operativer Wert: Beschreibt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem die morphologische Genauigkeit erhalten bleibt, vergleichbar mit immunhistochemischen Färbungen in Geweben.
- Wissenschaftlicher Wert: Konzentriert sich auf den prädiktiven Entwicklungsrisikoverringerungswert, indem die Beurteilung modifizierter Kulturbedingungen (z. B. serumfreie Vorinkubation) ermöglicht wird, während die architektonischen Informationen bewahrt bleiben.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode positioniert sich innerhalb des Entdeckungsprozesses von der frühen Entdeckung bis zur Leitstrukturforschung und unterstützt Hypothesentests sowie die Entwicklung biomarkerbasierter Assays ausschließlich dann, wenn Proliferationsmarker im Zusammenhang mit dem therapeutischen Ziel stehen.
- Entdeckungsbiochemie: Erläutert, wie die Methode die Hypothesenprüfung durch die Detektion mitotischer Zellen mittels CKAP2- und Ki-67-Färbung in kondensierter Chromatinstruktur unterstützt.
- Screening: Beschreibt die Bereitschaft des Assays durch standardisierte Schnittführung (3–4 μm) und Antigen-Retrieval unter Verwendung von Tris-EDTA-Puffer vor der immunzytochemischen Färbung.
- Analytik: Betont Messgrößen wie die Intensität des DAB-Chromogensignals und die Gegengefärbung mit Hämasit, die einen Vergleich der Proteinexpression unter verschiedenen experimentellen Bedingungen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Methode mit der präklinischen Kontinuität, indem sie die Ähnlichkeit der Färbungsmuster mit der immunhistochemischen Analyse in Paraffin-geweben von Krebstumoren aufzeigt.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt die Methode als wiederverwendbare Fähigkeit für mehrere Proliferationsmarker und Zelllinienmodelle über HeLa-Zellen hinaus dar.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit durch zuverlässige Detektion von Proliferationsmarkern mit erhaltener subzellulärer Lokalisation.
- Operativer Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit mittels Thromboplastin-Plasma-Gerinnung und automatisierter Gewebeverarbeitung.
- Strategischer Wert: Verbesserte Go/No-Go-Entscheidungen durch Verringerung mechanistischer Unschärfen in der Zellzyklusanalyse mittels Validierung mit zwei Markern.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierung, indem die Beurteilung von Substanzeffekten auf den Mitoseindex unter definierten Kulturbedingungen ermöglicht wird.
Durchführungsüberlegungen
- Notwendige wissenschaftliche Fachkenntnisse in histologischen Techniken, Antikörper-Validierung und Lichtmikroskopie.
- Erforderliche Instrumentierung und analytische Infrastruktur, einschließlich Mikrotom, Gewebeprozessor, beheizter Einbettungsstation und Fähigkeiten zum Umgang mit Xylol.
- Anforderungen an die Standardisierung zwischen Teams hinsichtlich Gerinnungsbildung, Schnittadhäsion und Konsistenz der Färbeprotokolle über verschiedene Labore hinweg.
- Überlegungen zur Anpassung an verschiedene Modellsysteme, insbesondere zur Optimierung der Zelldichte und Gerinnungsbildung in nicht-HeLa-Zelllinien.
- Praktische Einschränkungen, die durch die Quellen belegt sind: schlecht hergestellte Zellblöcke weisen eine schlechte Morphologie und unregelmäßige Markierung auf, selbst bei korrekter Färbung.
