Genomweite Überwachung der Übertragungsfehler in Eukaryonten

Dieses Protokoll bietet Forschern mit einem neuen Tool um die Treue der Transkription in mehrere Modellorganismen zu überwachen.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der transkriptionellen Mutagenese zu beantworten, z. B. welche RNA-Polymerase-Untereinheiten oder biologische Prozesse die Genauigkeit der Transkription steuern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Messung von endogenen Transkriptionsfehlern in den Transkriptomen eukaryotischer Organismen ermöglicht. Im Allgemeinen werden Personen, die mit diesem Protokoll noch nicht vertraut sind, aufgrund der Länge und Komplexität des Assays und des Bedarfs an fortschrittlicher Bioinformatik zur Interpretation der Daten zu kämpfen haben.

Um das Protokoll zu starten, zirkulieren Sie die RNA-Fragmente, indem Sie 20 Mikroliter der zuvor vorbereiteten Probe eine Minute lang bei 65 Grad Celsius denaturieren. Nach einer Minute legen Sie die Probe sofort für zwei Minuten auf Eis. Fügen Sie als Nächstes vier Mikroliter 10x T4-RNA-Ligase-Puffer, vier Mikroliter 10 millimolares ATP, einen Mikroliter RNase-Inhibitor, einen Mikroliter nukleasefreies Wasser und acht Mikroliter 50%iges Polyethylenglykol oder PEG hinzu.

Anschließend wird die Probe durch Vortexen gründlich gemischt. Fügen Sie dann zwei Mikroliter à 10 Einheiten pro Mikroliter T4-RNA-Ligase hinzu. Mischen Sie die Probe erneut durch Pipettieren und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang bei 25 Grad Celsius in einem Thermocycler mit einer auf 30 Grad Celsius eingestellten Deckeltemperatur.

Nach der zweistündigen Inkubation geben Sie 10 Mikroliter nukleasefreies Wasser in die Probe und reinigen Sie die Probe mit einem Oligo-Reinigungs- und Konzentrationskit. Eluieren Sie die Probe in 20 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser. Um die zirkulären RNA-Moleküle rückwärts zu transkribieren, fügen Sie vier Mikroliter 10 millimolare dNTPs, vier Mikroliter 50 Nanogramm pro Mikroliter zufällige Hexamere und neun Mikroliter nukleasefreies Wasser zu neun Mikrolitern RNA hinzu.

Mischen Sie gründlich durch Pipettieren und denaturieren Sie die Probe eine Minute lang bei 65 Grad Celsius. Nachdem Sie die Probe denaturiert haben, legen Sie sie zwei Minuten lang auf Eis. Geben Sie acht Mikroliter 5x Puffer für die Erststrangsynthese, zwei Mikroliter 0,1 millimolare DTT und vier Mikroliter 200 Einheiten pro Mikroliter reverse Transkriptase in die Probe und mischen Sie sie durch Pipettieren.

Inkubieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei 25 Grad Celsius, wobei der Deckel fünf Grad Celsius über der Inkubationstemperatur eingestellt ist. Inkubieren Sie die Probe dann 20 Minuten lang bei 42 Grad Celsius und stellen Sie den Deckel auf 47 Grad Celsius ein. Eluieren Sie die Probe in 42 Mikrolitern Elutionslösung, nachdem Sie sie mit dem Clean Up and Concentrator Kit gereinigt haben.

Verwenden Sie das Synthesekit für den zweiten Strang, um eine doppelsträngige cDNA-Bibliothek zu generieren. Legen Sie die Proben auf Eis und geben Sie 30 Mikroliter NF-Wasser zu 38 Mikrolitern Ihrer Probe. Fügen Sie anschließend acht Mikroliter 10x Zweitstrangpuffer und vier Mikroliter Zweitstrangenzym hinzu und mischen Sie die Probe durch sanftes Pipettieren, bevor Sie sie zweieinhalb Stunden lang bei 16 Grad Celsius inkubieren.

Reinigen Sie die Proben mit dem Oligo-Aufreinigungs- und Konzentrationskit für 100-Mikroliter-Reaktionen und eluieren Sie die Proben in 38 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser. Mischen Sie die Endreparaturreaktion durch Pipettieren und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 20 Grad Celsius. Nach der 20-Grad-Inkubation folgt eine 30-minütige Inkubation bei 65 Grad Celsius.

Zuerst werden die Adapter für die Sequenzierung der nächsten Generation in 10 millimolaren Tris HCl auf eine Endkonzentration von 1,5 μmolar verzehnfacht. Geben Sie dann 2,5 Mikroliter verdünnten Adapter und einen Mikroliter Ligationsverstärker zu jeder Probe und mischen Sie sie durch Vortexen. Als nächstes fügst Du 15 Mikroliter Blunt TA Ligase Master Mix hinzu.

Pipettieren Sie die Probe auf und ab, um sie zu mischen und 15 Minuten lang bei 20 Grad Celsius zu inkubieren. Fügen Sie dann drei Mikroliter Uracil-spezifisches Exzisionsreagenzenzym hinzu und inkubieren Sie die Probe 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nachdem die Ligation abgeschlossen ist, fügen Sie der Probe 13,5 Mikroliter nukleasefreies Wasser hinzu, um ein Gesamtvolumen von 100 Mikrolitern zu erhalten, und fahren Sie mit der Größenauswahl fort.

Akklimatisieren Sie magnetische Kügelchen an Raumtemperatur. Geben Sie 30 Mikroliter akklimatisierte, resuspendierte magnetische Kügelchen zu jeder Probe und mischen Sie sie durch Pipettieren. Die Probe wird in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen umgefüllt und fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.

Legen Sie die Probe fünf Minuten lang auf einen Magnetständer, um die Kügelchen vom Überstand zu trennen. Füllen Sie den Überstand in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen um und entsorgen Sie die Magnetkügelchen. Geben Sie ein frisches Aliquot von 15 Mikrolitern magnetischen Kügelchen zu jeder Probe.

Durch Pipettieren gründlich mischen und fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Legen Sie die Proben auf ein Magnetgestell und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Entfernen und entsorgen Sie dann vorsichtig die Überstände, wobei Sie darauf achten, die Perlen nicht zu stören.

Geben Sie 200 Mikroliter 80% frisch zubereitetes Ethanol zu jeder der Proben, ohne die pelletierten magnetischen Kügelchen zu stören, und inkubieren Sie 30 Sekunden lang. Entfernen Sie dann alle Spuren von Ethanol vollständig von den Proben und trocknen Sie die Kügelchen fünf Minuten lang an der Luft, aber achten Sie darauf, die Kügelchen nicht zu stark zu trocknen. Um die Proben von den Kügelchen zu eluieren, nehmen Sie die Röhrchen vom Magnetständer.

Fügen Sie 19 Mikroliter 10 millimolare Tris HCl hinzu. Pipettieren Sie die Mischung mehrmals auf und ab, um die Kügelchen wieder zu suspendieren, und inkubieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Legen Sie die Proben wieder auf den Magnetständer und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang, um die Kügelchen vom Überstand zu trennen.

Entfernen Sie vorsichtig 15 Mikroliter des Überstands mit den gereinigten, größenausgewählten cDNA-Bibliotheken aus den Röhrchen und überführen Sie ihn in ein frisches 1,5-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie fünf Mikroliter Universalprimer und fünf Mikroliter eines einzigartigen Index-Primers in jede gereinigte cDNA-Bibliothek und mischen Sie sie durch Pipettieren gründlich. Prüfen Sie den Polymerase-Mastermix sorgfältig auf Kristalle und andere Ausfällungen und erwärmen Sie den Mastermix von Hand, bis sich die Ausfällungen aufgelöst haben.

Geben Sie 25 Mikroliter des Polymerase-Mastermixes in die Probe. Mischen Sie die Probe durch Pipettieren und befolgen Sie die Zyklusbedingungen, die im Begleittextprotokoll für die PCR-Amplifikation aufgeführt sind. Bereinigen Sie die endgültigen Bibliotheken, indem Sie 45 Mikroliter resuspendierter magnetischer Kügelchen direkt zur PCR-Reaktion hinzufügen.

Mischen Sie sie durch Pipettieren und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Geben Sie die Probe in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und legen Sie sie für fünf Minuten in ein Magnetstativ. Nach der Inkubation den Überstand entsorgen und zweimal 30 Sekunden lang mit frisch zubereitetem 80%igem Ethanol waschen.

Entfernen Sie nach dem zweiten Waschen das Ethanol vollständig aus der Probe und trocknen Sie das Bead-Pellet fünf Minuten lang an der Luft. Anschließend eluieren Sie es in 35 Mikrolitern 0,1x TE. Suspendieren Sie die Kügelchen durch Pipettieren und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Nachdem das Röhrchen fünf Minuten lang auf dem Magnetstativ gelegen hat, werden 30 Mikroliter des Überstands auf ein frisches 1,5-Milliliter-Röhrchen umgefüllt.

Lagern Sie die Bibliotheken bei minus 80 Grad Celsius. Nach Isolierung der RNA sind auf dem Elektrophoretogramm zwei unterschiedliche rRNA-Peaks sichtbar. Die Fragmentierung der RNA führt zu 50 bis 70 Basenpaar-RNA-Fragmenten.

Die Rolling-Circle-Reverse-Transkription wurde verwendet, um cDNA-Moleküle zu erzeugen, die aus mindestens drei Tandem-Wiederholungen der zirkulären RNA-Templates bestehen. Die Größenauswahl mit magnetischen Beads ermöglicht die Aufreinigung von Bibliotheken der entsprechenden Größe. Die Sequenzierungsinformationen einer einzelnen C-seq-Bibliothek zeigen, dass die meisten Wiederholungen tendenziell 45 bis 80 Basen lang sind.

Ungefähr 50 % der Bases, die sequenziert wurden, sind Teil dieser Wiederholungen. Da die meisten dieser Basen in Raten vorliegen, die drei oder mehr Wiederholungen enthalten, beträgt die Anzahl der eindeutigen Basen, die sequenziert werden, etwa ein Drittel der Gesamtzahl der sequenzierten Basen. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in zwei bis drei Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, immer eine sterile Arbeitsumgebung zu haben, die frei von RNAsen ist, die Ihre Arbeit beeinträchtigen könnten. Es ist auch wichtig, jeden Schritt sorgfältig zu befolgen, um sicherzustellen, dass während des Eingriffs keine Fehler gemacht werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Transkriptionsfehler bei Eukaryoten mit dem C-seq-Assay misst.