Name: Optimierung der Nutzung eines Liquid Handling Roboters, einen hohen Durchsatz nach vorn Chemische Genetik Bildschirm von Arabidopsis Thaliana durchzuführen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mit einem Liquid-Handling-Roboter einen Hochdurchsatz-Screening für chemische Genetik bei Arabidopsis thaliana durchführen. Diese Methode ermöglicht die effiziente Entdeckung neuer kleiner Moleküle.

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Wir danken Jozsef Storch, Mitchel Richmond, Jarrad Gollihue und Andrea Sanchez für konstruktive und kritische Diskussion. Dr. Sharyn Perry für die phänotypische Fotografien. Dieses Material basiert auf Arbeit von der National Science Foundation unter Genossenschaft Vereinbarung Nr. 1355438 unterstützt.

1. Erstellen einer Verdünnung-Bibliothek
<ol><li>Beschriften Sie 625 Verdünnung Bibliothek Platten von hand um sicherzustellen, dass sie auf die entsprechende Platte aus der chemischen Bibliothek übereinstimmen. Darüber hinaus verbinden im Fluss und Schläuchen, die Multichannel-Tipp Wash automatisiert Labware Positionierer (ALP) indem sie durch das Laufwerk der Konsole an den 5-Gallonen-Behälter (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Auf zugreifen Sie den Computer und die Waschpumpe durch die Verbindung von der Gerätesteuerung bis zur Multichannel-Tipp Wash ALP schalten Sie ein, damit Wasser zirkulieren. Dies schaltet automatisch am Ende des Protokolls.</li>
	<li>Last, befestigt mit der Hand, den Stapler 10 zum Stapler-Karussell in der folgenden Reihenfolge in Hotels A - D (Abbildung 4, Stapler); eine Schachtel AP96 P20 Pipettenspitzen in Saal 1, vier 96-Well-V-Bodenplatten in Zimmer 2-5 mit den beiden oberen Platten, Lager Konzentrationen aus der bestellten Bibliothek und die beiden unteren Platten leer (Abbildung 5, Stapler). Darüber hinaus laden eine Schachtel AP96 P20 Pipettenspitzen in Raum 6 und vier 96-Well-V-Bodenplatten in Zimmer 7-9 mit den beiden oberen Platten, Lager Konzentrationen der bestellten Bibliothek und die beiden unteren Platten leer (Abbildung 5, Stapler).</li>
	<li>Eingestellt von hand, bis das Deck mit einer 300 mL Wasser-Reservoir auf P3, 300 mL 70 % EtOH Badewanne auf P7, Tipp Loader ALP (TL1) und Mehrkanal-Tipp Wash ALP (TW1) (Abbildung 4und Abbildung 5, Deck Deck).</li>
	<li>Mit der Betriebssoftware, präsentieren Sie AP96 P20 Pipettenspitzen aus den Stapler 10 und verschieben Sie sie in die Tipp-Loader-ALP. Hinweis: 1,5 bis 1.12 alle sind mit der Flüssigkeit, die Handhabung des Roboters Betriebssoftware durchgeführt; siehe Tabelle der Materialien.</li>
	<li>2 Zimmer von Hotel A zu präsentieren und trennen Sie alle vier 96-Well-V-Boden Platten auf dem Deck, Platzierung der Unterseite zwei auf P4 und P8 und die beiden oberen auf P5 und P9 (Abbildung 4).</li>
	<li>Laden Sie AP96 P20 Pipettenspitzen mit dem Loader Tipp ALP auf den 96-Kanal 200 µL Kopf. Aspirieren 90 µL aus 300 mL Wasser-Reservoir und verzichten in der 96-Well-V-Verdünnung Bodenplatte auf P4. Wiederholen Sie diesen Schritt für die Platte auf P8.</li>
	<li>Mischen Sie die chemische Bibliothek Platte auf P5 wiederholt Absaugen und 15 µL dreimal. Darüber hinaus Aspirieren Sie 10 µL aus der chemischen Bibliothek Platte auf P5 und verzichten Sie 10 µL in die Verdünnung Platte auf P4 zu.</li>
	<li>Mischen Sie den Lösungen der Platte auf P4 wiederholt Absaugen und 50 µL insgesamt drei Mal. Einmal gemischt, saubere Zeiten der AP96 P20 Pipettenspitzen durch Absaugen und Verzicht auf 70 µL 70 % EtOH von P7, dann waschen in der Multichannel-Tipp Wash ALP durch Absaugen und Verzicht auf eine Volumen von 110 % des Wassers vier.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 1,8-1,9 für das zweite paar Platten auf P8 und P9. Beim Erstellen der zweiten 96-Well-V-Verdünnung Bodenplatte, Stapel die Platten in der folgenden Reihenfolge von unten nach oben: P4, P9, P5 und P8. Legen Sie den Stapel auf einem leeren statischen ALP; P1, P2, P6, P10, P11, P12 oder P13.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.6-1.10 bis 5 Zimmer im Hotel A leer ist. Wiederholen Sie Schritt 1.5 auf Raum 6 erreichen, Umzug neue AP96 P20 Pipettenspitzen in der Tipp-Loader-ALP und Platzierung der verwendeten AP96 P20 Pipettenspitzen auf einer leeren statischen Alm.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.6-1.10 bis Zimmer 9 Hotels A leer ist. Jedoch müssen um zur Hotel B zu gelangen, die Platten und Tipps auf dem Deck in Hotel A. zurückgeladen werden</li>
	<li>Nachfüllen Sie, Handarbeit, 300 mL Wasser-Reservoir. Dieser Schritt ist entscheidend, und das Computerprogramm übernehmen eine Pause über diese Nachricht, dass der Benutzer drücken Sie "weiter", vor dem nächsten Schritt fort.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 1,5-1.13 für die restlichen Hotels, gewährleistet eine volle 300 mL Wasser-Reservoir jedes Mal vor dem Fortfahren zum nächsten Hotel.</li>
</ol>2. Hinzufügen von Medien-Saatgut-Mischung zu Platten Screening
<ol><li>½ Murashige und Skoog (MS) Medien machen mit 0,1 % Agar durch Zugabe von 4,3 g MS Salts, 0,50 g MES, 1,0 g Agar, 1 L DI H2O. einstellen den pH-Wert 5,7 aber die Zugabe von 5 M Kaliumhydroxid während der Überwachung mit einer pH-Elektrode.</li>
	<li>Sterilisieren Sie Samen durch Schütteln sie in 1 % Bleichmittel und SDS zwischen 15 und 30 min., und spülen Sie dann 4 mal mit einem gleichen Volumen Wasser durch Zentrifugation. Sobald die Samen steril sind, legen Sie sie bei 4 ° C bis zu 24 Stunden, 7 Tage für Vernilization. Das Arabidopsis Biological Resource Center beschreibt zusätzliche Methoden der Sterilisation, Vernilization und Wachstum22.</li>
	<li>Fügen Sie Samen auf Medien von hand bei einer Dichte von 0,1 g/100 mL. Diese Dichte führt zu einem Durchschnitt von 3-10 Samen pro Bohrloch einer 96-Well-Platte.</li>
	<li>Ort, von Hand, vier 96-Well-Wohnung-Bodenplatten in Zimmer 1 und 2 des Hotel A (Abbildung 6, Hotel A). Legen Sie eine Schachtel mit AP96 P250 Pipettenspitzen auf der Tipp-Loader-ALP, 300 mL Reservoir gefüllt mit der Medien-Saatgut-Mischung in Schritten erstellte 2,1-2,3 auf P3 und 300 mL Reservoir gefüllt mit 70 % EtOH auf P7 (Abbildung 4, Deck und Abbildung 6 Deck). Hinweis: 2,5 bis 2,8 erfolgen mit der Betriebssoftware.</li>
	<li>Präsentieren Sie Zimmer 1 und 2 im Hotel A zu, und trennen Sie die Stapel von vier Platten. Setzen Sie eine Platte auf jede der leeren statischen Alpen (P4, P5, P6, P8, P9, P10, P11 und P12). Laden Sie AP96 P250 Pipettenspitzen auf 96-Kanal 200 µL Kopf.</li>
	<li>Aspirieren 90 µL aus 300 mL Medien-Samen Reservoir auf P3 und verzichten in den ersten 96-Well-Wohnung-Bodenplatte. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle acht Platten der Medien-Saatgut-Mischung enthalten.</li>
	<li>Reinigen der AP96 P250 Pipettenspitzen durch Absaugen und Verzicht auf 70 µL aus dem 300 mL Behälter gefüllt mit 70 % EtOH auf P7. Waschen Sie die Tipps in Multichannel Tipp waschen ALP durch Absaugen und Verzicht auf eine 110 % Volumen Wasser viermal, entladen Sie die Tipps bei TL1 und sammeln Sie die Platten mit der hand.</li>
</ol>3. Hinzufügen von kleinen Molekülen zu Platten Screening
<ol><li>Last, von Hand, eine Schachtel mit AP96 P250 Pipettenspitzen in Zimmer 1 des Hotel A, zwei 96-Well-V-Verdünnung Bibliothek Bodenplatten in Zimmer 2, 4, 6 und 8 und zwei 96 gut flach-Screening Bodenplatten in Zimmer 3, 5, 7 und 9 (Abbildung 4 Stapler und Abbildung 7, Hotel A). Verbinden Sie Schläuche darüber hinaus zum und vom Multichannel Tipp Wash ALP auf den 5-Gallonen-Tank. Hinweis: 3.2 bis 3.10 erfolgen mit der Betriebssoftware.</li>
	<li>Konfigurieren Sie das Deck um 300 mL 70 % EtOH Wash Reservoir an P7 enthalten; Das Medien-Samen Reservoir kann auf dem Deck auf P3 gelassen werden (Abbildung 4, Deck und Abbildung 7, Deck). Darüber hinaus schalten Sie die Konsole Fahrt durch Verbindung von der Gerätesteuerung Wasser durch Multichannel Tipp Wash ALP zirkulieren. Dies schaltet automatisch am Ende des Protokolls.</li>
	<li>Präsentieren Sie die AP96 P250 Pipette Tip Box von Hotel A und verschieben Sie es an der Spitze Loader ALP.</li>
	<li>Präsentieren die 96-Well-V-Verdünnung Bibliothek Bodenplatten aus Zimmer 2 Hotels A Deck und Platz eins auf statische ALP P4 und auf P8. Die 96-Well-Wohnung zu präsentieren-Screening Bodenplatten aus Zimmer 3 Hotel a auf das Deck und legen Sie eine statische ALP P5 und eine auf P9.</li>
	<li>Laden Sie AP96 P250 Pipettenspitzen mit dem Loader Tipp ALP auf den 96-Kanal 200 µL Kopf.</li>
	<li>Mischen die 96-Well-V-Verdünnung Bodenplatte auf P4 durch Absaugen und Verzicht auf 50 µL dreimal. Im Anschluss daran Aspirieren 10 µL von dieser Platte und verzichten in der 96-Well-Wohnung-Screening Bodenplatte auf P5.</li>
	<li>Mischen Sie die Lösungen in die Platte bei P5 Absaugen und 50 µL dreimal. Reinigen der AP96 P250 Pipettenspitzen mit Ethanol durch Absaugen und Verzicht auf 70 µL 70 % EtOH aus dem Reservoir auf P7 und dann waschen Sie die Tipps in Multichannel Tipp Wash ALP durch Absaugen und Verzicht auf ein Volumen von 110 % des Wasser viermal.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.5 und 3.6 für die zweite 96-Well-V-Verdünnung Bibliothek Bodenplatte (P8) und 96-Well-flach-Screening Bodenplatte (P9).</li>
	<li>Stapel die beiden 96-Well V-Verdünnung Bibliothek Bodenplatten zusammen und die beiden 96-Well flache Unterseite Screening Platten zusammen. Verschieben Sie die Platten an statischen Alpen P1, P2, P6, P10, P11, P12 oder P13.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 3,4-3,9 dreimal, insgesamt acht Mal Platten Screening verdünnte Chemikalien hinzufügen. Zu guter Letzt überprüfen Sie die Anzahl der Samen in jede Vertiefung der Screening-Platten durch visuelle Konformation und ergänzen Sie diesen Brunnen mit weniger als drei Samen durch zusätzliche sterilisiert und vernalized Samen.</li>
</ol>(4) Inkubation und Visualisierung von Screening-Platten
<ol><li>Inkubieren Sie 96-Well flach-Boden Screening-Platten für vier Tage in einer Klimakammer bei 22 ° C auf einem 16/8 Hell-Dunkel-Zyklus in ein Behältnis Austrocknung. 96-Well flach-Boden Screening-Platten unter dem sezierenden Mikroskop zu visualisieren. Notieren Sie alle abweichende Phänotypen zur weiteren Untersuchung.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Dieses Protokoll soll Forscher helfen bei der Bewältigung einer vorwärts Chemische Genetik-Bildschirms auf Arabidopsis. Wir bieten repräsentative Ergebnisse von einem Bildschirm von 50.000 Verbindungen (Abbildung 2 und Abbildung 3), einer der größten vorwärts Chemische Genetik Bildschirme auf Arabidopsis9,13,23bisher durchgeführt. Die Verwendung von einem liquid Handlin...

In den vergangenen 20 Jahren haben Forscher auf dem Gebiet der Pflanzenbiologie große Fortschritte mit Hilfe chemischer Genetik Ansätze, sowohl vorwärts als auch rückwärts, gemacht, ein besseres Verständnis der Zellwand Biosynthese, Zellskelett, Hormon-Biosynthese und Signalisierung, Gravitropismus, Pathogenese, Purin-Biosynthese und Endomembrane Handel mit1,2,3,4,5. Einsatz nach vorne Chemische Genetik Techniken ermöglicht die Identifizierung von Phänotypen von Interesse und erlaubt es den Forschern, die genotypischen Grundlagen für bestimmte Prozesse zu verstehen. Im Gegensatz dazu sucht reverse Chemische Genetik Chemikalien, die mit einer vorher festgelegten Protein Ziel6interagieren. Arabidopsis hat an der Spitze dieser Entdeckungen in Pflanzenbiologie, weil sein Genom klein abgebildet und kommentiert. Es hat eine kurze Generationszeit, und es gibt mehrere Mutant/Reporter Zeilen zur Verfügung, um die Identifizierung von aberranten subzelluläre Maschinen7zu erleichtern.
Es gibt zwei große Engpässe, die verlangsamen den Fortschritt der vorwärts chemische genetische Bildschirme, die ersten screening-Prozess und bestimmen das Ziel der Verbindung von Interesse8. Eine große Hilfe bei der Erhöhung der Geschwindigkeit des kleinen Molekül-Auswahl ist die Verwendung von Automatisierung und automatisierte Anlagen9. Liquid Handling-Roboter sind ein hervorragendes Instrument für den Umgang mit großen Bibliotheken von kleinen Molekülen und maßgeblich voran in den biologischen Wissenschaften10gewesen. Die hier vorgestellten Protokoll wurde entwickelt, um den Engpass zugeordneten Screening-Verfahren ermöglicht die Identifizierung von bioaktiven kleine Moleküle mit einer schnellen Rate. zu lindern Diese Technik verringert die Last der Arbeit und Zeit im Auftrag des Betreibers und auch gleichzeitig die wirtschaftliche Kosten für die Prinzip-Ermittler.
Bisher haben die meisten chemische Bibliotheken analysiert zwischen 10.000 und 20.000 Verbindungen, einige mit mehr als 150.000 andere mit nur 709,11,12,13,14, statt. 15 , 16. das Protokoll hier eingeführt wurde auf einer kleinen Molekül-Bibliothek von 50.000 Verbindungen (siehe Tabelle der Materialien) umgesetzt, die größeren vorwärts Chemische Genetik Bildschirme durchgeführt auf Arabidopsis bis heute. Dieses Protokoll passt mit dem aktuellen Trend zu mehr Effizienz und Geschwindigkeit betreffend vorwärts Chemische Genetik, zumal es bezieht sich auf Fungizid, Herbizid Entdeckung, Insektizid Entdeckung entdecken, drug Discovery und Krebsbiologie17 ,18,19,20,21. Obwohl hier mit Arabidopsis implementiert, könnte dieses Protokoll leicht angepasst werden Zellkulturen, Sporen und möglicherweise sogar Insekten im flüssigen Medium innerhalb 96, 384 oder 1536-Well Platten. Aufgrund seiner geringen Größe ist Arabidopsis zugänglicher Screening in 96-well-Platten. Verteilung von Saatgut gleichmäßig auf alle Brunnen ist jedoch eine Herausforderung. Aussaat von Hand genau, aber arbeitsintensiv ist, und zwar gibt es Geräte, die Samen in 96-Well Platten zu verzichten, sie sind teuer in der Anschaffung. Hier zeigen wir, wie dieser Schritt mit nur einem kleinen Verlust an Genauigkeit umgangen werden kann.
Das übergeordnete Ziel dieser Methode war eine große chemische Bibliothek gegen Arabidopsis mehr überschaubar, ohne Kompromisse bei der Genauigkeit, über die Verwendung von einem liquid Handling-Roboter screening zu machen. Die Verwendung dieser Methode verbessert die Effizienz des Forschers durch verringern den Zeitaufwand für die anfängliche Verdünnung Serie Management und nachfolgenden phänotypischen Bildschirmen ermöglicht schnelle Visualisierung der Proben unter dem sezierenden Mikroskop und schnelle Runden Identifizierung neuer bioaktiver kleiner Moleküle. Abbildung 1 zeigt die wichtigsten Ergebnisse dieses Protokolls in 4 Schritten.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57393/57393fig1.jpg"> Abbildung 1: allgemeine Workflow des Bildschirms nach vorne Chemische Genetik. Einen Überblick über das Protokoll für jedes der 4 wichtigsten Schritte mit einigen Details beschrieben werden. 1: Erhalt der chemischen Bibliothek, 2: die Verdünnung Bibliothek, 3: macht die Screening-Platten und 4: Inkubation und Visualisierung der Screening-Platten. <a href="/files/ftp_upload/57393/57393fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

<table><tbody><tr><td>Tastatur</td><td>Lokaler Provider</td><td>N/A</td><td>Wird für das Protokolldesign und den Betrieb des Biomek FX</td></tr><tr><td></td><td>Mouse Lokaler Provider</td><td>N/A</td><td>Wird für das Protokolldesign und den Betrieb des Biomek</td></tr><tr><td>FX Computer Screen</td><td>Lokaler Provider</td><td>N/A</td><td>Wird für das Protokolldesign und den Betrieb des Biomek FX</td></tr><tr><td>Computer Local</td><td>Provider</td><td>N/A</td><td>Wird für das Protokolldesign und den Betrieb verwendet the Biomek FX</td></tr><tr><td>DIVERSet Screening Library</td><td>ChemBridge</td><td>N/A</td><td>Chemische Bibliothek</td></tr><tr><td>Biomek Software</td><td>Beckman Coulter</td><td>N/A</td><td>Betreibt und entwirft den Biomek FX</td></tr><tr><td>Device Controller</td><td>Beckman Coulter</td><td>719366</td><td>Bedient die Wasserpumpe/Spitzenwaschstation</td></tr><tr><td>Stacker Carousel Pendent</td><td>Beckman Coulter</td><td>148240</td><td>Manuelle Bedienung von Biomek Stapler Karussell</td></tr><tr><td>Biomek Stapler Karussell</td><td>Beckman Schar</td><td>148520</td><td>Dreheinheit, in der alle FX Stacker 10 FX Stacker</td></tr><tr><td>10</td><td>Beckman Coulter</td><td>148522</td><td>Elevator untergebracht sind, in der Komponenten für das Sieb untergebracht</td></tr><tr><td>sind FX Stacker 10</td><td>Beckman Coulter</td><td>148522</td><td>Elevator Einheit, in der Komponenten für das Sieb</td></tr><tr><td>untergebracht sind FX Stacker 10</td><td>Beckman Coulter</td><td>148522</td><td>Aufzugseinheit, in der Komponenten für das Sieb</td></tr><tr><td>FX Stacker 10</td> untergebracht sind, <td>Beckman Coulter</td><td></td><td>148522 Aufzugseinheit, in der Komponenten für das Sieb</td></tr><tr><td>aufbewahrt werden Biomek FX</td><td>Beckman Coulter</td><td>https://www.beckman.com/liquid-handlers</td><td>Roboter, der die gewünschten Vorgänge ausführt</td></tr><tr><td>Accuframe</td><td>Artisan Technology Group</td><td>76853-4</td><td>Rahmenarm zum richtigen Platzieren von Komponenten</td></tr><tr><td>Rahmenvorrichtung</td><td>Beckman Coulter</td><td>719415</td><td>Zentrierter Arm in der Accuframe</td></tr><tr><td>Mehrkanal-Düsenwäsche ALP</td><td>Beckman Coulter</td><td>719662</td><td>Wäscht die Spitzen nach dem Ethanolbad</td></tr><tr><td>Spitzenlader ALP</td><td>Beckman Coulter</td><td>719356</td><td>Lädt Spitzen pneumatisch auf den Arm</td></tr><tr><td>Luftkompressor</td><td>Lokaler Anbieter</td><td>N/A</td><td>Liefert Luft für die pneumatische Spitzenbeladung</td></tr><tr><td>MasterFlex Console Drive</td><td>Cole-Parmer</td><td>77200-65</td><td>Pumpe zur Zirkulation von Wasser durch den Mehrkanal-Düsenwascher</td></tr><tr><td>Luftschlauch</td><td>Lokaler Anbieter</td><td>N/A</td><td>Liefert Luft vom Luftkompressor zum Tip Loader</td></tr><tr><td>Wasserschlauch</td><td>Lokaler Anbieter</td><td>N/A</td><td>Liefert Wasser aus der 5-Gallonen-Reserve zum Tip Washer</td></tr><tr>Statisches <td>Beckman-Schar</td><td>von ALP</td><td>wird mit Biomek FX</td><td>Supports Equipment für das Sieb</td> geliefert</tr><tr><td>5 Gallonen Reserviour</td><td>Lokaler Anbieter</td><td>N/A</td><td>Zirkuliert das Schmutzwasser aus der Reinigung der Spitzen</td></tr><tr><td>Greifer</td><td>Beckman Coulter</td><td>Kommt mit Biomek FX</td><td>Greifern und bewegt das Gerät an die richtigen Stellen</td></tr><tr><td>96-Kanal 200 & Mikro; L Kopf</td><td>Beckman Coulter</td><td>Wird mit Biomek FX geliefert</td><td>Hält die 96 Spitzen, die im Sieb verwendet werden</td></tr><tr><td>AP96 P200 Pipettenspitzen Beckman</td><td>Coschar</td><td>717251</td><td>Wird zur Herstellung der Siebbibliothek verwendet</td></tr><tr><td>96 Well Flache Bodenplatte</td><td>Costar</td><td>9018</td><td>Hilft bei der Sichtbarkeit des Siebs</td></tr><tr><td>96 Well V-Bodenplatte</td><td>Costar</td><td>3897</td><td>Hilft bei der Lagerung der Verdünnungsbibliothek</td></tr><tr><td>AlumaSeal 96 Versiegelungsfolie</td><td>MedSci</td><td>F-96-100</td><td>Versiegelt für die Lagerung sowohl der chemischen Bibliothek als auch der Verdünnungsbibliothek</td></tr><tr><td>Kunststoff-Ziplock-Sandwichbeutel</td><td>Lokaler Anbieter</td><td>N / A</td><td>Wird verwendet, um eine feuchte Umgebung für das Sieb</td></tr><tr><td>zu gewährleisten AP96 P20 Pipettenspitzen Beckman Coulter</td><td></td><td>717254</td><td>Wird in der Erstellung der Verdünnungsbibliothek</td></tr><tr><td>verwendet Wachstumskammer</td><td>Percival</td><td>AR36L3</td><td>Keimt Samen für phänotypische Visulisierung</td></tr><tr><td>Spatel</td><td>Lokaler Anbieter</td><td>N/A</td><td>Hält Saatgut für die Zugabe in Brunnen, in denen die flüssige Aussaat fehlgeschlagen ist</td></tr><tr><td>Gesundes ausreichend Zahnstocher</td><td>Lokaler Anbieter</td><td>N/A</td><td>Schiebt Saatgut aus dem Spatel in die Vertiefungen</td></tr><tr><td>Murashige und Skoog Basalsalzmischung</td><td>PhytoTechnology Laboratories</td><td>M524</td><td>Zu MS-Medienmischung hinzufügen</td></tr><tr><td>MES-freies Säuremonohydrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN19483580</td><td>Zu MS-Medien hinzugefügt, um den pH-Wert zu senken</td></tr><tr><td>Agar-Agar-Pulver</td><td>Alfa Aesar</td><td>9002-18-0</td><td>Erhöht die Dicke des Mediums zur Unterstützung der Samensuspension</td></tr><tr><td>5M KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484016</td><td>Erhöht den pH-Wert auf ein angemessenes Niveau</td></tr><tr><td>1L Medienaufbewahrungsflasche</td><td>Corning</td><td>1395-1L</td><td>Fasst genügend Medien für ein Sieb</td></tr><tr><td>Polypropylen-Zentrifugenröhrchen</td><td>Corning</td><td>431470</td><td>Sterilisiert Saatgut vor der Vernilisierung</td></tr><tr><td>pH-Sonde</td><td>Davis Instruments</td><td>YX-58825-26</td><td>Wird zur Herstellung von</td></tr><tr><td>Medien verwendet ALPs (Automated Labware Positioners) Benutzerhandbuch</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN 987836</td><td>Hilft bei der Einrichtung der Begleitausrüstung für das Biomek FX</td></tr><tr><td>Biomek 2000 Staplerkarussell Benutzerhandbuch</td><td>Beckman Coulter</td><td>609862-AA</td><td>Hilft bei der Einrichtung des Staplerkarussells</td></tr><tr><td>Biomek FX und FXP Laborautomatisierungs-Workstations Benutzerhandbuch</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN 987834</td><td>Wird verwendet, um den Multichannel Pod</td></tr><tr><td>zu rahmen Biomek FXP Laborautomatisierungs-Workstation Kunden-Startanleitung</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN B32335AB</td><td>Wird verwendet, um bei der Einrichtung des Biomek FX</td></tr><tr><td>Biomek Software Benutzerhandbuch zu</td> helfen <td>Beckman Coulter</td><td>PN 987835</td><td>Wird verwendet, um die einzurichten und zu verstehen Software</td></tr></tbody></table>

optimierung der nutzung eines liquid handling roboters, einen hohen durchsatz nach vorn chemische genetik bildschirm von arabidopsis thaliana durchzuführen

Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana

Chemischer Genetik wird zunehmend Züge in Pflanzen zu entschlüsseln, die widerspenstigen zu traditionellen Genetik durch gen-Redundanz oder Letalität möglicherweise eingesetzt. Allerdings ist die Wahrscheinlichkeit eines synthetischen kleinen Moleküls als bioaktive gering; Daher müssen Tausende von Molekülen getestet werden, um diejenigen von Interesse finden. Liquid handling Roboter Systeme sind entworfen, um große Anzahl von Proben, die Erhöhung der Geschwindigkeit, mit der eine chemische Bibliothek untersucht werden kann, zusätzlich minimieren/Standardisierung Fehler, zu behandeln. Erreichung einen Hochdurchsatz-vorwärts Chemische Genetik-Bildschirm aus einer Bibliothek von 50.000 kleine Moleküle auf Arabidopsis Thaliana (Arabidopsis), Protokolle mit einer Benchtop-Mehrkanal-Flüssigkeit handling-Roboter entwickelt, die minimale erfordern Techniker-Beteiligung. Mit diesen Protokollen wurden 3.271 kleine Moleküle entdeckt, dass sichtbare phänotypische Veränderungen verursacht. 1.563 Verbindungen induziert kurze Wurzeln, 1.148 Verbindungen verändert Färbung, 383 Verbindungen verursacht Wurzelhaare und andere, nicht kategorisiert, Änderungen und 177 Verbindungen gehemmt Keimung.

Die Fähigkeit, genau und effizient charakterisieren Phänotypen basierend auf die Zugabe von kleinen Molekülen bei screening-Konzentrationen unter dem sezierenden Mikroskop ist das Endziel dieser Methode der vorwärts Chemische Genetik auf Arabidopsis. Die Phänotypen beobachtet, wenn alle 50.000 Verbindungen gezeigt hatte war vielfältig und kann in mehrere unterschiedliche Klassen (Abbildung 2) aufgeteilt werden. Abbildung 3A</stro...

Ein hoher Durchsatz-Bildschirm synthetische kleiner Moleküle wurde auf der Modell-Pflanzenart Arabidopsis Thalianadurchgeführt. Dieses Protokoll, entwickelt für eine liquid Handling-Roboter, erhöht die Geschwindigkeit des vorwärts Chemische Genetik Bildschirme, die Entdeckung der neuartigen kleine Moleküle, die Auswirkungen auf die Physiologie der Pflanzen zu beschleunigen.

Optimierung der Nutzung eines Liquid Handling Roboters, einen hohen Durchsatz nach vorn Chemische Genetik Bildschirm von Arabidopsis Thaliana durchzuführen

Chemical genetics is increasingly being employed to decode traits in plants that may be recalcitrant to traditional genetics due to gene redundancy or ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, ein chemisches Genetik-Screening mit hohem Durchsatz an Arabidopsis-Sämlingen durchzuführen. Mit dieser Methode können wir effizient und effektiv neue kleine Moleküle entdecken, die die Pflanzenphysiologie beeinflussen. Diese Entdeckungen werden die Grundlage für weitere Studien zu physiologischen Prozessen wie der Zellwandsynthese bilden.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Zehntausende von kleinen Molekülen in kurzer Zeit gescreent werden können. Obwohl dieses Protokoll für die Modellpflanzenart Arabidopsis konzipiert ist, kann es leicht an andere Organismen wie Insekten, Mikroorganismen oder Zellkulturen angepasst werden. Die Idee zu diesem Protokoll kam uns, als wir erfuhren, dass das Genomikzentrum der Universität ein Zuhause für einen überschüssigen Liquid-Handling-Roboter finden musste.Wir haben uns sofort freiwillig bereit erklärt, es ihnen abzunehmen. Bereiten Sie die Verdünnungsbibliothek und den Multichannel Tip Wash Automated Labware Positioner (ALP) vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Laden Sie den Stapler 10, der an das Staplerkarussell angeschlossen ist, manuell.Legen Sie in den Hotels A bis D zuerst

optimizing-use-liquid-handling-robot-to-conduct-high-throughput

Research

Forschung

JoVE Journal

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Biotechnik

Wir berichten über eine Methode für die Einführung, Überwachung und quantitative Analyse der GFP-Expression in Pflanzenzellen. Diese Methode verwendet einen speziell entworfenen Robotik-System für semi-kontinuierlichen Bildsammlung aus einer großen Anzahl von Proben, über die Zeit. Wir zeigen auch die Verwendung von ImageJ und ImageReady für die Analyse von Bildserien.

Robotik und Dynamic Image Analysis für Studies of Gene Expression in pflanzlichen Geweben

Ein Verfahren zur Flüssig-Kultivierung und die Abgabe...

High-Throughput-Screening und Biosensorik mit Fluorescent C. elegans Die Stämme

Ein Protokoll für die quantitative, Expressionsscreening mit hohem Durchsatz und analytischen Reinigung von Fusionsproteinen aus kleinen Escherichia coli-Kulturen beschrieben und auf die Expression von Disulfid-reichen Tiergift-Protein-Targets aufgebracht.

Hochdurchsatz-Screening Quantitative Expression und Aufreinigung rekombinanter zu Disulfid-reichen Proteine ​​Venom Produziert in Applied<em&gt; E. coli</em

Hier beschreiben wir einen zellbasierten Reportergen-Assay als wertvolles Werkzeug zum Screening chemischer Bibliotheken auf Verbindungen, die posttranskriptionelle Kontrollmechanismen modulieren, die durch 3' UTR ausgeübt werden.

Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

Ein hoher Durchsatz, automatisierte, Tabakprotoplasten Produktion und Transformation-Methodik beschrieben. Das Robotersystem ermöglicht massiv parallele Genexpression und Entdeckung im Modell BY-2-System, das auf nicht-Modellpflanzen übersetzbar sein sollte.

Ein Roboter-Plattform für Hochdurchsatz-Isolierung von Protoplasten und Transformation

Hier ist ein automatisierte Workflow auszuführenden modulare DNA "Gerät" Montage mit einem modularen DNA Montage Klonmethode auf Liquid-Handling-Roboter präsentiert. Das Protokoll verwendet eine intuitive Software-Werkzeug zur Erzeugung von liquid Handler Auswahllisten für kombinatorische DNA Bibliothek Gerätegeneration, die wir zeigen zwei liquid Handling-Plattformen verwenden.

Automatisierte Roboter Liquid Handling Versammlung Modular DNA-Geräte

Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll zur Herstellung von schnell Hunderte von Nematoden Wachstum Medien Agar, 96-Well-Kultur-Platten mit einer konsistenten Anzahl von Caenorhhabditis Elegans pro Bohrloch. Diese Kulturen sind nützlich für das phänotypische Screening von ganzen Organismen. Wir konzentrieren uns hier auf dieser Kulturen zu Bildschirm Chemikalien für pro-Langlebigkeit-Effekte verwenden.

Eine einfache Methode zur chemischen Hochdurchsatz-Screening in Caenorhabditis Elegans

Ein Hochdurchsatzprotokoll für die Oberflächensterilisation von Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) -Samen wird bereitgestellt, das die Liquid-Handling-Schritte mit einer einfachen Absaugvorrichtung, die mit einer Vakuumpumpe konstruiert ist, optimiert. Hunderte von Samenproben können an einem Tag oberflächensterilisiert werden.

Hochdurchsatz-, robuste und hochzeitflexible Methode zur Oberflächensterilisation von Arabidopsis-Samen

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur systematischen globalen Optimierung von genetisch kodierten Biosensoren durch automatisierungsgestützte Generierung und Bewertung genetischer Bibliotheken zur Verfügung. Dies wird mit Design-of-Experiment-Methoden gekoppelt, um Experimente zu rationalisieren und die Auswahl genetischer Komponenten zu ermöglichen, um Biosensoren auf bestimmte Designergebnisse abzustimmen.

Effiziente Probenahme von genetisch kodierten Biosensoren Design Space mit einem Design of Experiment- und Automatisierungs-Workflow

Dieses Protokoll bietet einen standardisierten Hochdurchsatz-Screening-Workflow für industrielle Mikroorganismen. Dabei wird eine mutierte Bibliothek mittels ARTP-Mutagenese erstellt, ein positives Tröpfchenscreening mit automatisierter Mikrofluidik durchgeführt und anschließend die Ergebnisse überprüft. Die Zuverlässigkeit des Workflows wurde durch das Screening von Hochleistungs-B . coagulans-Stämmen bestätigt.

Hochdurchsatz-Screening von L-Milchsäure-hyperproduzierenden Bacillus-Coagulans-Mutanten mittels einer automatisierten tropfen-mikrofluidischen Plattform

Erfahren Sie, wie Sie mit einem Liquid-Handling-Roboter einen Hochdurchsatz-Screening für chemische Genetik bei Arabidopsis thaliana durchführen. Diese Methode ermöglicht die effiziente Entdeckung neuer kleiner Moleküle.

Optimierung der Nutzung eines Liquid Handling Roboters, einen hohen Durchsatz nach vorn Chemische Genetik Bildschirm von Arabidopsis Thaliana durchzuführen (Video) | JoVE Journal

Optimierung der Nutzung eines Liquid Handling Roboters, einen hohen Durchsatz nach vorn Chemische Genetik Bildschirm von Arabidopsis Thaliana durchzuführen

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