Optimierung der Nutzung eines Liquid Handling Roboters, einen hohen Durchsatz nach vorn Chemische Genetik Bildschirm von Arabidopsis Thaliana durchzuführen

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, ein chemisches Genetik-Screening mit hohem Durchsatz an Arabidopsis-Sämlingen durchzuführen. Mit dieser Methode können wir effizient und effektiv neue kleine Moleküle entdecken, die die Pflanzenphysiologie beeinflussen. Diese Entdeckungen werden die Grundlage für weitere Studien zu physiologischen Prozessen wie der Zellwandsynthese bilden.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Zehntausende von kleinen Molekülen in kurzer Zeit gescreent werden können. Obwohl dieses Protokoll für die Modellpflanzenart Arabidopsis konzipiert ist, kann es leicht an andere Organismen wie Insekten, Mikroorganismen oder Zellkulturen angepasst werden. Die Idee zu diesem Protokoll kam uns, als wir erfuhren, dass das Genomikzentrum der Universität ein Zuhause für einen überschüssigen Liquid-Handling-Roboter finden musste.

Wir haben uns sofort freiwillig bereit erklärt, es ihnen abzunehmen. Bereiten Sie die Verdünnungsbibliothek und den Multichannel Tip Wash Automated Labware Positioner (ALP) vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Laden Sie den Stapler 10, der an das Staplerkarussell angeschlossen ist, manuell.

Legen Sie in den Hotels A bis D zuerst eine Schachtel AP96 P20 Pipettenspitzen in Raum Eins ein. Laden Sie dann vier 96-Well-V-Bodenplatten in den Räumen Zwei bis Fünf, wobei zwei obere Platten Bestandskonzentrationen aus der bestellten Bibliothek enthalten und die anderen beiden unteren Platten leer sind. Laden Sie zusätzlich eine Schachtel AP96 P20 Pipettenspitzen in Raum Sechs.

Laden Sie vier 96-Well-V-Bodenplatten in den Räumen sieben bis neun, wobei die beiden oberen Platten die Bestandskonzentrationen der bestellten Bibliothek enthalten und die beiden unteren Platten leer sind. Richten Sie das Deck mit 300 Millilitern Wasser im Behälter auf P3, einem 300-Milliliter-Ethanolbad auf P7, dem Tip Loader ALP und dem Multichannel Tip Wash ALP ein. Präsentieren Sie mit der Bediensoftware des Liquid-Handling-Roboters die Pipettenspitzen AP96 P20 aus dem Stacker 10 und bewegen Sie sie auf den Tip Loader ALP.

Präsentieren Sie Raum Zwei von Hotel A und trennen Sie alle vier 96-Well-V-Bodenplatten auf dem Deck, indem Sie die unteren beiden auf P4 und P8 und die oberen beiden auf P5 und P9 platzieren. Laden Sie die Pipettenspitzen AP96 P20 mit dem Tip Loader ALP auf den 96-Kanal-Kopf mit 200 Mikrolitern. 90 Mikroliter aus dem 300-Milliliter-Wasserreservoir ansaugen und in die 96-Well-Verdünnungsplatte mit V-Boden auf P4 abgeben. Wiederholen Sie den Schritt für die Platte auf P8. Mischen Sie die chemische Bibliotheksplatte auf P5, indem Sie 15 Mikroliter dreimal wiederholt ansaugen und abgeben. Zusätzlich aspirieren Sie 10 Mikroliter aus der chemischen Bibliotheksplatte auf P5 und geben Sie 10 Mikroliter in die Verdünnungsplatte auf P4. Mischen Sie die Lösungen der Platte auf P4, indem Sie insgesamt dreimal wiederholt 50 Mikroliter ansaugen und abgeben.

Reinigen Sie nach dem Mischen die AP96 P20 Pipettenspitzen, indem Sie 70 Mikroliter 70 % Ethanol aus P7 ansaugen und abgeben, und waschen Sie sie dann in der Multichannel Tip Wash ALP, indem Sie viermal ein Volumen von 110 % Wasser ansaugen und abgeben. Wiederholen Sie diese Schritte für das zweite Plattenpaar auf P8 und P9. Wenn Sie die zweite 96-Well-Verdünnungsplatte mit V-Boden erstellen, stapeln Sie die P9-, P5-, P8- und P4-Platten in dieser Reihenfolge von unten nach oben. Platzieren Sie dann den Stapel auf einer leeren statischen ALP.

Verwenden Sie entweder P1, P2, P6, P10, P11, P12 oder P13. Wiederholen Sie diese Schritte, bis Raum fünf in Hotel A leer ist, und starten Sie den Vorgang erneut, wenn Sie Raum sechs erreichen, indem Sie die neuen AP96 P20-Pipettenspitzen in den Tip Loader ALP verschieben und die gebrauchten AP96 P20-Pipettenspitzen auf eine leere statische ALP legen. Wiederholen Sie den Vorgang, bis Zimmer 9 des Hotels A leer ist.

Um zu Hotel B zu gelangen, müssen die Platten und Spitzen auf dem Deck wieder in Hotel A geladen werden.Obwohl der Roboter unbeaufsichtigt arbeiten kann, ist es notwendig, den Wasserbehälter nach jedem Verdünnungszyklus neu zu füllen. Wenn der Kreislauf mit unzureichendem Wasser neu gestartet wird, saugt der Roboter Luft an und die Chemikalien werden nicht verdünnt. Füllen Sie den 300-Milliliter-Wasserbehälter manuell nach.

Das Computerprogramm kann eine Pause einbauen, in der diese Meldung detailliert angezeigt wird, sodass der Benutzer auf Weiter klicken muss, bevor er den nächsten Schritt ausführt. Wiederholen Sie die Verdünnungsschritte für die verbleibenden drei Hotels. Geben Sie die Samen manuell in einer Dichte von 0,1 Gramm pro 100 Milliliter in das Medium.

Diese Dichte führt zu durchschnittlich 3-10 Samen pro Vertiefung einer 96-Well-Platte. Platzieren Sie manuell vier 96-Well-Platten mit flachem Boden in den Räumen Eins und Zwei des Hotels A.Platzieren Sie eine Schachtel mit AP96 P250-Pipettenspitzen auf dem Tip Loader ALP, ein 300-Milliliter-Reservoir mit der Medien-Saatgut-Mischung auf P3 und ein 300-Milliliter-Reservoir mit 70 % Ethanol auf P7. Präsentieren Sie mit der Bediensoftware die Räume Eins und Zwei im Hotel A und trennen Sie die Stapel von vier Tellern. Legen Sie jeweils eine Platte auf die leeren statischen ALPs und legen Sie dann die AP96 P250 Pipettenspitzen auf den 96-Kanal-Kopf mit 200 Mikrolitern.

Aspirieren Sie 90 Mikroliter aus dem 300-Milliliter-Reservoir für Mediensaatgut auf P3 und geben Sie es in die erste 96-Well-Platte mit flachem Boden ab. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle acht Platten die Medien-Saatgut-Mischung enthalten. Reinigen Sie die Pipettenspitzen des AP96 P250, indem Sie 70 Mikroliter aus dem 300-Milliliter-Reservoir ansaugen und abgeben, das mit 70 % Ethanol auf P7 gefüllt ist. Waschen Sie die Spitzen im Multichannel Tip Wash ALP, indem Sie viermal ein Volumen von 110 % Wasser ansaugen und abgeben, und entladen Sie die Spitzen dann bei TL1.

Zum Schluss die Teller mit der Hand zusammensammeln. Legen Sie manuell eine Schachtel mit AP96 P250-Pipettenspitzen in Raum eins des Hotels A.Legen Sie außerdem zwei 96-Well-Verdünnungsbibliotheksplatten mit V-Boden in die Räume zwei, vier, sechs und acht ein. Legen Sie zwei 96-Well-Siebplatten mit flachem Boden in die Räume drei, fünf, sieben und neun ein.

Konfigurieren Sie das Deck mithilfe der Betriebssoftware so, dass es ein Waschbehälter mit 300 Millilitern 70 % Ethanol bei P7 enthält. Das Saatgutreservoir kann auf dem Deck bei P3 belassen werden. Schalten Sie außerdem das Konsolenlaufwerk durch Verbindung des Gerätecontrollers ein, um Wasser durch den Multichannel Tip Wash ALP zirkulieren zu lassen. Dies wird am Ende des Protokolls automatisch ausgeschaltet. Präsentieren Sie die Pipettenspitzenbox AP96 P250 von Hotel A und schieben Sie sie in den Tip Loader ALP.

Präsentieren Sie als Nächstes die 96-Well-Bibliotheksplatten mit V-Boden-Verdünnung aus dem zweiten Raum von Hotel A auf dem Deck. Legen Sie eine Platte auf statisches ALP P4 und eine Platte auf P8. Präsentieren Sie dann die 96-Well-Siebplatten mit flachem Boden aus dem dritten Raum von Hotel A auf dem Deck. Legen Sie eine Platte auf statisches ALP P5 und eine auf P9. Laden Sie die Pipettenspitzen AP96 P250 mit dem Tip Loader ALP auf den 96-Kanal-Kopf mit 200 Mikrolitern.

Mischen Sie die 96-Well-Verdünnungsplatte mit V-Boden auf P4, indem Sie dreimal 50 Mikroliter ansaugen und abgeben. Anschließend werden 10 Mikroliter aus dieser Platte aspiriert und in die 96-Well-Siebplatte mit flachem Boden auf P5 dosiert. Mischen Sie die Lösungen in der Platte bei P5, indem Sie dreimal 50 Mikroliter aspirieren und abgeben. Reinigen Sie die Pipettenspitzen AP96 P250 mit Ethanol, indem Sie 70 Mikroliter 70 % Ethanol aus dem Reservoir bei P7 ansaugen und abgeben. Waschen Sie dann die Spitzen im Multichannel Tip Wash ALP, indem Sie viermal ein Volumen von 110 % Wasser ansaugen und abgeben.

Wiederholen Sie diese Schritte für die zweite 96-Well-Verdünnungsbibliotheksplatte mit V-Boden und die 96-Well-Siebplatte mit flachem Boden. Stapeln Sie die beiden 96-Well-Verdünnungsbibliotheksplatten mit V-Boden und die beiden 96-Well-Siebplatten mit flachem Boden zusammen. Verschieben Sie die Platten zu den statischen ALPs.

Wiederholen Sie dann den Vorgang dreimal und geben Sie insgesamt achtmal verdünnte Chemikalien auf die Siebplatten. Überprüfen Sie abschließend die Anzahl der Samen in jeder Vertiefung der Siebplatten durch visuelle Bestätigung. Ergänzen Sie die Vertiefungen mit weniger als drei Samen durch Zugabe von sterilisiertem und vernalisiertem Saatgut.

Es ist wichtig sicherzustellen, dass das Medium, in dem die Sämlinge wachsen, nicht austrocknet, da dies zu einer schlechten Keimung führt. Platten mit Setzlingen sollten bei hoher Luftfeuchtigkeit oder in austrocknungsbeständigen Behältern gelagert werden. Inkubieren Sie die 96-Well-Siebplatten mit flachem Boden vier Tage lang in einer Klimakammer bei 22 Grad Celsius in einem 16/8-Hell-Dunkel-Zyklus in einem trocknungssicheren Behälter.

Visualisieren Sie die 96-Well-Screening-Platten mit flachem Boden unter einem Präpariermikroskop und zeichnen Sie alle abweichenden Phänotypen für weitere Untersuchungen auf. Beispiele für normale und abweichende Phänotypen sind keine sichtbaren morphologischen Anomalien, braune Wurzelhaare, verkümmerte Wurzeln, stark verkümmerte Wurzeln, gebleichte, grüne Schleimstoffe, unvollständige Keimung und keine Keimung. Sichtbare Phänotypen nach Prozent werden in einem Tortendiagramm angezeigt.

Die Sämlinge wiesen Anomalien in der Wurzelmorphologie, der Pigmentierung, den Wurzelhaaren und der Keimung auf. Ebenfalls enthalten ist eine Vielzahl anderer, zu denen auch die Produktion von grünem Schleim gehört. Einmal gemeistert, kann diese Technik die Effizienz und Genauigkeit großer chemisch-genetischer Vorwärts-Screenings erheblich steigern.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, das Saatgut zu sterilisieren und zu vernalisieren, den Wasserbehälter während der Verdünnungsschritte wieder aufzufüllen, sicherzustellen, dass die Proben in austrocknungsbeständigen Behältern gelagert werden und dass die gesamte Bildgebung in Platten mit flachem Boden erfolgt. Abhängig von dem physiologischen Prozess, den Sie untersuchen möchten, kann dieses erste Screening mit zusätzlichen Assays ergänzt werden, um die Wirkungsweise jeder Chemikalie zu bestimmen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einen Liquid-Handling-Roboter einsetzen können, um die Effizienz und Genauigkeit eines chemischen genetischen Screenings zu verbessern.