Verwendung von Viral Entry Assays und Molekulardocking-Analysen zur Identifizierung antiviraler Kandidaten gegen Coxsackievirus A16

Dieses Protokoll kann bei der Entdeckung potenzieller antiviraler kleiner Moleküle durch einen mechanismusgesteuerten Ansatz helfen. Der Zeitpunkt des Additionsassays bestimmt, in welchem Schritt der Infektion das kleine Molekül seine antivirale Aktivität aufweist. Das molekulare Andocken sagt die Wechselwirkung zwischen dem kleinen Molekül und den viralen Proteinen voraus.

Um den Einfluss von Medikamenten auf Wirtszellen vor der Virusinfektion zu bewerten, säen RD-Zellen in 12-Well-Platten mit einem zweifachen 10 bis die fünften Zellen pro Bohrdichtedichte. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator über Nacht. Am nächsten Morgen behandeln Sie jeden Brunnen der RD-Monoschicht mit einer Testverbindung von Interesse, in Dreifacharbeit, in ungiftigen Konzentrationen in einem Milliliter Basalmedium für ein oder vier Stunden.

Am Ende der Behandlungsinkubation die Zellen mit einem Milliliter PBS waschen, bevor Sie 50 plaquebildende Viruseinheiten in 300 Mikroliter Basalmedium pro Brunnen für eine Stunde hinzufügen, wobei alle 15 Minuten geschaukelt wird. Am Ende der Infektionsinkubation die Zellen mit PBS waschen und die Zellen mit einem Milliliter frischem Basalmedium mit 0,8% Methylcellulose überlagern. Nach 72 Stunden im Zellkultur-Inkubator jeden Brunnen mit zwei Millilitern PBS waschen und die Zellen mit 0,5 Millilitern 37%Formaldehyd pro Brunnen für 15 Minuten fixieren.

Am Ende der Fixierung die Brunnen mit PBS waschen und die Zellen mit 0,5 Millilitern 0,5% kristallvioletter Lösung pro Brunnen färben. Nach zwei Minuten die Brunnen mit einem sanften Wasserstrom waschen und die Platte trocknen lassen. Legen Sie dann die Platte auf eine weiße Leuchte zum Zählen und berechnen Sie den Prozentsatz der Coxsackievirus infizierten Zellen nach der Formel.

Für die molekulare Docking-Analyse laden Sie 3D-Moleküle der Testverbindungen von PubChem herunter. Wenn ein Molekül keine 3D-Struktur hochgeladen hat, laden Sie die 2D-Struktur herunter oder verwenden Sie die SMILE-Stringsequenz, um die Struktur über ein entsprechendes molekulares Programm in ein 3D-Molekül umzuwandeln. Laden Sie als Nächstes eine virale biologische Montageeinheit von RCSB Protein Data Bank herunter.

Löschen Sie die Lösungsmittel mit Hilfe eines geeigneten Bio-Computing-Programms aus der Protein Data Bank-Datei, ersetzen Sie die unvollständigen Seitenketten durch Daten aus der Dunbrack 2010 Rotamer-Bibliothek und fügen Sie der Struktur Wasserstoffe und Ladungen hinzu, wie zuvor berichtet. Um die Testverbindungen an die vorbereitete Viruseinheit anzudocken, laden Sie die Test-Compound-Datei als Liganden in die University of California San Francisco Chimera hoch und wählen Sie das gesamte vorbereitete virale Protein als Rezeptor für blindes Andocken aus. Beschränken Sie die Andockstelle für zusätzliches Andocken auf das virale Protein auf Regionen von Interesse, die aus den Blinddocking-Ergebnissen abgeleitet sind, indem Sie das Suchvolumen weiter reduzieren.

Laden Sie dann die Docking-Datei in ein entsprechendes molekulares Grafiksystem hoch, um die Bindungsmoduspositionen zu analysieren. Wählen Sie den Liganden aus, um polare Kontakte von der Verbindung zum viralen Protein zu finden, und identifizieren Sie die polaren Kontakte mit der Option zu beliebigen Atomen. Beide kleinen Moleküle, die in diesem repräsentativen Experiment getestet wurden, erzeugten nur einen marginalen Einfluss auf die Infektiosität des Coxsackievirus A16, sei es bei der Vorbehandlung der Wirtszellen vor einer Virusinfektion oder bei der Nachinfektionstherapie.

Im Gegensatz dazu haben die Moleküle die Infektion bei der Co-Additionsbehandlung effizient um mehr als 80 % aufgehoben, was darauf hindeutet, dass die beiden Verbindungen am effektivsten sind, wenn sie während der Infektion gleichzeitig mit den Viruspartikeln auf der Wirtszelloberfläche vorhanden sind. Die auf Flow-Zytometrie basierende Bindungsanalyse bestätigt, dass die beiden Tannine den Ausbruch der Coxsackievirus-A16-Infektion verhinderten, indem sie eine virale Partikelbindung an die Wirtszellen verhinderten. Das molekulare Andocken der Tannine deutet darauf hin, dass beide im Canyon-Bereich des Coxsackievirus-Pentamers, direkt über dem Tascheneingang, der den Taschenfaktor hält und eine wichtige Rolle bei der Vermittlung der Coxsackievirusbindung und dem Eindringen in die Wirtszelle spielt, vorhergesagt werden.

In diesen Oberflächenprojektionen können die einzigartigen Rückstände beobachtet werden, die von den polaren Kontakten der kleinen Moleküle um den Tascheneingang vorhergesagt werden, mit Asparagin-85, Lysin-257 und Asparagin-417 gemeinsam zwischen den beiden Tanninen. Beim molekularen Andocken muss bei der Rangfolge der Bindungsrahmen die Topologie des viralen Proteins berücksichtigt werden. Weitere Experimente könnten die Prüfung der antiviralen Aktivität der Verbindung auf rekombinante Viren umfassen, wobei Mutationen an den Aminosäuren entdeckt wurden, um ihre Bedeutung für die Wirksamkeit des Arzneimittels zu bestätigen.