Name: Genomweite Überwachung der Übertragungsfehler in Eukaryonten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mit C-Seq endogene Transkriptionsfehler in eukaryotischen Organismen genomweit überwachen. Diese bioinformatische Methode ermöglicht präzise Analysen der Transkriptionsgenauigkeit für Mutagenesestudien.

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Diese Publikation möglich wurde durch die Finanzierung von Grant T32ES019851 (zu C. Fritsch), gewähren, R01AG054641 und AFAR junge Ermittler (M. Vermulst).

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<li>Zhou, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+RNA+polymerase+rpoB+mutations+that+alter+transcription+slippage+during+elongation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of RNA polymerase rpoB mutations that alter transcription slippage during elongation in Escherichia coli.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288, 2700-2710 (2013).</li>
<li>Reid-Bayliss, K. S., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+RNA+consensus+sequencing+for+high-fidelity+detection+of+transcriptional+mutagenesis-induced+epimutations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Accurate RNA consensus sequencing for high-fidelity detection of transcriptional mutagenesis-induced epimutations.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114, 9415-9420 (2017).</li>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier beschreiben wir eine optimierte Protokoll für die Vorbereitung der C-Seq-Bibliotheken für den Nachweis von Übertragungsfehler in Saccharomyces Cerevisiae, Drosophila Melanogasterund Caenorhabditis Elegans. Dieses Protokoll hat zahlreiche Vorteile gegenüber bestehenden Protokolle sowie alternative Verfahren.
In den letzten 15 Jahren wurden zahlreiche Reporter-Systeme entwickelt, die auf Luciferase7,8 oder...

Das Genom enthält eine genaue biologische Bauplan des Lebens. Um dieses Konzept richtig zu implementieren, ist es wichtig, dass das Genom mit großer Präzision transkribiert werden. Transkription ist jedoch unwahrscheinlich, fehlerfrei zu sein. Z. B. RNA-Polymerasen sind seit langem bekannt, fehleranfällige in-vitro-1,2, und es wurde kürzlich gezeigt, dass sie Fehler in Vivo begehen sowie3,5,6, besonders bei der Konfrontation mit DNA-Schaden7,8,9,10. Zusammengenommen zeigen diese Beobachtungen, dass Übertragungsfehler auftreten kontinuierlich in allen lebenden Zellen, was darauf hindeutet, dass sie eine potente Quelle für mutierte Proteine sein könnte.
Dabei bezeichnet transkriptionelle Mutagenese, unterscheidet sich von klassischen Mutagenese in zweierlei Hinsicht. Erstens im Gegensatz zu genetischen Mutationen, Übertragungsfehler mitotische und Post-mitotische Zellen beeinflussen, wie sie DNA-Replikation nicht abhängen. Die Mechanismen, die die Treue der Transkription auswirken wird, daher wertvolle Einblicke in die Mutation Last der mitotischen und Post-mitotischen Zellen bereitstellen. Interessanterweise, Übertragungsfehler haben vor kurzem bei der Förderung von Protein Aggregation11,12,13 in Verbindung gebracht und haben beide Karzinogenese10 Beitrag zur vermutet worden und die Entwicklung der Antibiotika-Resistenz bei Bakterien14.
Zweitens sind im Gegensatz zu genetischen Mutationen, Übertragungsfehler vorübergehend in der Natur. Ihre temporäre Existenz ist besonders anspruchsvoll, da dadurch Übertragungsfehler überaus schwer zu erkennen. Zum Beispiel während verschiedenen Laboren wertvolle Reporter Assays für die Untersuchung der transkriptionellen Mutagenese geplant haben, können diese Tests nur Übertragungsfehler in einer begrenzten Anzahl von Kontexten und Modell Organismen4,15messen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben viele Forscher RNA Sequenzierung Technik (RNA-Seq) verwandelt, die theoretisch Übertragungsfehler während das Transkriptom Art aufgezeichnet werden können. Diese Studien sind jedoch leicht durch Bibliothek Bau Artefakte, z. B. reverse Transkriptionsfehler, PCR-Amplifikation Fehler und die fehleranfällige Art der Sequenzierung selbst verwechselt. Z. B. begehen Reverse Transcriptases etwa ein Fehler jeden ~ 20.000 Basen, während RNA-Polymerasen (RNAPs) nur ein Fehler alle 300.000 Basen5,6machen sollen. Da die Fehlerquote der reversen Transkription allein die Fehlerquote der RNA-Polymerasen in den Zellen Zwerge, ist es praktisch unmöglich, wahre Übertragungsfehler von Artefakten, verursacht durch die Bibliothek Vorbereitung mit traditionellen RNA-Seq-Daten ( zu unterscheiden Abbildung 1a).
Um dieses Problem zu lösen, entwickelten wir eine optimierte Version des Kreis-Sequenzierung (Cirseq oder C-Seq fortan) Assay5,16. Dieser Test ermöglicht dem Benutzer, Übertragungsfehler und andere seltene Varianten in der RNA in die Transkriptom-5zu erkennen. Rundschreiben-Sequenzierung Assay trägt diesen Namen, weil ein wichtiger Schritt in diesem Assay dreht sich um RNA Circularization. Sobald die RNA Ziele circularized sind, sind sie reverse transkribiert in einer rollenden Kreis Mode, lineare DNA-Moleküle zu produzieren, die zahlreiche Kopien der gleichen RNA-Vorlage enthalten. Wenn ein Fehler in einer dieser Vorlagen vorhanden war, würde dieser Fehler auch in jeder einzelnen Wiederholung das DNA-Molekül enthaltenen vorhanden sein. Im Gegensatz dazu Fehler eingeführt durch reverse Transkription, PCR-Amplifikation und Sequenzierung neigen dazu, die zufällig entstehen und werden somit in nur ein oder zwei Wiederholungen. Durch Erzeugung einer Konsensussequenz für jedes DNA-Molekül, und zufällige Fehler von allen wiederholt auftretenden Fehler zu unterscheiden, können so effektiv von wahren Übertragungsfehler (Abbildung 1 b) Bibliothek Bau Artefakte getrennt werden.
Richtig eingesetzt, kann C-Seq-Assay verwendet werden, um genau die Rate der Basis Substitutionen, Einfügungen und Löschungen in RNA in das Transkriptom aller Arten zu erfassen (siehe z. B. Traverse und Ochman17). Beispielsweise haben wir die C-Seq-Assay verwendet, um eine einheitliche Basis Abwicklung5 genomweite Messungen der Fehlerquote der Transkription in Saccharomyces Cerevisiae, Drosophila Melanogasterund Caenorhabditis Elegans ermöglichen (unveröffentlichte Beobachtungen). Ursprünglich verwendet, um präzise RNA-Virus Populationen sequenzieren, wurde diese optimierte Version des C-Seq-Assays modernisiert, um zu harte Bedingungen bei der Bibliothek-Vorbereitung zu minimieren, die Bibliothek Bau Artefakte beitragen. Darüber hinaus wird mithilfe einer Anzahl von im Handel erhältlichen Kits der Durchsatz des Assays, sowie die Benutzerfreundlichkeit verbessert. Wenn Sie richtig eingesetzt, kann dieser Assay genau Tausender Übertragungsfehler pro replizieren, dadurch erheblich zu verbessern, auf früheren Studien6erkennen. Insgesamt ist diese Methode bietet ein mächtiges Werkzeug um transkriptioneller Mutagenese studieren und ermöglicht es dem Benutzer, neue Einblicke in die Mechanismen, die die Treue der Transkription in einer Vielzahl von Organismen zu steuern.

<table><tbody><tr><td>RiboPure RNA-Aufreinigungskit</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1926</td><td>Gesamt-RNA-Aufreinigung</td></tr><tr><td>Genelute mRNA-Aufreinigungskit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MRN70-1KT</td><td>mRNA-Aufreinigung</td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td>Elution und Verdünnung</td></tr><tr><td>Ambion RNase III</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2290</td><td>RNA-Fragmentierung</td></tr><tr><td>T4 RNA-Ligase 1 (ssRNA Ligase)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204S</td><td>RNA-Zirkularisierung</td></tr><tr><td>Ribolock</td><td>ThermoFisher</td><td>EO0381</td><td>RNase-Inhibitor</td></tr><tr><td>SuperScript III Reverse Transkriptase</td><td>ThermoFisher</td><td>18080044</td><td>Reverse Transkription mit Rollkreis</td></tr><tr><td>10 mM dNTP-Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>18427013</td><td>Reverse Transkription mit Rollkreis</td></tr><tr><td>Zufällige Hexamere (50 ng/&micro; L)</td><td>ThermoFisher</td><td>N8080127</td><td>Reverse Transkription mit Rollkreis</td></tr><tr><td>NEB Zweitstrangsynthesemodul</td><td>New England Biolabs</td><td>E6111S</td><td>Zweitstrangsynthese</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit für Illumina</td><td>New England Biolabs</td><td>E7370S</td><td>cDNA-Bibliotheksvorbereitung</td></tr><tr><td>NEB Next Index Primer</td><td>NEB</td><td>E7335S</td><td>Multiplex-PCR-Primer</td></tr><tr><td>Oligo Clean & Konzentrator</td><td>Zymo Research</td><td>D4061</td><td>Aufreinigung von RNA- und DNA-Proben</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>ThermoFisher</td><td>12321D</td><td>Aufreinigung von magnetischen Beads</td></tr><tr><td>AMPure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Aufreinigung von magnetischen Beads</td></tr><tr><td>Eppendorf 5424 Mikrozentrifuge</td><td>FisherScientific</td><td>05-403-93</td><td>Zentrifugation</td></tr><tr><td>INCU-Shaker 10 L</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H1010</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>T100 Thermocycler</td><td>BIO RAD</td><td>1861096</td><td>Zyklische Bedingungen bei mittleren bis hohen Temperaturen</td></tr><tr><td>PTC-200 Thermocycler</td><td>GMI</td><td>8252-30-0001&nbsp;</td><td>Zyklische Bedingungen bei niedrigen Temperaturen</td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Molecular Bioproducts</td><td>700S-11</td><td>Sterilisation</td></tr><tr><td>50 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Corning</td><td>430290</td><td>Nukleasefreies</td></tr><tr><td>15 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Corning</td><td>430052</td><td>Nukleasefreie</td></tr><tr><td>Eppendorf Röhrchen</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td>Nukleasefrei</td></tr><tr><td>4200 Tapestation System</td><td>Agilent</td><td>G2991AA</td><td>Nukleotidanalysegerät für die Qualitätskontrolle von RNA- und einzelsträngigen DNA-Proben</td></tr><tr><td>Hochempfindliches RNA-Bildschirmband</td><td>Agilent</td><td>5067-5579</td><td>Qualitätskontrolle von RNA- und einzelsträngigen DNA-Proben</td></tr><tr><td>RNA ScreenTape Probenpuffer</td><td>Agilent</td><td>5067-5577</td><td>Qualitätskontrolle von RNA- und einzelsträngigen DNA-Proben</td></tr><tr><td>RNA ScreenTape Ladder</td><td>Agilent</td><td>5067-5578</td><td>Qualitätskontrolle von RNA- und einzelsträngigen DNA-Proben</td></tr><tr><td>2100 Bioanalysator Instrument</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td>Qualitätskontrolle doppelsträngiger DNA Qualitätskontrolle</td></tr><tr><td>High Sensitivity DNA</td><td>Kit Agilent</td><td>5067-4626</td><td>Qualitätskontrolle für doppelsträngige cDNA-Proben</td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>VWR</td><td>462-0244</td><td>Inkubation</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000C Spektralphotometer</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-2000C</td><td>Bestimmung der RNA-Konzentration</td></tr></tbody></table>

genomweite Überwachung der Übertragungsfehler in eukaryonten

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Genaue Transkription ist erforderlich für den treuen Ausdruck der genetischen Information. Überraschend allerdings wenig über die Mechanismen, die die Treue der Transkription zu steuern bekannt ist. Um diese Lücke in den wissenschaftlichen Erkenntnissen optimiert wir vor kurzem die Kreis-Sequenzierung Assay um Übertragungsfehler während das Transkriptom des Saccharomyces Cerevisiae, Drosophila Melanogasterund Caenorhabditis erkennen Elegans. Dieses Protokoll erhalten Forscher mit ein leistungsfähiges neues Tool um die Landschaft der Übertragungsfehler in eukaryontischen Zellen zuzuordnen, so dass die Mechanismen, die die Treue der Transkription Steuern noch nie da gewesenen detailliert aufgeklärt werden können.

Wie alle massiv parallelen Sequenzierung Ansätze produziert jedes C-Seq-Experiment eine sperrige, große Datasets. Für Erstanwender kann es schwierig zu handhaben diese Datasets sein; Daher empfiehlt es sich, dass alle Benutzer wenden Sie sich an einen erfahrenen Bio-Informatician vor dem experimentieren. Im Durchschnitt ist die Erwartung, dass Benutzer ca. 55 – 70 Giga Basen (Gbases) pro Durchlauf auf den meisten massiv parallelen Sequenzierung Plattformen generieren werden. Für dieses Pr...

Dieses Protokoll bietet Forschern mit einem neuen Tool um die Treue der Transkription in mehrere Modellorganismen zu überwachen.

Genomweite Überwachung der Übertragungsfehler in Eukaryonten

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der transkriptionellen Mutagenese zu beantworten, z. B. welche RNA-Polymerase-Untereinheiten oder biologische Prozesse die Genauigkeit der Transkription steuern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Messung von endogenen Transkriptionsfehlern in den Transkriptomen eukaryotischer Organismen ermöglicht. Im Allgemeinen werden Personen, die mit diesem Protokoll noch nicht vertraut sind, aufgrund der Länge und Komplexität des Assays und des Bedarfs an fortschrittlicher Bioinformatik zur Interpretation der Daten zu kämpfen haben.Um das Protokoll zu starten, zirkulieren Sie die RNA-Fragmente, indem Sie 20 Mikroliter der zuvor vorbereiteten Probe eine Minute lang bei 65 Grad Celsius denaturieren. Nach einer Minute legen Sie die Probe sofort für zwei Minuten auf Eis. Fügen Sie als Nächstes vier Mikroliter 10x T4-RNA-Ligase-Puffer, vier Mikroliter 10 millimolares ATP, einen Mikroliter RNase-Inhibitor, einen Mikroliter nukleasefreies Wasser und acht Mikroliter 50%iges Polyethylenglykol oder PEG hinzu.Anschließend wird die Probe durch Vortexen gründlich gemischt. Fügen Sie dann zwei Mikroliter à 10 Einheiten pro M

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Wir präsentieren einen strategischen Plan und ein Protokoll zur Identifizierung nicht-kodierender genetischer Varianten, die die DNA-Bindung des Transkriptionsfaktors (TF) beeinflussen. Es wird ein detailliertes experimentelles Protokoll für die elektrophoretische Mobilitätsverschiebungs-Assay (EMSA) und den DNA-Affinitäts-Präzipitations-Assay (DAPA) der Genotyp-abhängigen TF-DNA-Bindung bereitgestellt.

Screening für Funktionelle nichtkodierenden genetischen Varianten Mit elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay (EMSA) und DNA-Affinitätspräzipitation Assay (DAPA)

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um eine Auflösung nahe der Basenpaarauflösung von Protein-DNA-Wechselwirkungen zu erreichen. Dies wird durch eine Exonuklease-Behandlung von DNA-Fragmenten erreicht, die selektiv durch Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP-exo) angereichert sind, gefolgt von einer Hochdurchsatz-Sequenzierung.

Der Chip-exo-Methode: Ermittlung von Protein-DNA-Wechselwirkungen mit Near-Basenpaar Precision

Wir beschreiben einen grundlegenden experimentellen Ansatz zur Analyse der Beendigung der Transkription durch RNA-Polymerase II in vivo unter Verwendung von BrUTP durch den strangspezifischen Transkriptions-Run-on-Ansatz (TRO) in knospenden Hefen. Dieses Protokoll kann erweitert werden, um die Transkriptionsbeendigung durch andere RNA-Polymerasen sowohl in Hefe als auch in höheren Eukaryoten zu untersuchen.

Die Analyse der Beendigung der Transkription unter Verwendung von BrUTP strangspezifische Transkription Run-on (TRO) Ansatz

Wir beschreiben die Chromatin-endogene Spaltung, gekoppelt mit der Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChEC-seq), einer Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) -orthogonalen Methode zur Kartierung von Proteinbindungsstellen genomweit mit Mikrokokken-Nuklease (MNase) -Fusionsproteinen.

Genom-weite Abbildung von Protein-DNA-Wechselwirkungen mit ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Dieses Protokoll beschreibt die kombinatorische Verwendung von ChIP-Seq, 4sU-Seq, total RNA-Seq und Ribosom profiling für Zelllinien und Primärzellen. Nachverfolgen von Änderungen im Transkriptionsfaktor verbindlich, de Novo Transkription, RNS-Verarbeitung, Umsatz und Übersetzung im Laufe der Zeit und zeigt den gesamten Verlauf der Ereignisse in aktivierten und/oder sich rasch verändernden Zellen ermöglicht.

Echtzeit-Analyse des Transkriptionsfaktors verbindlich, Transkription, Übersetzung und Umsatz, globale Ereignisse während der zellulären Aktivierung anzuzeigen

Unter Verwendung einer vormontierten Cas9 ist Ribonucleoprotein Komplex (RNP) eine leistungsfähige Methode für präzise und effiziente Genom-Bearbeitung. Hier heben wir ihre Nützlichkeit in einem breiten Spektrum von Zellen und Organismen, einschließlich der primären humanen Zellen und sowohl klassische und neue Modellorganismen.

Verbesserte Genom Bearbeitung mit Cas9 Ribonucleoprotein in verschiedenen Zellen und Organismen

Next Generation Sequencing (NGS) ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die genomische Charakterisierung, die durch die hohe Fehlerquote der Plattform (~0.5–2.0%) begrenzt ist. Wir beschreiben unsere Methoden zur Sequenzierung Fehler korrigiert, mit denen wir umgehen die NGS Fehlerquote und erkennen Mutationen bei Variante Allel Brüche so selten wie 0,0001.

Seltenes Ereigniserkennung mit Fehler korrigiert DNA und RNA Sequenzierung

Wir stellen eine schnelle und effiziente Methode vor, um häufige Brüche an fragilen Stellen durch native γH2A.X-Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) zu detektieren. Dieser Ansatz reduziert sowohl den Zeit- als auch den Arbeitsaufwand, der mit herkömmlichen γH2A.X ChIP-Assays verbunden ist, erheblich und behält gleichzeitig eine hohe Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit der Ergebnisse bei.

Erfassung häufiger fragiler Stellenbrüche durch natives γH2A. X ChIP

Insertionsmutagenese ist ein wesentliches Werkzeug in der Vorwärtsgenetik zur Identifizierung funktioneller genomischer Elemente. Hier beschreiben wir den Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts (InSET), eine Methode zum Nachweis von Lentivirus-Integrationsstellen innerhalb einer Lentivirus-basierten Insertionsmutagenese-Zellbibliothek.

Identifizierung funktionell relevanter Lentivirus-Integrationsstellen in einer Insertionsmutagenese-Zellbibliothek

In diesem Manuskript beschreiben wir ein Protokoll zur funktionellen Untersuchung der Transkription und der inhibitorischen Aktivität von antibakteriellen Wirkstoffen, die auf die bakterielle Transkription abzielen.

In - vitro - Transkriptionsassays und ihre Anwendung in der Drug Discovery

Erfahren Sie, wie Sie mit C-Seq endogene Transkriptionsfehler in eukaryotischen Organismen genomweit überwachen. Diese bioinformatische Methode ermöglicht präzise Analysen der Transkriptionsgenauigkeit für Mutagenesestudien.

Genomweite Überwachung der Übertragungsfehler in Eukaryonten

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