Effiziente Probenahme von genetisch kodierten Biosensoren Design Space mit einem Design of Experiment- und Automatisierungs-Workflow

Die Entwicklung und Optimierung von Biosensoren für biotechnologische Anwendungen ist der Schwerpunkt unserer Forschung. Insbesondere wollen wir verstehen, wie Biosensoren durch Modulation ihrer genetischen Elemente optimiert und entwickelt werden können. Intuitionsgesteuerte Designentscheidungen, wie z. B. klassisches Promotor-Engineering und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung, sind Techniken, die routinemäßig bei der Charakterisierung und dem Design von Biosensoren angewendet werden.

Die Methoden der Versuchsplanung sind bei der Gestaltung genetischer Schaltkreise noch nicht weit verbreitet. Mit diesem Protokoll wollen wir die Akzeptanz dieser Art von Techniken im Design genetischer Schaltkreise und Biosensoren erhöhen. Bestimmen Sie zunächst die theoretische Bibliotheksgröße und berechnen Sie die Anzahl der einzelnen Varianten, die erforderlich sind, um eine Bibliotheksabdeckung von mehr als 95 % zu gewährleisten.

Berechnen Sie das erforderliche Volumen des mit Antibiotika ergänzten Lysogenese-Bouillons entsprechend der Anzahl der zu untersuchenden Kolonien. Öffnen Sie die Liquid Handler-Software und klicken Sie neben dem MTP-Liquidtransfer-Programm auf Ausführen. Legen Sie das vorbereitete Medium in die entsprechende Behälterposition.

Füllen Sie dann das Deck entsprechend dem Layout mit leeren Mikrotiterplatten. Stellen Sie das Programm so ein, dass 200 Mikroliter Medien ausgegeben werden. Klicken Sie auf OK, um den Programmstart zu bestätigen.

Übertragen Sie nun gefüllte Mikrotiterplatten-Wells auf eine Kolonie-Picker-Plattform und entsiegeln und übertragen Sie quadratische Schneckenplatten von Pseudomonas putida, die mit DNA aus der Plasmidvariantenbibliothek transformiert wurden, in die Kolonie-Picker-Plattform. Verwenden Sie den Koloniepicker, um jede vorgefüllte Vertiefung mit einer einzigen Kolonie aus den Transformantenplatten zu beimpfen. Verschließen Sie die geimpften Platten wieder und überführen Sie sie in einen Offline-Schüttelinkubator.

Bringen Sie die gewachsenen Platten nach der Inkubation wieder auf die Liquid-Handler-Plattform zurück und entsiegeln Sie sie. Klicken Sie neben dem Protokoll "Glycerin zum MTP hinzufügen" auf "Ausführen". Stellen Sie sicher, dass das Plattenlayout auf dem Bildschirm mit dem des Liquid Handler-Docks übereinstimmt.

Klicken Sie nacheinander auf OK, damit das Protokoll ausgeführt wird. Wenn Sie fertig sind, verschließen Sie die Platten und mischen Sie sie in einem Offline-Schüttelbrutator bei 800 Umdrehungen pro Minute fünf Minuten lang kurz. Versehen Sie die Platten mit einem Barcode und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei 80 Grad Celsius.

Berechnen Sie das erforderliche Volumen an mit Antibiotika angereicherten Medien für Deep-Well-Blöcke. Klicken Sie neben dem DWB-Flüssigkeitstransferprogramm auf Ausführen. Stellen Sie sicher, dass das Medium in den richtigen Behälter gegeben wird.

Die leeren Tiefbrunnenblöcke befinden sich in den richtigen Anordnungspositionen und es steht ein ausreichender Vorrat an Spitzen zur Verfügung. Stellen Sie das Programm so ein, dass 495 Mikroliter Medien ausgegeben werden. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie nacheinander auf OK, um das Programm zu starten.

Nun die gefüllten Tiefbrunnenblöcke mit atmungsaktiver Membran verschließen und bei 4 Grad Celsius zwischenlagern. Klicken Sie anschließend neben dem Programm "Aus aufgetautem MTP impfen" auf "Ausführen". Stellen Sie sicher, dass MTP-Kryovorräte und Fill-Deep-Well-Blöcke pro Layout auf die Plattform übertragen werden und dass ausreichend Spitzen geladen werden.

Klicken Sie nacheinander auf OK, um zu initialisieren. Wenn das Programm beendet ist, versiegeln Sie die über Nacht geimpften Deep-Well-Blöcke mit einer atmungsaktiven Membran. Übertragen Sie sie in einen Offline-Plattenschüttler-Inkubator, der auf 16 Stunden bei 30 Grad Celsius, 800 Umdrehungen pro Minute und 75 % Luftfeuchtigkeit eingestellt ist.

Verschließen, mischen und geben Sie die Kryostock-Mikrotiterplatten wieder in den 80-Grad-Gefrierschrank zurück. Berechnen Sie nun das benötigte Volumen an Medien, ergänzt mit verschiedenen Effektor- und Antibiotika-Konzentrationen, für die über Nacht zu siebenden Tiefbrunnenblöcke. Klicken Sie neben dem DWB-Flüssigkeitstransferprogramm auf Ausführen.

Stellen Sie dann sicher, dass die mit Effektoren ergänzten Medienbehälter richtig platziert sind. Fügen Sie leere Deep-Well-Blöcke in die Liquid-Handler-Plattform ein. Wenn genügend Tipps verfügbar sind, klicken Sie nacheinander auf OK, um das Protokoll zum Generieren von Assay-Deep-Well-Blöcken zu starten.

Verschließen Sie die Deep-Well-Blöcke des Assays nach dem Befüllen mit einer atmungsaktiven Membran. Füllen Sie den Liquid Handler mit leeren Tellern auf. Wiederholen Sie die Inokulation, bis alle Assay-Blöcke gefüllt sind.

Klicken Sie anschließend neben dem DWB-Programm "In Assay übertragen" auf "Ausführen". Nach dem unversiegelten Assay werden Deep-Well-Blöcke mit effektorergänzten Medien korrekt platziert, Deep-Well-Blöcke mit gewachsenem P.putida pro Layout über Nacht übertragen und entsiegelt. Klicken Sie nacheinander auf OK, um das Protokoll zu starten.

Wenn das Programm abgeschlossen ist, versiegeln Sie die Transfer-Assay-Platten in den Offline-Inkubator. Entsorgen Sie die Tiefbrunnenblöcke über Nacht nach der Inokulation. Als nächstes überträgst du die Tiefbrunnenblöcke in eine Zentrifuge.

Pelletzellen bei 4.000 G in einem eisgesteuerten Rotor bei 18 Grad Celsius für fünf Minuten. Nachdem Sie den Überstand entsorgt haben, legen Sie die Zentrifugenblöcke auf die Liquid-Handler-Plattform. Berechnen Sie das Volumen des einmal benötigten PBS basierend auf der Anzahl der zu siebenden Tiefbrunnenblöcke.

Klicken Sie neben dem Assay auf Ausführen, PBS-Resuspensionsprogramm einrichten und das Dispensationsvolumen auf 500 Mikroliter festlegen. Stellen Sie dann sicher, dass PBS in das richtige Reservoir gegeben wird, und ordnen Sie die zentrifugierten Platten entsprechend dem Layout an. Klicken Sie auf OK, um das Programm zu starten, nachdem Sie die Verfügbarkeit des Tippes bestätigt haben.

Verschließen Sie die resuspendierten Deep-Well-Blöcke wieder und entfernen Sie sie aus dem Liquid Handler. Überprüfen Sie die Unterseite der Platte, um sicherzustellen, dass die Pellets vollständig resuspendiert sind. Klicken Sie neben den Assay-Setup-Zellen und dem MTP-Programm der PBS-Edition auf Ausführen.

Anschließend werden die resuspendierten Deep-Well-Blöcke je nach Layout in den Liquid Handler überführt. Laden Sie die leeren Mikrotiterplatten entsprechend dem Layout und stellen Sie das Dosiervolumen auf 200 Mikroliter ein, bevor Sie auf OK klicken. Übertragen Sie die gefüllten Mikrotiterplatten auf einen Offline-Multimode-Plattenreader und messen Sie die relative Fluoreszenz und OD600.

Automatisiertes Screening von 5.000 Promotorvarianten identifizierte Top-Kandidaten mit einer mehr als 3,6-fachen Aktivierung. Die EC 50-Werte für 100 einzigartige Varianten wurden aufgetragen, um die Sensitivitätsverteilung zu visualisieren und robuste Kandidaten zu identifizieren. EC 50-Werte wurden für 226 angereicherte Varianten berechnet und mit Hilfe der Lin-Log-Transformation eingestuft, um eine sensitivitätsskalierte Bibliothek zu bilden.

Es wurde ein endgültiges Screening-Design mit einer Varianz von 1, 0 und 1 Pegel von vier Modulen erstellt. Die Modellprofile der Transport-, Regulator-, P-Out- und Ausgangs-Ribosomen-Bindungsstelle zeigten, wie sich Änderungen der Expressionsniveaus der vier Module nichtlinear auf EC 50 und den Hill-Koeffizienten auswirkten. Identifizierung optimaler Expressionskombinationen mit RBS-Out, die einen starken positiven Effekt sowohl auf die Empfindlichkeit als auch auf die Steigung zeigen.

Die global optimierte Biosensorvariante mit idealen Modulstärken zeigte eine verbesserte Empfindlichkeit und einen verbesserten Hill-Koeffizienten im Vergleich zur Eltern- und DSD-optimierten Version.