Name: Verwendung von Viral Entry Assays und Molekulardocking-Analysen zur Identifizierung antiviraler Kandidaten gegen Coxsackievirus A16 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Lernen Sie Viral Entry Assays und Molekulardocking zur Identifizierung antiviraler Kandidaten gegen Coxsackievirus A16. Diese Methode unterstützt Forscher bei der Entwicklung neuer antiviraler Therapien.

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Die Autoren danken Dr. Joshua Beckham von der University of Texas at Austin für die technische Unterstützung beim molekularen Andocken. Diese Studie wurde teilweise durch Fördermittel des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie Taiwans (MOST107-2320-B-037-002 bis C.-J.L. und L.-T.L.; MOST106-2320-B-038-021 und MOST107-2320-B-038-034-MY3 bis L.-T.L.).

HINWEIS: Alle Zellkulturen und Virusinfektionen müssen in zertifizierten Biosicherheitshauben durchgeführt werden, die dem Biosicherheitsniveau der behandelten Proben entsprechen. Die beiden Tannin-Klasse der kleinen Moleküle Chebulagsäure (CHLA) und Punicalagin (PUG), die beobachtet wurden, um effizient zu blockieren CVA16-Infektion9, werden als Beispiele für Kandidatenhemmende Mittel verwendet. Für Grundprinzipien in virologischen Techniken, Virusausbreitung, Bestimmung von Virustiter und Konzepten von Plaqueforming Units (PFU) oder Multiplizität von Infektionen (MOI) wird der Leser auf Referenz10verwiesen.
1. Zellkultur, Viruszubereitung, Compound-Vorbereitung und zusammengesetzte Zytotoxizität
<ol><li>Menschliche Rhabdomyosarkom (RD) Zellen sind Wirtszellen freizügig cvA16 Infektion11. Wachsen Sie die RD-Zellen in 10 ml des modifizierten Eagle-Mediums (DMEM) von Dulbecco, ergänzt durch 10% fetales Rinderserum (FBS), 200 U/ml Penicillin G, 200 g/ml Streptomycin und 0,5 g/ml Amphotericin B in T-75-Kolben bei 37 °C in einem 5%-CO2-Inkubator.</li>
	<li>Bereiten Sie CVA16 vor, indem Sie das Virus in RD-Zellen vermehren und viralen Titer in PFU/ml bestimmen. Für optimiertes Protokoll siehe Verweis11.</li>
	<li>Bereiten Sie die Prüfverbindungen und Kontrollen mit ihren jeweiligen Lösungsmitteln vor: lösen Sie beispielsweise CHLA und PUG in Dimethylsulfoxid (DMSO). Für alle Infektionsschritte bestand das Basalmedium aus DMEM plus 2% FBS und Antibiotika. HINWEIS: Die Endkonzentration von DMSO in den Test-Compound-Behandlungen beträgt in den Experimenten 0,25 % oder liegt unter 0,25 %; 0,25% DMSO wird als Negativkontrollbehandlung in die Vergleichstests einbezogen.</li>
	<li>Führen Sie den Zytotoxizitätstest der Testverbindungen an den FU-Zellen unter Verwendung eines zelllebensfähigkeitsbestimmenden Reagenzes wie XTT ((2,3-bis[2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-5-phenylamino)-carbonyl]-2H-Tetrazoliumhydroxid) durch. AusführlicheProtokolle finden Sie unter Referenz12. Bestimmen Sie die Zytotoxizitätskonzentrationen der Prüfverbindungen mit einer Analysesoftware wie GraphPad Prism gemäß dem Herstellerprotokoll. Für den Rest der Studie werden Arzneimittelkonzentrationen verwendet, die die Zelllebensfähigkeit nicht signifikant beeinflussen (95 % lebensfähige Zellen).</li>
</ol>2. Time-of-Drug-Addition Assay
<ol><li>
Bewertung des Einflusses von Medikamenten auf Wirtszellen vor einer Virusinfektion (Vorbehandlung)
	<ol>
<li>Seed RD-Zellen in 12-Well-Platten mit einer Saatdichte von 2 x 105 Zellen/Well. Über Nacht bei 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator inkubieren, um eine Monoschicht zu erhalten.</li>
		<li>Behandeln Sie FU-Zellen mit Testverbindungen in nichtzytotoxischen Konzentrationen (bestimmt ab Schritt 1.4) in 1 ml Basalmedienvolumen für 1 h oder 4 h.</li>
		<li>Waschen Sie Zellen mit 1-2 ml PBS, bevor Sie 50 PFU/Well des Virus in Basalmedium (Endvolumen des Inokulums ist 300 l) für 1 h. Rock die Platte alle 15 min.</li>
		<li>Nach der Infektion die Monolayer erneut mit PBS waschen und dann mit 1 ml Basalmedium mit 0,8% Methylcellulose für eine weitere Inkubation bei 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator überlagern.</li>
		<li>Nach 72 h Inkubation die Überlagerungsmedien entfernen und die Brunnen mit 2 ml PBS waschen.</li>
		<li>Fixieren Sie die Brunnen mit 0,5 ml 37% Formaldehyd für 15 min.</li>
		<li>Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie es erneut mit PBS.</li>
		<li>Beflecken Sie die Brunnen mit 0,5 ml 0,5% kristallvioletter Lösung. Dann entfernen Sie die Fleckenlösung innerhalb von 2 min und waschen Sie die Brunnen mit einem sanften Wasserstrom vor dem Austrocknen der Luft.</li>
		<li>Zählen Sie die viralen Plaques, indem Sie die Platte auf einen Weißlichtkasten legen. Berechnen Sie den Prozentsatz (%) CVA16-Infektion wie folgt: (Mean - des Plaquevirus +Arzneimittels / Mittelwert des Plaquevirus+DMSO-Kontrolle) </li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bewertung der Wirkung der gleichzeitigen Zugabe der Medikamente und des Virus (Koaddition)
	<ol>
<li>Seed RD-Zellen in 12-Well-Platten mit einer Saatdichte von 2 x 105 Zellen/Well. Über Nacht bei 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator inkubieren, um eine Monoschicht zu erhalten.</li>
		<li>Behandeln Sie RD-Zellen mit den Prüfverbindungen in den entsprechenden Konzentrationen und 50 PFU/Well von CVA16 (Endvolumen des Inokulums beträgt 300 l) gleichzeitig für 1 h. Gestein die Platte alle 15 min.</li>
		<li>Waschen Sie Zellen mit 1 ml PBS und überlagern Sie dann mit 1-2 ml Basalmedium, das 0,8% Methylcellulose enthält, für eine weitere Inkubation bei 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator.</li>
		<li>Stain virale Plaques mit Kristallviolett nach 72 h post-Infektion und bestimmen Die% CVA16-Infektion wie oben beschrieben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bewertung der Arzneimittelbehandlungswirkung nach viralem Eintritt (nach der Infektion)
	<ol>
<li>Seed RD-Zellen in 12-Well-Platten mit einer Saatdichte von 2 x 105 Zellen/Well. Über Nacht bei 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator inkubieren, um eine Monoschicht zu erhalten.</li>
		<li>Impfen Sie die RD-Zellen mit 50 PFU/Well von CVA16 (Endvolumen des Inokulums beträgt 300 l) für 1 h. Gestein die Platte alle 15 min.</li>
		<li>Waschen Sie die Brunnen mit 1-2 ml PBS und überlagern Sie die Zellen mit Basalmedien, die 0,8% Methylcellulose und die entsprechenden Konzentrationen von Prüfverbindungen enthalten.</li>
		<li>Stain virale Plaques mit Kristallviolett und zählen nach 72 h nach der Infektion und bestimmen die% CVA16 Infektion Inkubationen oben beschrieben. HINWEIS: Führen Sie alle PBS-Washes vorsichtig aus, um das Heben der Zellen zu vermeiden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Flow Cytometry-basierter Bindungstest
<ol><li>Seed RD-Zellen in 12-Well-Platten mit einer Saatdichte von 2 x 105 Zellen/Well. Über Nacht bei 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator inkubieren, um eine Monoschicht zu erreichen.</li>
	<li>Die Zellmonoschicht bei 4 °C für 1 h vorkühlen.</li>
	<li>Infizieren Sie RD-Zellen mit CVA16 (MOI = 100) in Gegenwart und Abwesenheit der Prüfverbindungen für 3 h bei 4 °C. HINWEIS: Führen Sie die virale Impfung auf Eis und die anschließende Inkubation in einem 4 °C-Kühlschrank durch, um die Temperatur bei 4 °C zu halten, was eine virale Bindung, aber keinen Eintritt ermöglicht.</li>
	<li>Entfernen Sie Virus Inoculum und waschen Sie einmal mit 1-2 ml eiskalte PBS.</li>
	<li>Heben Sie zellen, indem Sie 1 ml eiskalten Dissoziationspuffer für 3 min zu den Brunnen auf dem Eis hinzufügen, bevor Sie die Zellen sammeln und in eiskaltem Durchflusszytometriepuffer (1x PBS plus 2% FBS) wieder aufhängen.</li>
	<li>Waschen Sie Zellen zweimal mit dem eiskalten Durchflusszytometriepuffer und fixieren Sie die Zellen mit 0,5 ml 4% Paraformaldehyd für 20 min auf Eis.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen mit PBS, um alle ungebundenen oder schwach gebundenen Viren zu entfernen, und färben Sie dann die Zellen mit 1 ml Anti-VP1-Antikörper (1:2.000; verdünnt in PBS mit 3% BSA) auf Eis für 1 h, gefolgt von einer Inkubation mit einem sekundären Alexa 488-konjugierten Anti-Maus-IgG (1:250; in PBS mit 3% BSA) auf Eis für 1 h verdünnt. Führen Sie PBS-Waschungen (3-mal) nach jeder Antikörperbehandlung durch.</li>
	<li>Setzen Sie die Zellen in 0,5 ml des eiskalten Durchflusszytometriepuffers aus und führen Sie die Durchflusszytometrieanalyse an einem Durchflusszytometer mithilfe von Standardverfahren durch. Präsentieren Sie Daten in Histogrammen mit der zugehörigen Software und quantitieren Sie für die Darstellung von Balkendiagrammen.</li>
</ol>4. Viraler Inaktivierungstest
<ol><li>
Führen Sie den viralen Inaktivierungstest wie zuvorbeschrieben 12 unter Verwendung der folgenden Bedingungen durch: - Eine Anfangskonzentration von 106 PFU/ml CVA16. - RD-Zell-Monolayer in 12-Well-Platten aus einer Sädichte von 2 x 105 Zellen/Well. - 50-fache Verdünnung zum Austäupfen der Wirkstoffverbindungen, was zu einer endgültigen Viruskonzentration von 50 PFU/Well führt. - Waschschritte mit 1-2 ml PBS. - Overlay-Medien mit 0,8% Methylcellulose.</li>
	<li>Führen Sie die endgültige Auslesung der Virusinfektion mit der kristallvioletten Färbung von viralen Plaques Verfahren wie oben beschrieben.</li>
</ol>5. Molekulare Docking-Analyse
<ol><li>Laden Sie 3D-Moleküle von Testverbindungen von PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) herunter. Wenn Moleküle keine 3D-Struktur hochgeladen haben, laden Sie die 2D-Strukturen herunter oder verwenden Sie die SMILES-String-Sequenz und wandeln Sie sich über ein molekulares Programm (z.B. CORINA) in 3D-Moleküle um.</li>
	<li>Laden Sie die virale biologische Montageeinheit von der RCSB Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/) herunter und erstellen Sie das virale Strukturmodell mit einem Biocomputing-Programm (z.B. UCSF Chimera). Zum Beispiel, im Fall von CVA16 reifen Virionenkristallstruktur (PDB: 5C4W)3, löschen Lösungsmittel aus der PDB-Datei, ersetzen unvollständige Seitenketten mit Daten aus der Dunbrach 2010 Rotamer Library, und fügen Sie Wasserstoffe und Ladungen zur Struktur als zuvor gemeldet13. Docking-Ziele können alle relevanten viralen Proteine für die beabsichtigte Analyse mit einer biologischen Montageinformation (Protein Data Bank) sein.</li>
	<li>
Dock-Test-Compounds auf die vorbereitete Viruseinheit mit z.B. UCSF Chimera und analysieren Sie die Ausgabedateien mit einer Visualisierungssoftware (z.B. Autodock Vina, PyMol):
	<ol>
<li>Laden Sie die Test-Compound-Datei in UCSF Chimera als "Ligand" hoch und führen Sie blindes Andocken durch, indem Sie das gesamte vorbereitete virale Protein als "Rezeptor" auswählen. Verwenden Sie die Computermaus oder das Trackpad, um die Größe des Suchvolumens auf den gesamten "Rezeptor" zu ändern. Lassen Sie unter "Erweiterte Optionen" die Anzahl der Bindungsmodi maximal zu. Docking-Frames werden automatisch von der höchsten bis zur niedrigsten Bindungsenergie gewertet.</li>
		<li>(Optional) Beschränken Sie die Andockstelle nach dem Blindandocken auf das virale Protein in Bereichen von Interesse, die aus den Blinddocking-Ergebnissen abgeleitet sind, indem Sie die Maus oder das Trackpad erneut verwenden, um das Suchvolumen zu reduzieren (z. B. 100 x 100 x 100 X). Dieser Schritt hilft, die Blind-Docking-Ergebnisse zu bestätigen und erhöht die Spezifität.</li>
		<li>Verwenden Sie ein molekulares Grafiksystem (z. B. PyMol), um die Positionen der Bindungsmodi zu analysieren, indem Sie die Dockingdatei hochladen. Finden Sie polare Kontakte von der Verbindung zum viralen Protein, indem Sie den "Ligand" auswählen und polare Kontakte mit der Option "zu beliebigen Atomen" identifizieren; die Ergebnisse zu untersuchen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Legay, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatal+coxsackievirus+A-16+pneumonitis+in+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Fatal coxsackievirus A-16 pneumonitis in adult.</a> Emerging Infectious Diseases. 13, 1084-1086 (2007).</li>
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<li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+coxsackievirus+A16+capsids+with+native+antigenicity%3A+implications+for+particle+expansion%2C+receptor+binding%2C+and+immunogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Structures of coxsackievirus A16 capsids with native antigenicity: implications for particle expansion, receptor binding, and immunogenicity.</a> Journal of Virology. 89, 10500-10511 (2015).</li>
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<li>Yamayoshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scavenger+receptor+B2+is+a+cellular+receptor+for+enterovirus+71%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Scavenger receptor B2 is a cellular receptor for enterovirus 71.</a> Nature Medicine. 15, 798-801 (2009).</li>
<li>Yamayoshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+SCARB2-dependent+infection+by+coxsackievirus+A7%2C+A14%2C+and+A16+and+enterovirus+71%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Human SCARB2-dependent infection by coxsackievirus A7, A14, and A16 and enterovirus 71.</a> Journal of Virology. 86, 5686-5696 (2012).</li>
<li>Lin, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrolyzable+tannins+%28chebulagic+acid+and+punicalagin%29+target+viral+glycoprotein-glycosaminoglycan+interactions+to+inhibit+herpes+simplex+virus+1+entry+and+cell-to-cell+spread%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread.</a> Journal of Virology. 85, 4386-4398 (2011).</li>
<li>Lin, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad-spectrum+antiviral+activity+of+chebulagic+acid+and+punicalagin+against+viruses+that+use+glycosaminoglycans+for+entry%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry.</a> BMC Microbiology. 13, 187(2013).</li>
<li>Lin, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+targeting+coxsackievirus+A16+capsid+inactivate+viral+particles+and+prevent+viral+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Microbes+%26+Infections%22%5BJournal%5D)">Small molecules targeting coxsackievirus A16 capsid inactivate viral particles and prevent viral binding.</a> Emerging Microbes & Infections. 7, 162(2018).</li>
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<li>Velu, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BPR-3P0128+inhibits+RNA-dependent+RNA+polymerase+elongation+and+VPg+uridylylation+activities+of+Enterovirus+71%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">BPR-3P0128 inhibits RNA-dependent RNA polymerase elongation and VPg uridylylation activities of Enterovirus 71.</a> Antiviral Research. 112, 18-25 (2014).</li>
<li>Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Viral+Entry+Assays+for+the+Identification+and+Evaluation+of+Antiviral+Compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds.</a> Journal of Visualized Experiments. , e53124(2015).</li>
<li>Lang, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DOCK+6%3A+combining+techniques+to+model+RNA-small+molecule+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">DOCK 6: combining techniques to model RNA-small molecule complexes.</a> RNA. 15, 1219-1230 (2009).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coxsackievirus+A16+utilizes+cell+surface+heparan+sulfate+glycosaminoglycans+as+its+attachment+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Microbes+%26+Infections%22%5BJournal%5D)">Coxsackievirus A16 utilizes cell surface heparan sulfate glycosaminoglycans as its attachment receptor.</a> Emerging Microbes & Infections. 6, 65(2017).</li>
<li>Waterhouse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWISS-MODEL%3A+homology+modelling+of+protein+structures+and+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes.</a> Nucleic Acids Research. 46, W296-W303 (2018).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.

In diesem Bericht haben wir die Protokolle beschrieben, die für die Identifizierung antiviraler Kandidaten nützlich sind, die auf die Viruseingabe abzielen, insbesondere gegen die nicht umhüllte CVA16. Die Assays sind so konzipiert, dass die frühen Ereignisse während des viralen Eintrags sezieren, was hilfreich ist, um den Wirkmechanismus(n) und die potenziellen Ziele der antiviralen Aktivität der Testmittel zu klären. Der "Time-of-Drug-Addition ssay" ermöglicht es, das potenzielle Ziel der Testverbindungen, z. B. die ni...

Die Hand-, Fuß- und Mundkrankheit (HFMD) ist eine Krankheit, die am häufigsten durch das Coxsackievirus A16 (CVA16) und das Enterovirus 71 (EV71) bei Kleinkindern verursacht wird. Kürzlich gab es im gesamten asiatisch-pazifischen Raum einen deutlichen Anstieg der CVA16-induzierten HFMD. Während die Symptome leicht sein können, können schwere Komplikationen auftreten, die das Gehirn und das Herz betreffen, mit potenzieller Todesfall1,2. Derzeit gibt es keine zugelassenen antiviralen Therapien oder Impfungen für CVA16, und daher besteht die dringende Notwendigkeit, antivirale Strategien zu entwickeln, um zukünftige Ausbrüche und die damit verbundenen Komplikationen einzudämmen.
CVA16 ist ein nicht umhülltes Virus, das ein ikosaedrales Kapsid aus Pentamern hat, die jeweils 4 strukturelle Proteine enthalten: VP1, VP2, VP3 und VP4. Umgibt jede fünffache Achse in den Pentamer ist eine "Canyon"-Region, die als Depression zeigt und für ihre Rolle in der Rezeptorbindung3bekannt ist. Am Boden dieser Schlucht liegt eine hydrophobe Tasche in der VP1-Region, die einen natürlichen Fettligand namens Sphingosin (SPH) enthält. Zelluläre Rezeptoren, wie z. B. humanes P-Selgin-Glykoprotein-Ligand 1 (PSGL-1) und Scavenger-Rezeptor-Klasse B-Mitglied 2 (SCARB2), wurden vorgeschlagen, eine Rolle bei der viralen Bindung zu spielen, indem dieser Liganden verdrängt wird, was zu Konformationsänderungen am Kapsid und anschließender Auswurf des viralen Genoms in die Wirtszelle4,5,6. Die Identifizierung möglicher Inhibitoren, die die aufeinanderfolgenden Ereignisse im viralen Eintrittsprozess blockieren, könnte potenzielle therapeutische Strategien gegen eine CVA16-Infektion liefern.
Die Schritte im Viruslebenszyklus können durch experimentelle Ansätze als Ziele zur Identifizierung modusspezifischer antiviraler Wirkstoffe seziert werden. Eine Analyse der Zeit-der-Arzneimittel-Addition untersucht die Arzneimittelbehandlungswirkung zu verschiedenen Zeiten während der Virusinfektion, einschließlich Pre-Entry (vor der Virusinfektion hinzugefügt), Eintrag (gleichzeitig zur Virusinfektion hinzugefügt) und Post-Entry (hinzugefügt nach dem Virusinfektion)7. Die Auswirkungen können mit einem Standard-Plaque-Assay bewertet werden, indem die Anzahl der viralen Plaques quantifiziert wird, die in jeder der Behandlungsbedingungen gebildet werden. Der Strömungszytometrie-basierte virale Bindungstest bestimmt, ob das Medikament die virale Bindung an Wirtszellen verhindert. Dies wird erreicht, indem die Temperatur von 37 °C, bei der die Meisten Infektionen mit menschlichen Viren auftreten, auf 4 °C verschoben wird, wo die Virionen in der Lage sind, sich an die Oberfläche der Wirtszelle zu binden, aber nicht in die Zellen7gelangen können. Die zellmembrangebundenen Viruspartikel werden dann durch Immunfärbung gegen virale Antigene quantifiziert und durch Durchflusszytometrie bewertet. Der virale Inaktivierungstest hingegen hilft, mögliche physikalische Wechselwirkungen des Arzneimittels mit freien Viruspartikeln zu bewerten, entweder die Virionen abzuschirmen oder zu neutralisieren oder Aggregationen oder Konformationsänderungen zu verursachen, die sie für nachfolgende Wechselwirkungen mit der Wirtszelloberfläche während der Infektion8,9. In diesem Experiment darf das virale Inokulum zuerst mit dem Medikament inkubieren, bevor es verdünnt wird, um das Medikament vor der Infektion der Wirtszellmonolayer zu titrieren und einen Standard-Plaque-Assaydurchzuführen 8. Schließlich ist das molekulare Andocken ein leistungsfähiges Werkzeug, um potenzielle Wechselwirkungsstellen für Arzneimittel auf der Virionenoberfläche vorherzusagen, einschließlich der viralen Glykoproteine von umhüllten Viren und der viralen Kapsidproteine von nicht umhüllten Viren, indem computergestützte Algorithmen. Dies hilft, mechanistisch Ziele der Wirkungsweise des Medikaments zu lokalisieren und nützliche Informationen zu liefern, die durch nachgelagerte Assays weiter validiert werden können.
Wir haben vor kurzem die oben beschriebenen Methoden verwendet, um antivirale Verbindungen zu identifizieren, die eine Infektion durch das nicht umhüllte CVA169effizient blockierten. Hierin werden die verwendeten detaillierten Protokolle beschrieben und diskutiert.

<table><tbody><tr><td>4% Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>AL-158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488-konjugiertes Anti-Maus-IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>GIBCO</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>Anti-VP1 Antikörper</td><td>Merck-Millipore</td><td>MAB979</td><td>Anti-Enterovirus 71 Antikörper, kreuzreagiert mit Coxsackie A16, Klon 422-8D-4C-4D</td></tr><tr><td>Beckman Coulter Zytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>FC500</td><td></td></tr><tr><td>Corina</td><td>Molecular Networks GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kristallviolett</td><td>Sigma</td><td>C3886-100G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>11995-040</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heparin-Natriumsalz</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>In-vitro-Toxikologie-Assay-Kit, XTT-basiertes</td><td>Sigma</td><td>TOX2-Methylcellulose</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>M0512-100G</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7,4</td><td>GIBCO</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>GIBCO</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>PyMol</td><td>Schr&ouml; dinger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UCSF Chimera</td><td>Universität von Kalifornien, San Francisco</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

verwendung von viral entry assays und molekulardocking-analysen zur identifizierung antiviraler kandidaten gegen coxsackievirus a16

Use of Viral Entry Assays and Molecular Docking Analysis for the Identification of Antiviral Candidates against Coxsackievirus A16

Antivirale Assays, die den viralen Eintrag mechanistisch untersuchen, sind relevant, um zu erkennen, in welchem Schritt die bewerteten Wirkstoffe am effektivsten sind, und die Identifizierung von Kandidaten-Virus-Eintrittshemmern zu ermöglichen. Hier stellen wir die experimentellen Ansätze zur Identifizierung kleiner Moleküle vor, die eine Infektion durch das nicht umhüllte Coxsackievirus A16 (CVA16) blockieren können, indem sie auf die Viruspartikel oder bestimmte Schritte bei der frühen viralen Eintierung abzielen. Assays umfassen die Analyse der Zeit-der-Arzneimittel-Addition, Flusszytometrie-basierte virale Bindung Assay, und virale Inaktivierung Assay. Wir präsentieren auch ein molekulares Docking-Protokoll, das Virus-Capsid-Proteine verwendet, um potenzielle Rückstände vorherzusagen, die von den antiviralen Verbindungen angegriffen werden. Diese Assays sollten bei der Identifizierung von antiviralen Wirkstoffen helfen, die auf den viralen Eintrag wirken. Zukünftige Richtungen können diese möglichen Inhibitoren für die weitere Arzneimittelentwicklung erforschen.

Der Time-of-Drug-Additionstest ist in Abbildung 1 dargestellt und zeigt den Einfluss der Behandlung mit den kleinen Molekülen CHLA und PUG auf die CVA16-Infektion entweder vorviral (Vorbehandlung), während des viralen Eintrags (Koaddition) oder des postviralen Eintrags ( nach der Infektion). Beide kleinen Moleküle erzeugten nur marginale Auswirkungen auf die CVA16-Infektion, sei es bei der Vorbehandlung der Wirtszellen vor einer Virusinfektion (<strong class=...

Das Ziel des Protokolls ist es, die verschiedenen Assays im Zusammenhang mit viralen Eintritte zu veranschaulichen, die verwendet werden können, um Kandidaten-Virus-Eintrittshemmer zu identifizieren.

Verwendung von Viral Entry Assays und Molekulardocking-Analysen zur Identifizierung antiviraler Kandidaten gegen Coxsackievirus A16

Antiviral assays that mechanistically examine viral entry are pertinent to discern at which step the evaluated agents are most effective, and allow for ...

Dieses Protokoll kann bei der Entdeckung potenzieller antiviraler kleiner Moleküle durch einen mechanismusgesteuerten Ansatz helfen. Der Zeitpunkt des Additionsassays bestimmt, in welchem Schritt der Infektion das kleine Molekül seine antivirale Aktivität aufweist. Das molekulare Andocken sagt die Wechselwirkung zwischen dem kleinen Molekül und den viralen Proteinen voraus.Um den Einfluss von Medikamenten auf Wirtszellen vor der Virusinfektion zu bewerten, säen RD-Zellen in 12-Well-Platten mit einem zweifachen 10 bis die fünften Zellen pro Bohrdichtedichte. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator über Nacht. Am nächsten Morgen behandeln Sie jeden Brunnen der RD-Monoschicht mit einer Testverbindung von Interesse, in Dreifacharbeit, in ungiftigen Konzentrationen in einem Milliliter Basalmedium für ein oder vier Stunden.Am Ende der Behandlungsinkubation die Zellen mit einem Milliliter PBS waschen, bevor Sie 50 plaquebildende Viruseinheiten in 300 Mikroliter Basalmedium pro Brunnen für eine Stunde hinzufügen, wobei alle 15 Minuten geschaukelt wird. Am Ende der Infektionsinkubation die Zellen mit PBS waschen und die Zellen mit einem Milliliter frischem Basalmedium mit 0,8% Methylcellulose überlagern. Nach 72 Stunden im Zellkultur-Inkubator jeden Brunnen mit zwei Millilitern PBS waschen und die Zellen mit 0,5 Millilitern 37%Formaldehyd pro Brunnen für 15 Minuten fixieren.Am Ende der Fixierung die Brunnen mit PBS waschen und die Zellen mit 0,5 Millilitern 0,5% kristallvioletter Lösung pro Brunnen färben. Nach zwei Minuten die Brunnen mit einem sanften Wasserstrom waschen und die Platte trocknen lassen. Legen Sie dann die Platte auf eine weiße Leuchte zum Zählen und berechnen Sie den Prozentsatz der Coxsackievirus infizierten Zellen nach der Formel.Für die molekulare Docking-Analyse laden Sie 3D-Moleküle der Testverbindungen von PubChem herunter. Wenn ein Molekül keine 3D-Struktur hochgeladen hat, laden Sie die 2D-Struktur herunter oder verwenden Sie die SMILE-Stringsequenz, um die Struktur über ein entsprechendes molekulares Programm in ein 3D-Molekül umzuwandeln. Laden Sie als Nächstes eine virale biologische Montageeinheit von RCSB Protein Data Bank herunter.Löschen Sie die Lösungsmittel mit Hilfe eines geeigneten Bio-Computing-Programms aus der Protein Data Bank-Datei, ersetzen Sie die unvollständigen Seitenketten durch Daten aus der Dunbrack 2010 Rotamer-Bibliothek und fügen Sie der Struktur Wasserstoffe und Ladungen hinzu, wie zuvor berichtet. Um die Testverbindungen an die vorbereitete Viruseinheit anzudocken, laden Sie die Test-Compound-Datei als Liganden in die University of California San Francisco Chimera hoch und wählen Sie das gesamte vorbereitete virale Protein als Rezeptor für blindes Andocken aus. Beschränken Sie die Andockstelle für zusätzliches Andocken auf das virale Protein auf Regionen von Interesse, die aus den Blinddocking-Ergebnissen abgeleitet sind, indem Sie das Suchvolumen weiter reduzieren.Laden Sie dann die Docking-Datei in ein entsprechendes molekulares Grafiksystem hoch, um die Bindungsmoduspositionen zu analysieren. Wählen Sie den Liganden aus, um polare Kontakte von der Verbindung zum viralen Protein zu finden, und identifizieren Sie die polaren Kontakte mit der Option zu beliebigen Atomen. Beide kleinen Moleküle, die in diesem repräsentativen Experiment getestet wurden, erzeugten nur einen marginalen Einfluss auf die Infektiosität des Coxsackievirus A16, sei es bei der Vorbehandlung der Wirtszellen vor einer Virusinfektion oder bei der Nachinfektionstherapie.Im Gegensatz dazu haben die Moleküle die Infektion bei der Co-Additionsbehandlung effizient um mehr als 80 % aufgehoben, was darauf hindeutet, dass die beiden Verbindungen am effektivsten sind, wenn sie während der Infektion gleichzeitig mit den Viruspartikeln auf der Wirtszelloberfläche vorhanden sind. Die auf Flow-Zytometrie basierende Bindungsanalyse bestätigt, dass die beiden Tannine den Ausbruch der Coxsackievirus-A16-Infektion verhinderten, indem sie eine virale Partikelbindung an die Wirtszellen verhinderten. Das molekulare Andocken der Tannine deutet darauf hin, dass beide im Canyon-Bereich des Coxsackievirus-Pentamers, direkt über dem Tascheneingang, der den Taschenfaktor hält und eine wichtige Rolle bei der Vermittlung der Coxsackievirusbindung und dem Eindringen in die Wirtszelle spielt, vorhergesagt werden.In diesen Oberflächenprojektionen können die einzigartigen Rückstände beobachtet werden, die von den polaren Kontakten der kleinen Moleküle um den Tascheneingang vorhergesagt werden, mit Asparagin-85, Lysin-257 und Asparagin-417 gemeinsam zwischen den beiden Tanninen. Beim molekularen Andocken muss bei der Rangfolge der Bindungsrahmen die Topologie des viralen Proteins berücksichtigt werden. Weitere Experimente könnten die Prüfung der antiviralen Aktivität der Verbindung auf rekombinante Viren umfassen, wobei Mutationen an den Aminosäuren entdeckt wurden, um ihre Bedeutung für die Wirksamkeit des Arzneimittels zu bestätigen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

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Verwendung von Viral Entry Assays und Molekulardocking-Analysen zur Identifizierung antiviraler Kandidaten gegen Coxsackievirus A16 (Video) | JoVE Journal

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