Beurteilung der Wirksamkeit einer antiviralen Testsubstanz durch einen Virusinaktivierungsassay

Nehmen Sie Röhrchen mit einem rekombinanten Hepatitis-C-Virus oder einer HCV-Suspension, die RNA enthält, die für einen sezernierten Luciferase-Reporter kodiert.

Geben Sie eine antivirale Testverbindung und ein Lösungsmittel in die Test- und Negativkontrollröhrchen.

Die Testverbindungen binden an HCV-Glykoproteine und inaktivieren das Virus.

Verdünnen Sie die Mischungen nach der Inkubation, um Wechselwirkungen zwischen Verbindungen und Zellen in den nachfolgenden Schritten zu verhindern.

Geben Sie diese verdünnten Mischungen auf HCV-Replikations-unterstützende Hepatom-Monoschichten. Ausbrüten.

Das compound-inaktivierte HCV kann nicht an spezifische Zelloberflächenrezeptoren binden, während aktive HCV-Glykoproteine an diese Rezeptoren binden und so die zelluläre Bindung erleichtern.

Nicht adsorbierte HCVs entfernen. Mit Puffer waschen und Medien hinzufügen. Inkubieren Sie über einen längeren Zeitraum.

Das gebundene HCV wird internalisiert, setzt virale RNA frei und führt zur Synthese viraler Proteine und Luciferase, die von der Zelle sezerniert werden.

Sammeln Sie die Luciferase-haltigen Kulturüberstände. Zentrifugieren Sie und geben Sie ein Luziferase-Substrat zu den Überständen.

Luciferase oxidiert das Substrat und emittiert Licht.

Eine höhere Lumineszenz in der Kontrollvertiefung als im Test deutet auf eine virale Inaktivierung durch die Verbindung hin.

Um mit dem Virusinaktivierungsassay zu beginnen, wird zunächst 1 mal 10 bis zu den vierten Zellen pro Vertiefung in einer 96-Well-Platte abgefüllt. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid über Nacht zur Anhaftung. Bereiten Sie für die Infektion Gaussia-Luciferase-Reporter-markierte Hepatitis-C-Virus- oder HCV-Partikel vor, wie im Textprotokoll angegeben.

Mischen Sie in einem sterilen Röhrchen 100 Mikroliter 100 mikromolare CHLA oder PUG mit 100 Mikrolitern von 10 zu den vierten fokusbildenden Einheiten oder FFU von HCV. Für eine Positivkontrolle mischen Sie HCV mit Heparin in einer Endkonzentration von 1.000 Mikrogramm pro Milliliter. Drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Nach drei Stunden verdünnen Sie das Virusmischungsgemisch 50-fach mit 9,8 Millilitern Basalmedium bei Raumtemperatur. Bereiten Sie dann eine neue Virusverbindungsmischung vor und verdünnen Sie diese Mischung sofort in Basalmedium für die Null-Stunden-Inkubationsprobe. Nach der Entnahme des Inkubationsmediums aus den Zellen werden 100 Mikroliter der verdünnten Virus-Wirkstofflösung pro Vertiefung in dreifacher Ausfertigung zugegeben.

Die Lösung enthält nun 10 bis zur zweiten FFU pro Well. Inkubieren Sie drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, um eine Virusinfektion der Zellen zu ermöglichen. Entfernen Sie nach der Inkubation die Virussuspension aus den Vertiefungen und waschen Sie die Zellen zweimal vorsichtig mit 200 Mikrolitern PBS.

Inkubieren Sie die Zellen 72 Stunden lang in 100 Mikrolitern Basalmedium für die virale Replikation und die Freisetzung des Luciferase-Reporters in den Überstand. Sammeln Sie dann die Überstände aus den Kulturen in Mikroröhrchen und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 4 Grad Celsius bei 17.000 g g, um Zelltrümmer zu entfernen. Mischen Sie 20 Mikroliter jedes Überstands mit 50 Mikrolitern Gaussia-Luciferase-Assay-Reagenz und messen Sie die Lumineszenz der Luciferase-Reporteraktivität in einem Luminometer.