Multi-Timescale-Mikroskopie-Methoden zur Charakterisierung fluoreszenzmarkierter Mikroblasen für die ultraschallgesteuerte Wirkstofffreisetzung

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Reaktion von fluoreszierend markierten Mikrobläschen zu charakterisieren, die für ultraschallgesteuerte Arzneimittelabgabeanwendungen entwickelt wurden, einschließlich der Aktivierungsmechanismen und Bioeffekte. Der Schlüssel liegt in der Kombination von bildgebenden Verfahren, die es uns ermöglicht, das Multiskalenproblem der ultraschallgesteuerten Medikamentenabgabe mit Blasen sowohl auf verschiedenen räumlichen Skalen als auch auf verschiedenen Zeitskalen zu entwirren. Für die Einzelblasenbildgebung durch Hellfeldmikroskopie legen Sie eine 19-Gauge-Entlüftungsnadel und verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 19-Gauge-Nadel ausgestattet ist, um eine kleine Menge der Mikroblasensuspension aus der Glasfläschchen in ein kleines Röhrchen zu entfernen, um das Pipettieren im nächsten Schritt zu erleichtern.

Verdünnen Sie die Mikrobläschenlösung mit einer Pipette in gefilterter phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Verwenden Sie eine 10-Milliliter-Spritze, um die Probe in einen Auslass des Probenhalters zu injizieren, bis der Halter voll ist, ohne Luftblasen zu erzeugen, und spritzen Sie bei Bedarf mehr von der Probe. Schließen Sie beide Ventile des Probenhalters und platzieren Sie den Probenhalter senkrecht zur optischen Achse des Mikroskops.

Stellen Sie vor der Probenanalyse die gewünschte Ultraschall-Fahrfrequenz und den akustischen Druck auf den Arbiträrwellenformgenerator ein und beginnen Sie mit dem Sichtfeld in einer Ecke des Probenhalters, verwenden Sie die XYZ-Stufe, um den Halter zu bewegen, um einzelne Mikroblasen im Sichtfeld des Mikroskops zu lokalisieren, befestigen Sie dann eine optische Faser, die mit einem Wasserbad verbunden ist, an ein Stroboskoplicht und starten Sie die Aufzeichnung. Wiederholen Sie die Bildgebung so oft wie gewünscht pro Ultraschalleinstellung und bewegen Sie den Probenhalter mindestens zwei Millimeter in ein Sichtfeld, das für jede Analyse unspezifische Mikrobläschen enthält. Für die fluoreszenzmikroskopische Bildgebung der Mikrobläschen stellen Sie nach dem Verdünnen der Mikrobläschenlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung wie demonstriert die gewünschte Ultraschall-Fahrfrequenz und den akustischen Druck auf den beliebigen Wellenformgenerator ein und stellen Sie die Triggerverzögerung für den Laser auf den Pulsverzögerungsgenerator für die Fluoreszenzanregung der Nanopartikel aus den Mikroblasen ein, verwenden Sie dann die XYZ-Stufe, um den Probenhalter zu bewegen, um einzelne Mikrobläschen zu lokalisieren und sie in den Fokus der das Ziel, dann lösen Sie die Aufnahme aus.

Wiederholen Sie die Bildgebung wie gewünscht, indem Sie die Ultraschalleinstellungen ändern und den Probenhalter wie gezeigt in das neue Sichtfeld verschieben. Für die Intravitalmikroskopie positionieren Sie zunächst einen beheizten Tierhalter auf der XY-Positionierstufe zwischen dem Wellenleiter und dem Objektiv und fügen dem Wellenleiter ein Kopplungsgel hinzu. Führen Sie einen Schwanzvenenkatheter in die Schwanzvene einer betäubten tumortragenden Maus ein und legen Sie die Maus mit einer Fensterkammer in den beheizten Halter.

Fügen Sie einen Wassertropfen zum Deckglas hinzu. Um das Gefäßsystem des Tumorgewebes sichtbar zu machen, injizieren Sie intravenös 30 Mikroliter à vier Milligramm pro Milliliter fluoreszierend markierte 2 Megadalton-Dextran in den Schwanzvenenkatheter und bewegen die Maus mit dem XY-Translationsstadium, bis ein Sichtfeld mit geeigneten Blutgefäßen lokalisiert werden kann. Passen Sie die Bildrate, das Sichtfeld und die Länge der Aufzeichnung entsprechend den Parametern des Experiments an und zeichnen Sie Basisbilder der Gefäße auf.

Wenn die Baseline-Bilder aufgenommen wurden, stellen Sie die Ultraschall-Fahrfrequenz, die Pulslänge und die akustische Druckamplitude auf den Arbiträrwellenformgenerator ein und injizieren Sie intravenös 50 Mikroliter Mikrobläschenprobe in die Schwanzvene. Stellen Sie sich dann das Gefäßsystem wie demonstriert vor. Die Analyse der Mikroblasen mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie zeigt eine ungleichmäßige Partikelverteilung der Mikroblasenhülle.

Die Gesamtstruktur der Mikrobläschen kann durch Rasterelektronenmikroskopie weiter visualisiert werden. Die Analyse der radialen Dynamik und des phänomenologischen Verhaltens von insonifizierter Mikrobläsche durch Hellfeldmikroskopie ermöglicht die Bewertung der relativen Änderung des Mikroblasenradius im Laufe der Zeit. Hier wird eine Bildsequenz einer typischen erfolgreichen Abgabe von fluoreszenzmarkierten Nanopartikeln gezeigt.

Es kann beobachtet werden, wie die in die Mikrobläschenhülle eingebetteten Nanopartikel fluoreszieren, wenn das Laserlicht die Blase erreicht. Wie bei dieser erfolglosen Abgabe beobachtet, leuchten die fluoreszierenden Nanopartikel jedoch auf die Hülle der Mikrobläsche, die während der Ultraschallexposition intakt bleibt. Die intravitale Multiphotonenbildgebung kann verwendet werden, um die räumliche und zeitliche Extravasation der Nanopartikel während der Ultraschallexposition zu bestimmen, was für das Verständnis und die Optimierung der Mechanismen, die der ultraschallvermittelten Nanopartikelabgabe zugrunde liegen, von Vorteil sein kann.

Mit der perfekten Ausrichtung der optischen und akustischen Bahnen auf allen Längen- und Zeitskalen wird ein umfassender Einblick in die ultraschallgesteuerte Wirkstoffabgabe gegeben. Die Antworten unserer Multiskalenexperimente werden nun in die klinische Praxis übersetzt. Die Ergebnisse werden wertvolle Erkenntnisse für eine Reihe von therapeutischen Anwendungen, einschließlich der Krebstherapie, liefern.