Pyrosequencing: Eine einfache Methode für genaue Genotypisierung

Die genetische Forschung hat stark von der Veröffentlichung der menschlichen Genomsequenz profitiert. Die Pyro-Sequenzierung ist ein einzigartiges System, das die Analyse der genetischen Variation sowie des Allel-Ungleichgewichts der RNA, der DNA, des Methylierungsstatus und der Anzahl der Genkopien ermöglicht. In diesem Video zeigen wir eine grundlegende Pyro-Sequenzierungsreaktion für die genetische Analyse.

Hallo, ich bin Kristy King aus dem Labor von Dr. Charles Eby und Dr. Brian Gage in der Abteilung für Innere Medizin an der Washington University School of Medicine. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Pyro-Sequenzierung. Dieses Verfahren ist nützlich, da es eine der gründlichsten und einfachsten Methoden zur Analyse von SNPs ist.

Die Pyro-Sequenzierung basiert auf der Sequenzierung durch Synthese, wobei die Freisetzung von Pyrophosphat immer dann genutzt wird, wenn ein Nukleotid in einen offenen DNA-Strang mit drei Primzahlen eingebaut wird. Sobald eine Platte geladen ist, werden Nukleotide auf der Grundlage einer von der Software bereitgestellten Sequenz eingebaut. Nach der Freisetzung wird das Pyrophosphat in einer Reaktion verwendet, die zur Freisetzung eines TP führt, das von Lucifere verwendet wird, um Luzifer in Oxy-Luzifer umzuwandeln, was zur Emission von Licht führt. Das einfallende Licht wird von einer CCD-Kamera erfasst und als Peaks, auch Pyros genannt, aufgezeichnet.

Alle Nukleotide, die nicht in den DNA-Strang eingebaut sind, werden durch AP-Pyra abgebaut, um Hintergrundgeräusche zu vermeiden. Dieses Verfahren umfasst die folgenden Schritte. Assay-Design, PCR-Gelelektrophorese für die Qualitätskontrolle und Pyro-Sequenzierung.

Beginnen wir also mit der Pyro-Sequenzierung. Um eine Pyro-Sequenzierung durchführen zu können, muss zunächst ein PCR-Produkt hergestellt werden. Die PCR für die Pyro-Sequenzierung erfordert mehr Zyklen als die meisten PCRs, um sicherzustellen, dass der gesamte Primer in etwa 50 Zyklen verbraucht wird.

Die Pyro-Sequenzierung erfordert außerdem, dass einer der PCR-Primer biotinyliert ist. Zu guter Letzt ist es wichtig zu beachten, dass auch eine innere Grundierung erforderlich ist. Ein effizientes Assay-Design kann mit Software durchgeführt werden, die durch Pyrosequenzierung bereitgestellt wird, um sicherzustellen, dass keine Kontamination vorhanden ist.

Und um zu bestätigen, dass das PCR-Produkt vorhanden ist, sollte ein Gel auf einige Proben sowie eine Negativkontrolle aufgetragen werden. Um die Pyro-Sequenzierungsplatte herzustellen, geben Sie 12 Mikroliter der Pyro-Sequenzierungsprimermischung auf die 96-Well-Pyro-Sequenzierplatte. Dazu wird eine Mischung aus 43,2 Mikrolitern des internen Primers und 1396,8 Mikrolitern eines knienden Puffers benötigt, um die Pyro-Sequenzierplatte mit Klebefolie zu bedecken.

Wenn die Einrichtung länger als 50 Minuten dauern soll, fügen Sie für jede Vertiefung des 96-Well-PCR-Produkts 70 Mikroliter SRO Speed Mix hinzu, der 240 Mikroliter Streptavidin beschichtete Sero Geschwindigkeiten enthält. 4.560 Mikroliter Bindungspuffer, der aus Triss-Natriumchlorid, EDTA und Tween 20 und 3.600 Mikrolitern Wasser besteht, und setzen Sie den Deckel sicher wieder auf. Legen Sie die 96-Well-PCR-Produktplatte mit der Bead-Mischung für fünf Minuten bei Raumtemperatur in einen Plattenschüttler.

Stellen Sie sicher, dass der Deckel gesichert ist, um eine Kreuzkontamination zwischen den Vertiefungen zu vermeiden. Dieser Schritt ermöglicht ein gründliches Knien der Streptokokken ENC, beschichteten Spheroskügelchen auf dem Biotin-Tag, der sich auf dem PCR-Primer befindet. Richten Sie einen Arbeitsplatz für die Vorbereitung der Platten ein.

Dazu gehören die Reagenzentröge, das PCR-Produkt- und Bead-Mix-Tablett sowie das Pyro-Sequenzier-Primer-Tablett. Stellen Sie sicher, dass das PCR-Produkt und die Bead-Mix-Platte sowie die Pyro-Sequenzierungsprimer-Schale richtig ausgerichtet sind, sodass sich die Negative in der gleichen Ausrichtung befinden. Schütteln Sie vor dem Übertragen von Proben das Vakuumwerkzeug, das in sauberem Wasser ausgeschaltet ist, um eventuell darauf befindliche Kügelchen oder Ablagerungen freizusetzen.

Entsorgen Sie das restliche Wasser, füllen Sie den Trog wieder und schalten Sie den Staubsauger ein. Lassen Sie das Staubsaugerwerkzeug in der Wanne, bis das gesamte Wasser entfernt wurde, was ca. 30 Sekunden dauert. Setzen Sie die Filterspitzen des Vakuumwerkzeugs in die Vertiefungen der PCR-Bead-Mix-Platte ein und lassen Sie es so lange stehen, bis die gesamte Flüssigkeit von der Platte entfernt wurde.

Leichtes Schaukeln kann verwendet werden, um Oberflächenspannungen zu vermeiden. Platzieren Sie das Vakuum in der 70%igen Ethanolwanne, wenn die Flüssigkeit durch den Schlauch zu fließen beginnt. Lassen Sie die Filterspitzen das Ethanol fünf Sekunden lang aufsaugen.

Wiederholen Sie den Vorgang für das 0,2-molare Natriumhydroxid, das die DNA zu einer einzelsträngigen PCR denaturiert, und für den Waschpuffer. Zur Reinigung und Neutralisierung des PCR-Produkts. Trennen Sie den Vakuumschlauch vom Vakuumwerkzeug und setzen Sie das Vakuumwerkzeug in die Pyro-Sequenzierplatte ein, die den Pyro-Sequenzierprimer in einer knienden Puffermischung enthält.

Wenn der Vakuumschlauch noch angeschlossen ist, wird die Primermischung durchgesaugt, wenn er in die Pyro-Sequenzierplatte eingelegt wird. Die Tipps, die dazu führen, dass Sie Ihr PCR-Produkt verlieren. Schütteln oder schaukeln Sie vorsichtig die Spitzen des Vakuums in den Vertiefungen der Pyro-Sequenzierplatte, um Ihr PCR-Produkt zu dispergieren.

Nehmen Sie das Vakuumwerkzeug von der Pyro-Sequenzierplatte, sobald das Schütteln oder Schaukeln abgeschlossen ist, schließen Sie das Vakuumwerkzeug wieder an den Schlauch an und legen Sie das Werkzeug in das saubere Wasser, um es für die nächste Platte zu reinigen. Legen Sie die Pyro-Sequenzierplatte für zwei Minuten bei 80 Grad Celsius auf einen Heizblock. Nach zwei Minuten die Platte aus dem Heizblock nehmen und auf eine kühle Oberfläche stellen.

Nach dem Abkühlen kann eine Klebefolie zum Abdecken der Platte verwendet werden, es sei denn, die Platte wird innerhalb von 15 Minuten ausgeführt, um eine Verdunstung zu verhindern. Und jetzt ist es an der Zeit, mit dem Pyro-Sequencing zu beginnen. Der erste Schritt der Pyro-Sequenzierung besteht darin, die Assay-Details in den Computer einzugeben.

Wählen Sie unter Simplex-Eintrag den neuen Eintrag aus und geben Sie die Assay-Informationen ein, einschließlich eines ID-Namens und der zu analysierenden Sequenz, die von der Assay-Design-Software bereitgestellt werden und die Qualitätskontrolle zur Auswahl der Dispensationsreihenfolge ermöglichen, die die Sequenz um den SNP plus Kontrollbasen bereitstellt. Wählen Sie abschließend Histogramme aus, um eine Visualisierung zu erhalten, wie Ihr Pigramm aussehen sollte. Jetzt ist es an der Zeit, in einen Snip-Run einzusteigen.

Geben Sie auf der Registerkarte "Snip-Läufe" und "Allgemein" einen Namen für den Lauf ein und wählen Sie die Geräteparameter für den Lauf aus. Wählen Sie auf der Registerkarte "Setup" den Assay-Eintrag aus und klicken Sie auf die Platte und ziehen Sie sie darüber. Um den Assay Ihrer Wahl in Ihre Platte einzugeben, ist es wichtig zu beachten, dass nicht die gesamte Platte verwendet werden muss, in der Sie verschiedene Wells für die Analyse inaktivieren können, sondern dass viele verschiedene Assays auf derselben Platte ausgeführt werden können.

Klicken Sie auf die Registerkarte Ansicht und wählen Sie dann aus. Laufen. Auf dieser Seite sind die entsprechenden Volumina an Nukleotiden, Enzymen und Substraten aufgeführt, die für den Lauf benötigt werden. Reinigen Sie vor der Verwendung sowohl die Nukleotid- als auch die Kapillar- und Reagenzspitzen.

Füllen Sie die Spitzen mit Wasser und üben Sie Druck auf die Oberseite der Spitze aus, um zu überprüfen, ob die Spitze verstopft ist. Wenn kein Wasser von der Unterseite der Spitze spritzt, entleeren und mehrmals nachfüllen, um zu versuchen, das Wasser durchzudrücken. Oder Sie können die Spitzen beschallen, wenn die Spitze verstopft bleibt.

Verwerfen Sie es und holen Sie sich neue Tipps. Das Enzym und das Substrat sollten vor der Verwendung mit Wasser resuspendiert werden. Wenn es zu geschüttelten Luftblasen kommen könnte, die zu Verstopfungen der Spitze oder einer ungleichmäßigen Abgabe führen, können unbenutzte resuspendierte Enzyme und Substrate bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden.

Für die zukünftige Verwendung von Kapillardosierspitzen in einem Mikrofugenröhrchen wird eine Eins-zu-Eins-Verdünnung mit den Nukleotiden und dem Puffer P acht vorgenommen. Vor Gebrauch gut mischen. Füllen Sie die Nukleotid- und Reagenzspitzen mit den entsprechenden Volumina entsprechend den von der Software empfohlenen Mengen.

Geben Sie die Flüssigkeit vorsichtig an den Seiten der Spitzen ab, um zu verhindern, dass Luftblasen in sie pipettiert werden und Verstopfungen verursachen. Achten Sie darauf, die Nukleotid-Abgabespitzen auf Luftblasen zu überprüfen. Wenn Luftblasen vorhanden sind, klopfen Sie einfach auf die Seiten der Spitzen, bis die Luftblasen an die Oberfläche kommen, oder entfernen Sie sie mit einer sauberen Pipettenspitze.

Führen Sie eine Testplatte aus, nachdem Sie die Kartusche gefüllt haben. Platzieren Sie die Kartusche in das Pyro-Sequenziergerät und die Testplatte in die 96-Well-Plattenplattform. Durch das Platzieren eines Klebefilms über der Platte können das Reagenz und die Nukleotidabgabe leicht sichtbar werden.

Wählen Sie die Registerkarte "Instrument" auf der linken Seite des Bildschirms aus und klicken Sie dann auf "Verwalten". Wählen Sie das Instrument aus dem Dropdown-Menü aus. Klicken Sie auf Test, und eine Warnung wird angezeigt.

Bittet Sie, zu überprüfen, ob die Testplatte in das Gerät eingesetzt wurde. Klicken Sie auf OK. Sobald der Vorgang abgeschlossen ist, entfernen Sie die Testplatte, und in der Mitte der Platte sollten sich über sechs der Vertiefungen flüssige Punkte befinden, die vier Nukleotide, das Enzym und das Substrat darstellen.

Wenn weniger als sechs kleine Punkte vorhanden sind, ist eine Verstopfung aufgetreten und die Spitzen sollten überprüft und von eventuellen Verstopfungen befreit werden. Platzieren Sie die Platte auf der 96-Well-Plattenplattform für die Pyrosequenzierung. Schließen Sie alle Hebel und klicken Sie auf der einzelnen Platte auf Ausführen.

Führen Sie das Enzymsubstrat ein, und die Nukleotide werden in der vorgegebenen Reihenfolge ausgegeben. Sobald der Lauf vom Pyro-Sequenzer analysiert wurde, ist es an der Zeit, den Lauf zu untersuchen. Blaue Vertiefungen repräsentieren einen vorübergehenden Genotyp und Pyro.

Orange Wells erfordern menschliches Eingreifen und können bearbeitet werden, indem Sie auf das gewünschte Well klicken und das vorhergesagte Histogramm öffnen. Ein Genotyp kann bestanden, nicht bestanden oder überprüft werden, und der Genotyp selbst kann entsprechend geändert werden. Sobald ein Bohrloch bearbeitet wurde, wird auf der Plattenkarte ein dunkler Kreis angezeigt.

Negativkontrollen sollten als negativ bewertet werden. Es kann unspezifische Peaks in den negativen Vertiefungen geben, dies wird jedoch typischerweise durch eine Schleife des internen Primers verursacht. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie einen Polymorphismus in der menschlichen Genomik py-sequenzieren können.

Die DNA-Pyro-Sequenzierung ist gegenüber anderen Sequenzierungsverfahren nützlich, da sie an eine Vielzahl von Anwendungen angepasst werden kann. Es ist auch robust genug, um DNA aus jeder Quelle zu verarbeiten, einschließlich niedriger Konzentrationen und abgebauter DNA. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, mit einem guten, sauberen PCR-Produkt zu beginnen.

Fügen Sie für jeden Assay eine Negativkontrolle hinzu und stellen Sie sicher, dass alle Ihre Reagenzien in Ordnung sind. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.