Verwendung von Viral Entry Assays und Molekulardocking-Analysen zur Identifizierung antiviraler Kandidaten gegen Coxsackievirus A16
15. Juli 2019
Das Ziel des Protokolls ist es, die verschiedenen Assays im Zusammenhang mit viralen Eintritte zu veranschaulichen, die verwendet werden können, um Kandidaten-Virus-Eintrittshemmer zu identifizieren.
Dieses Protokoll kann bei der Entdeckung potenzieller antiviraler kleiner Moleküle durch einen mechanismusgesteuerten Ansatz helfen. Der Zeitpunkt des Additionsassays bestimmt, in welchem Schritt der Infektion das kleine Molekül seine antivirale Aktivität aufweist. Das molekulare Andocken sagt die Wechselwirkung zwischen dem kleinen Molekül und den viralen Proteinen voraus.
Um den Einfluss von Medikamenten auf Wirtszellen vor der Virusinfektion zu bewerten, säen RD-Zellen in 12-Well-Platten mit einem zweifachen 10 bis die fünften Zellen pro Bohrdichtedichte. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator über Nacht. Am nächsten Morgen behandeln Sie jeden Brunnen der RD-Monoschicht mit einer Testverbindung von Interesse, in Dreifacharbeit, in ungiftigen Konzentrationen in einem Milliliter Basalmedium für ein oder vier Stunden.
Am Ende der Behandlungsinkubation die Zellen mit einem Milliliter PBS waschen, bevor Sie 50 plaquebildende Viruseinheiten in 300 Mikroliter Basalmedium pro Brunnen für eine Stunde hinzufügen, wobei alle 15 Minuten geschaukelt wird. Am Ende der Infektionsinkubation die Zellen mit PBS waschen und die Zellen mit einem Milliliter frischem Basalmedium mit 0,8% Methylcellulose überlagern. Nach 72 Stunden im Zellkultur-Inkubator jeden Brunnen mit zwei Millilitern PBS waschen und die Zellen mit 0,5 Millilitern 37%Formaldehyd pro Brunnen für 15 Minuten fixieren.
Am Ende der Fixierung die Brunnen mit PBS waschen und die Zellen mit 0,5 Millilitern 0,5% kristallvioletter Lösung pro Brunnen färben. Nach zwei Minuten die Brunnen mit einem sanften Wasserstrom waschen und die Platte trocknen lassen. Legen Sie dann die Platte auf eine weiße Leuchte zum Zählen und berechnen Sie den Prozentsatz der Coxsackievirus infizierten Zellen nach der Formel.
Für die molekulare Docking-Analyse laden Sie 3D-Moleküle der Testverbindungen von PubChem herunter. Wenn ein Molekül keine 3D-Struktur hochgeladen hat, laden Sie die 2D-Struktur herunter oder verwenden Sie die SMILE-Stringsequenz, um die Struktur über ein entsprechendes molekulares Programm in ein 3D-Molekül umzuwandeln. Laden Sie als Nächstes eine virale biologische Montageeinheit von RCSB Protein Data Bank herunter.
Löschen Sie die Lösungsmittel mit Hilfe eines geeigneten Bio-Computing-Programms aus der Protein Data Bank-Datei, ersetzen Sie die unvollständigen Seitenketten durch Daten aus der Dunbrack 2010 Rotamer-Bibliothek und fügen Sie der Struktur Wasserstoffe und Ladungen hinzu, wie zuvor berichtet. Um die Testverbindungen an die vorbereitete Viruseinheit anzudocken, laden Sie die Test-Compound-Datei als Liganden in die University of California San Francisco Chimera hoch und wählen Sie das gesamte vorbereitete virale Protein als Rezeptor für blindes Andocken aus. Beschränken Sie die Andockstelle für zusätzliches Andocken auf das virale Protein auf Regionen von Interesse, die aus den Blinddocking-Ergebnissen abgeleitet sind, indem Sie das Suchvolumen weiter reduzieren.
Laden Sie dann die Docking-Datei in ein entsprechendes molekulares Grafiksystem hoch, um die Bindungsmoduspositionen zu analysieren. Wählen Sie den Liganden aus, um polare Kontakte von der Verbindung zum viralen Protein zu finden, und identifizieren Sie die polaren Kontakte mit der Option zu beliebigen Atomen. Beide kleinen Moleküle, die in diesem repräsentativen Experiment getestet wurden, erzeugten nur einen marginalen Einfluss auf die Infektiosität des Coxsackievirus A16, sei es bei der Vorbehandlung der Wirtszellen vor einer Virusinfektion oder bei der Nachinfektionstherapie.
Im Gegensatz dazu haben die Moleküle die Infektion bei der Co-Additionsbehandlung effizient um mehr als 80 % aufgehoben, was darauf hindeutet, dass die beiden Verbindungen am effektivsten sind, wenn sie während der Infektion gleichzeitig mit den Viruspartikeln auf der Wirtszelloberfläche vorhanden sind. Die auf Flow-Zytometrie basierende Bindungsanalyse bestätigt, dass die beiden Tannine den Ausbruch der Coxsackievirus-A16-Infektion verhinderten, indem sie eine virale Partikelbindung an die Wirtszellen verhinderten. Das molekulare Andocken der Tannine deutet darauf hin, dass beide im Canyon-Bereich des Coxsackievirus-Pentamers, direkt über dem Tascheneingang, der den Taschenfaktor hält und eine wichtige Rolle bei der Vermittlung der Coxsackievirusbindung und dem Eindringen in die Wirtszelle spielt, vorhergesagt werden.
In diesen Oberflächenprojektionen können die einzigartigen Rückstände beobachtet werden, die von den polaren Kontakten der kleinen Moleküle um den Tascheneingang vorhergesagt werden, mit Asparagin-85, Lysin-257 und Asparagin-417 gemeinsam zwischen den beiden Tanninen. Beim molekularen Andocken muss bei der Rangfolge der Bindungsrahmen die Topologie des viralen Proteins berücksichtigt werden. Weitere Experimente könnten die Prüfung der antiviralen Aktivität der Verbindung auf rekombinante Viren umfassen, wobei Mutationen an den Aminosäuren entdeckt wurden, um ihre Bedeutung für die Wirksamkeit des Arzneimittels zu bestätigen.
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Übersicht
Dieses Protokoll unterstützt die Entdeckung potenzieller antiviraler Wirkstoffe mithilfe eines mechanismsbasierten Ansatzes. Es veranschaulicht verschiedene Tests zum viralen Eintritt, um Kandidaten für virale Eintrittshemmer zu identifizieren.
Wichtige Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Virologie
- Pharmakologie
- Zellbiologie
Hintergrund
- Das Verständnis der viralen Eintrittsmechanismen ist entscheidend für die Entwicklung antiviraler Therapien.
- Kleine Moleküle können den viralen Eintritt in verschiedenen Stadien hemmen.
- Assays können dabei helfen, wirksame antivirale Kandidaten zu identifizieren.
- Mechanismusgestützte Ansätze verbessern den Entdeckungsprozess.
Zweck der Studie
- Veranschaulichung von Assays zur Identifizierung von viralen Eintrittshemmstoffen.
- Beurteilung der antiviralen Wirkung von kleinen Molekülen.
- Schaffung eines Rahmens für die zukünftige Entdeckung antiviraler Wirkstoffe.
Verwendete Methoden
- Zeitpunkt-des-Zugabe-Assay, um den Schritt der Infektion zu bestimmen, der durch das kleine Molekül beeinflusst wird.
- Molekulares Docking, um Wechselwirkungen zwischen kleinen Molekülen und viralen Proteinen vorherzusagen.
- Protokolle zur Zellansaat und Behandlung von RD-Zellen.
- Beurteilung des Einflusses des Wirkstoffs auf Wirtszellen vor der Virusinfektion.
Hauptergebnisse
- Identifizierung von vielversprechenden kleinen Molekülen mit antiviralen Eigenschaften.
- Erkenntnisse zum Zeitpunkt der antiviralen Wirkung während der Infektion.
- Vorhergesagte Wechselwirkungen zwischen kleinen Molekülen und viralen Proteinen.
- Beurteilung der Wirtszellantworten auf antivirale Behandlungen.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet einen systematischen Ansatz für die Entdeckung von antiviralen Wirkstoffen.
- Mithilfe von Assays können potenzielle Inhibitoren des viralen Eintritts effektiv identifiziert werden.
- Zukünftige Studien können auf diesem Rahmenwerk für die Arzneimittelentwicklung aufbauen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die mechanistische Entdeckung von antiviralen Wirkstoffen erfordert die genaue Identifizierung von Verbindungen, die den viralen Eintritt blockieren – einen entscheidenden Wendepunkt in der frühen Infektion. Dieses Protokoll ermöglicht die Validierung von Zielstrukturen, indem es den Wirkstoffangriffspunkt identifiziert und molekulare Wechselwirkungen mit viralen Proteinen vorhersagt. Eine solche Risikominimierung unterstützt die Identifizierung von Leitverbindungen und die Selektion von Wirkstoffkandidaten in der Entwicklung antiviraler Wirkstoffpipelines.
Strategische Anwendungen in der biopharmazeutischen Forschung und Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem er mittels Zeitpunkt-der-Wirkstoffzugabe-Analyse bestimmt, an welchem Schritt der Infektion kleine Moleküle antivirale Wirkung entfalten.
- Operationaler Wert: Liefert quantitative Messwerte zur Infektionshemmung, um die Zielvalidierung und die mechanistische Risikominderung zu unterstützen.
- Prädiktiver Wert: Nutzt molekulares Docking, um Bindungsstellen an viralen Kapsidproteinen vorherzusagen, und ermöglicht so die Bestätigung des Zielmoleküls auf Ebene einzelner Aminosäurereste.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Verwendet bindungsbasierte Durchflusszytometrie-Assays, um die Anheftung von Viruspartikeln an Wirtszellen quantitativ zu messen.
- Operativer Wert: Standardisiert die Virusinaktivierung und Zeitpunktzugabe-Assays zur reproduzierbaren Bewertung der Wirksamkeit von Verbindungen unter verschiedenen Bedingungen.
- Skalierbarkeit: Bereitet validierte biologische Systeme (RD-Zellen) für nachgeschaltete Screening-Workflows und die Wiederverwendung von Assays vor.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet Daten zur frühen Hemmung der Virusvermehrung mit der Vorhersagekraft für antivirale Wirksamkeit durch die Bestätigung in orthogonalen Assays.
- Mechanistische Entwederung: Bestätigt die Zielstrukturenbindung, indem funktionelle Bindungsdaten mit vorhergesagten Resten aus Docking-Studien (z. B. Asparagin-85, Lysin-257, Asparagin-417) korreliert werden.
- Relevanz präklinischer Modelle: Verwendet krankheitsrelevante Infektionsmodelle mit Coxsackievirus A16, um die Inhibitorenaktivität in einem physiologisch relevanten System zu bewerten.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Kontinuum der antiviralen Wirkstoffentwicklung, von der frühen Target-Validierung bis hin zur Identifizierung von Leitstrukturen, und unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen auf Grundlage mechanistischer und quantitativer Daten.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem ermittelt wird, ob Wirkstoffe über eine Hemmung der Virusbindung oder über nachgelagerte Mechanismen wirken.
- Screening: Ermöglicht die Versuchstauglichkeit durch standardisierte Protokolle zur Messung der Virusbindung, Inaktivierung und Zeitpunkt-der-Zugabe.
- Analytik: Erzeugt quantitative abhängige Variablen (Prozent Hemmung der Infektion, Vorhersagen der Bindungsaffinität) für den Vergleich zwischen verschiedenen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Verknüpft Daten zur Eintrittshemmung mit der präklinischen Weiterentwicklung, indem die Bindung an Zielregionen im viralen Kapsid nachgewiesen wird.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform für das Screening von antiviralen Kandidaten gegen andere Picornaviren oder nicht umhüllte Viren.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen, indem prä-attachment-, Bindungs- und post-Bindungs-Antiviraleffekte unterschieden werden.
- Operationaler Wert: Gewährleistet Standardisierung und Reproduzierbarkeit des Assays über verschiedene Zeitpunkte der Zugabe, Bindungs- und Inaktivierungsformate hinweg.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem die Zielstrukturenbindung vor der ressourcenintensiven Optimierung von Leitverbindungen bestätigt wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Verbindungen mit doppelter Validierung durch funktionelle Assays und strukturelles Docking.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Virologie, Zellkultur und in der Anwendung von Software für molekulares Docking (z. B. UCSF Chimera).
- Benötigt Zugang zu einer Infrastruktur, die dem entsprechenden Biosicherheitslevel für den Umgang mit Viren und die Durchführung von Plaque-Assays entspricht.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Virologie- und computergestützten Biologie-Teams voraus, um eine konsistente Dateninterpretation zu gewährleisten.
- Erfordert Anpassungen, wenn Assays auf andere virale Systeme oder Zelllinien über die RD-Zellen hinaus ausgeweitet werden.
- Praktische Einschränkung: Die Genauigkeit des Dockings hängt von der Qualität der Proteinstruktur und der Vorbereitung des Liganden ab und erfordert eine Validierung mittels Mutagenese oder Bindungsassays.
