MALDI 质谱法测定小鼠组织提取物蛋白酶特异性: 操作 PH 值导致特异性改变

本实验的总体目标是确定多种粗提取物中的蛋白酶特异性。该方法可以帮助回答确定蛋白酶特异性的关键问题。该技术的主要优点是它可以识别 parlay 中多个样品的蛋白酶特异性。

从雄性 ICR 小鼠获得的冰中冷却肺组织样品。在搅拌机中以 20， 000 RMP 的浓度将样品均质化 30 秒。重复此步骤，直到样品完全均匀。

请勿连续均质超过一分钟，以避免温度升高。将 1， 000 微升匀浆转移到 1.5 毫升试管中，并在 4 摄氏度下以 10， 000 倍 G 离心 5 分钟。将 500 μL 上清液转移到新的 1.5 mL塑料管中。

使用 10 μL 样品测定蛋白质浓度。使用二辛可宁酸测定或 Bradford 测定等方法。为防止冻结，向样品中加入 80% 甘油，最终浓度为 50% 甘油。

为了阐明蛋白酶特异性的差异取决于 pH 值，请使用调节至 pH 值 3、5、7 和 9 的消化缓冲液。在 890 μL 消化缓冲液中，加入 10 μL 0.1 μg /μL 或 TPCK 胰蛋白酶、0.1 μg /μL 金黄色葡萄球菌 V8 蛋白酶或每 μL 组织提取物 10 μg。通过孵育并将水煮沸 10 分钟来灭活组织提取物中的蛋白酶，以制备阴性对照。

接下来，向样品中加入 10 μL MNO 生物素标记底物，并在 37 摄氏度下孵育 3 小时以消化。孵育后，用沸水停止消化底物 10 分钟。将消化的底物在 4 摄氏度下以 10， 000 倍 G 离心 5 分钟。

将上清液转移到新的 1.5 ml 试管中。在含有 0.1% 聚氧乙烯辛基苯醚的 50% 链霉亲和素琼脂糖凝胶珠中加入 50 毫升 50% 链霉亲和素琼脂糖凝胶珠。使用 pH 试纸确保溶液在 pH 值 9 左右。

将适当的 pH 值调整到 9 或更高很重要。氨基生物素不能咬珠，除非它的 pH 值为 9 或更高。如果溶液的 pH 值较低，则通过添加更多缓冲液将其调节至大约 pH 9。

此外，如果需要，可以添加一种 molar tris 缓冲液以提高 pH 值。将悬浮液在 4 摄氏度下孵育过夜，在旋转轮上连续轻轻混合，以将 MNO 生物素标记的底物与链霉亲和素结合。珠子应在整个孵育过程中保持悬浮状态。

第二天，在 4 摄氏度下以 10， 000 x G 离心样品 1 分钟。去除上清液后，加入 1， 000 微升洗涤缓冲液洗涤珠子。然后，在 4 摄氏度下孵育 10 分钟，并在旋转器上连续轻轻混合。

在 4 摄氏度下以 10， 000 倍 G 离心珠子 1 分钟。去除上清液并重复此洗涤四次。接下来，向珠子中加入 100 微升 0.2% 三氟乙酸。

使用 pH 试纸确保溶液低于 pH 2。如果溶液的 pH 值较高，则通过添加 1% 三氟乙酸将 pH 值调节至 2 以下。将悬浮液在室温下孵育 30 分钟，并在旋转轮上连续温和混合。

像以前一样离心珠子后，将上清液转移到新的 1.5 mL 试管中。将 20 μL 乙腈吸取到 C18 填料上以将其激活。取出用过的乙腈并重复此活化步骤三次。

然后，用 20 微升 0.1% 三氟乙酸平衡 C18 树脂。去除洗脱液并重复此平衡步骤 3 次。要加载样品，请使用移液管将它们结合到树脂上。

用 20 微升 0.1% 三氟乙酸洗涤树脂。重复此步骤 5 次。用 3 微升 60% 乙腈的 0.1% 三氟乙酸溶液洗脱样品。

在目标板上吸取洗脱液以进行 MALDI-TOF 质谱法。立即加入 CHCA 溶液，在 50% 乙腈和 0.1% 三氟乙酸中饱和。通过风干使混合物结晶。

根据仪器制造商的方案采集样品的质谱，密切关注生物素标记底物裂解形式的 700 至 900 道尔顿的质谱。合成底物的质谱如图所示。检测到与母离子分子量相对应的峰，介于 850 和 1， 050 之间。

裂解片段的检测范围为 700 至 850。此处显示的是用 TPCK 胰蛋白酶处理的 MNO 生物素标记底物的光谱。839.81 道尔顿峰和 796.76 道尔顿峰分别对应于从赖氨酸和精氨酸的 C 端裂解的片段。

此处显示的是用 V8 蛋白酶消化的合成底物的质谱。769.78 道尔顿峰和 755.62 道尔顿峰分别对应于从谷氨酸和天冬氨酸的 C 端裂解的片段。此处显示了在各种 pH 条件下用肺组织提取物处理的 MNO 生物素标记底物的光谱。

在酸性条件下，pH 值为 5，裂解片段的分子量分别为 770.13 道尔顿和 826.66 道尔顿，表明谷氨酸和色氨酸的 C 端发生裂解。在中性和碱性条件下，pH 值为 7 和 9，裂解片段的分子量在 767 道尔顿和 840 道尔顿的峰处增加，表明在精氨酸和赖氨酸的 C 端被裂解。相反，谷氨酸和色氨酸的峰降低。

此外，该方法不能检测具有灭活提取物的裂解片段。一旦掌握，如果作得当，这项技术可以在两天内完成，除了底物的合成。此外，一旦合成了底物，就可以在多个样品中进行测量。为什么？

尝试此程序时，请务必记住在缓冲液 pH 值（大约 9）下作。通常，亲和素氨基生物素复合物的反应。按照此程序，可以通过执行 CMS 来量化酶活性。

这种方法将使 proteon 领域的研究人员能够为探索多种条件下的蛋白酶表达铺平道路。