TALEN-vermittelte gezielte Genintegration: Verwendung von sequenzspezifischen Nukleasen für die präzise Insertion von fluoreszierenden Proteingen in hiPSCs

Beginnen Sie mit der humanen induzierten pluripotenten Stammzell- oder hiPSC-Suspension in Medien. Fügen Sie ein Paar Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektornuklease oder TALEN-kodierende Plasmide hinzu. Ergänzen Sie mit einem Donorplasmid, das ein fluoreszierendes Proteingen trägt, gekoppelt an ein Antibiotikaresistenzgen, mit angrenzenden Homologiearmen für die spezifische Ausrichtung auf Zielloci.

Elektropopolieren Sie das Gemisch, um transiente Poren in den Zellmembranen zu erzeugen, die die Plasmidinternalisierung ermöglichen. Sobald sie sich in den Zellen befinden, werden die TALEN-kodierenden Plasmide verarbeitet und produzieren TALENs - chimäre Proteine, die aus einer ortsspezifischen TALE-DNA-Bindungsdomäne bestehen, die mit einer unspezifischen FokI-Restriktions-Endonuklease-Spaltdomäne fusioniert ist.

Jedes TALEN-Monomer erkennt und bindet über seine DNA-Bindungsdomäne - bestehend aus Tandem-Aminosäure-Repeat-Modulen - Ziel-Loci, ein Modul pro Nukleotid, auf jedem DNA-Strang in entgegengesetzten Orientierungen, getrennt durch eine Spacer-Sequenz. FokI-Domänen dimerisieren und spalten dann DNA innerhalb der Spacersequenz, wodurch Doppelstrangbrüche mit Überhängen entstehen.

In Gegenwart von Spenderplasmiden, die Homologiearme enthalten, die zu Regionen komplementär sind, die die gespaltene Stelle flankieren, erfolgt eine homologiegerichtete Reparatur unter Verwendung der homologen Sequenz als Matrize für die DNA-Reparatursynthese, um die Doppelstrangbrüche zu überbrücken. Nach der Ligation der Kerben werden das dazwischenliegende fluoreszierende Protein und die Antibiotikaresistenzgene in das Wirtsgenom integriert.

Behandeln Sie die hiPSCs, die zur Unterstützung des Wachstums auf einer Feeder-Zellschicht ausgesät werden, mit antibiotikahaltigen Medien. Das promotorlose Antibiotikaresistenzgen - angetrieben von einem stromaufwärts gelegenen endogenen Promotor - erleichtert die Selektion von TALEN-editierten Zellen.

Beginnen Sie damit, die iPSC-Kulturen jeweils einmal mit PBS zu waschen, geben Sie dann 1 Milliliter 37 Grad Celsius sanftes Zelldissoziationsreagenz in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für etwa 5 Minuten. Wenn mehr als 50 % der Zellen vom Kulturgefäß dissoziiert sind, verwenden Sie eine P1000-Pipette, um verbleibende Zellklumpen oder anhaftende Zellen mechanisch aufzubrechen. Geben Sie dann 2 Milliliter E8-Medium in jede Vertiefung und verwenden Sie eine 10-Milliliter-Pipette, um die Kulturen weiter in Einzelzellsuspensionen zu zerlegen.

Gießen Sie nun die geernteten Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und schleudern Sie sie herunter. Resuspendieren Sie das Pellet in einer minimalen Menge E8-Medium zum Zählen. Nachdem die Lebensfähigkeit der Kulturen durch Trypanblau-Ausschluss sowie ihre ausreichende Dissoziation bestätigt wurden, werden 3 Millionen Zellen in jeweils zwei konische 15-Milliliter-Röhrchen überführt.

Während die Zellen zentrifugieren, stellen Sie das Elektroporationssystem auf das zelltypspezifische Programm für die humane embryonale Stammzelllinie H9 ein. Fügen Sie dann 10 Mikrogramm des homologen Rekombinationsspenders allein zu 1 Pellet für die Kontrollprobe und 10 Mikrogramm des homologen Rekombinationsspenderplasmids zusammen mit 5 Mikrogramm jedes TALEN-Plasmids für die Versuchsprobe hinzu.

Geben Sie als Nächstes 100 Mikroliter vollständige P3-Primärzelltransfektionslösung bei Raumtemperatur zu jedem der Kontroll- und Versuchspellets und resuspendieren Sie die Zellen. Übertragen Sie die Proben in einzelne Küvetten und elektropolieren Sie die Proben. Unmittelbar nach der Transfektion geben Sie 500 Mikroliter E8-Medium bei Raumtemperatur in jede Küvette und überführen Sie dann die transezierten iPSC-Proben tropfenweise in einzelne 10-Zentimeter-Schalen mit embryonalen DR4-Mausfibroblasten.