Fäkale (Mikro-) RNA-Isolierung

Wir stellen ein Protokoll zur Isolierung von RNA aus Stuhlproben vor, um microRNAs zu untersuchen. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um RNA aus Fäkalien mit hoher Qualität und Quantität zu isolieren. Es minimiert RNAs von lebenden Mikroben.

Es ist wichtig zu betonen, dass der Bindungspuffer in diesem Protokoll nicht verwendet wird. Dieses Protokoll ist einfach und unkompliziert. Beginnen Sie mit der Resuspendierung von 25 bis 100 Milligramm Stuhlproben in 600 Mikrolitern sterilem 1X DPBS in einem Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Das Röhrchen mit der Probe wird 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Dann die Mischung mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze zerdrücken und gut aufwirbeln. Resuspendieren Sie die Mischung in einem Homogenisator mit einer Einstellung für einen Zyklus bei 4.000 Umdrehungen pro Minute für 45 Sekunden, um die Menge und Qualität der RNA zu optimieren und zu erhöhen.

Geben Sie 600 Mikroliter saure Phenolchloroformlösung in die Probe und wirbeln Sie die Mischung 60 Sekunden lang. Um eine erhöhte Menge an RNA in der Ausbeute zu optimieren, können Sie sie alternativ mit einem Homogenisator mischen. Die Probe wird 15 Minuten lang bei 10.000 x g bei Raumtemperatur zentrifugiert, um die wässrige und die organische Phase zu trennen.

Wiederholen Sie die Zentrifugation, bis die Grenzfläche kompakt ist. Die obere wässrige Phase vorsichtig und ohne Störung der unteren Phase in ein neues Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit Scharnierkappe zu überführen. 100%iges Ethanol der Sorte ACS mit dem 1,25-fachen des Volumens der erworbenen wässrigen Phase zugeben und drei Sekunden lang vortexen.

Setzen Sie die Filterpatrone in die Auffangröhrchen ein. Laden Sie 600 Mikroliter jeder Probe in die Filterpatrone, die im microRNA-Isolationskit enthalten ist. Zentrifugieren Sie 90 Sekunden lang bei 10.000 x g, um das Gemisch durch die Kartusche zu filtrieren.

Entsorgen Sie dann das Filtrat. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis das gesamte Volumen der Mischung in aufeinanderfolgenden Anwendungen durch dieselbe Filtermembran filtriert ist. Nachdem alle Proben gefiltert wurden, ist die Probe gefiltert.

Geben Sie 700 Mikroliter microRNA Waschlösung 1 in dieselbe Filterpatrone. Zentrifugieren Sie 60 Sekunden lang, um die Waschlösung durch die Filterpatrone zu filtrieren. Entsorgen Sie das Filtrat und setzen Sie die Filterpatrone auf das gleiche Auffangrohr

Waschen Sie die Filterpatrone mit 700 Mikrolitern Waschlösung 2/3, die in 100%igem Ethanol der ACS-Klasse hergestellt ist, und zentrifugieren Sie sie eine Minute lang bei 10.000 x g. Entsorgen Sie das erhaltene Filtrat und setzen Sie die Filterpatrone in das gleiche Rohr ein. Waschen Sie die Filterpatrone mit 500 Mikrolitern Waschlösung 2/3 und zentrifugieren Sie sie eine Minute lang bei 10.000 x g.

Entsorgen Sie das erhaltene Filtrat und setzen Sie die Filterpatrone in das gleiche Auffangröhrchen ein. Waschen Sie die Filterpatrone mit 250 Mikrolitern Waschlösung 2/3, die in 100%igem Ethanol der ACS-Klasse hergestellt ist, und zentrifugieren Sie eine Minute lang bei 10.000 x g. Entsorgen Sie das erhaltene Filtrat und setzen Sie die Filterpatrone in das gleiche Auffangröhrchen ein.

Füllen Sie abschließend die Filterpatrone in ein neues Auffangrohr und drehen Sie die Baugruppe fünf Minuten lang, um die Restflüssigkeit zu entfernen. Füllen Sie die Filterpatrone in ein neues Sammelröhrchen ein, geben Sie dann 50 Mikroliter nukleasefreies Wasser in die Mitte des Filters und verschließen Sie das Röhrchen. Inkubieren Sie das Röhrchen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Drehen Sie dann das Röhrchen fünf Minuten lang bei 8.000 x g, um die RNA in ein neues Sammelröhrchen zu gewinnen. Ein chipbasierter Elektrophorese-Assay von RNA deutet darauf hin, dass repräsentative RNA-Isolate aus Maus- und Menschenkot eine geringe oder gar keine 18S- und 28S-rRNA-Zusammensetzung aufweisen und die Größe der RNA-Isolate in den kleinen RNA-Bereich fällt. Eine weitere kleine RNA-Elektrophorese mit der chipbasierten Elektrophorese zeigte, dass ein großer Teil der RNAs microRNA-Größe hat.

Die Reinheit der extrahierten RNA war hoch, was durch das Absorptionsverhältnis von 2,0 für 260 und 280 Nanometer Wellenlängen und 1,8 für die Extinktion bei 260 und 230 Nanometern angezeigt wird. Um den Erfolg der organischen Extraktion zu gewährleisten, stellen Sie sicher, dass die Flächen sichtbar sind und übertragen Sie nur die obere wässrige Phase, ohne die untere Phase zu stören, auch auf Kosten eines reduzierten Volumens unserer wässrigen Phase.