Phänotypisches Profiling von aus menschlichen Stammzellen gewonnenen dopaminergen Neuronen im Mittelhirn
7. Juli 2023
Dieses Protokoll beschreibt die Zellkultivierung menschlicher dopaminerger Neuronen im Mittelhirn, gefolgt von immunologischen Färbungen und der Generierung neuronaler phänotypischer Profile aus aufgenommenen mikroskopischen High-Content-Bildern, die die Identifizierung phänotypischer Variationen aufgrund genetischer oder chemischer Modulationen ermöglichen.
Wir konstruieren phänotypische Profile von differenzierten menschlichen Zellen, wie z.B. Neuronen. Unser Ziel ist es, die Gesamtauswirkungen von Behandlungen mit chemischen Verbindungen auf die Zellen besser zu verstehen. Phänotypische Profile können weniger verzerrte Einstiegspunkte für weitere mechanistische Studien nahelegen.
Die Qualität der Protokolle zur Differenzierung menschlicher dopaminerger Neuronen hat sich deutlich verbessert, was die Produktion großer Mengen homogener Neuronen ermöglicht. Darüber hinaus gibt es eine Zunahme des Einsatzes von Laborautomatisierung für den Umgang mit der Reproduzierbarkeit differenzierter Zellen über längere Zeiträume, und natürlich ist die Nutzung von bildgebenden Daten schneller und detaillierter geworden. Eine große Herausforderung besteht darin, sicherzustellen, dass phänotypische Profile sowohl quantifizierbar als auch reproduzierbar sind.
Um dies zu erreichen, ist es entscheidend, homogene Neuronen-Batches herzustellen und ein für die Automatisierung geeignetes Protokoll zu identifizieren. Bei einem automatisierten Protokoll gibt es jedoch immer einen Kompromiss zwischen technischer Machbarkeit und physiologischer Relevanz. Hier haben wir einen guten Kompromiss gefunden.
Wir haben eine gebrauchsfertige Lösung entwickelt, um menschliche dopaminerge Neuronen mit einem bildgebenden Verfahren gründlich zu charakterisieren. Das automatisierte Protokoll wird zusammen mit dem Bild- und Datenanalyse-Workflow mehr Wissenschaftler in die Lage versetzen, neuronale phänotypische Profile zu erstellen. Wir möchten besser verstehen, wie sich phänotypische Profile zwischen monogenetischen und idiopathischen Formen der Parkinson-Krankheit unterscheiden.
Wir möchten auch die Veränderungen phänotypischer Aspekte untersuchen, wenn dopaminerge Neuronen mit anderen Hirnzelltypen wie z.B. Mikroglia interagieren.
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Übersicht
Diese Studie beschreibt ein Protokoll zur Kultivierung menschlicher dopaminerger Neurone des Mittelhirns, das immunologische Färbungen und die Erstellung neuronaler phänotypischer Profile mittels Hochdurchsatzmikroskopie umfasst. Das Forschungsziel besteht darin, die phänotypischen Variationen aufzuklären, die durch genetische und chemische Modulationen entstehen, insbesondere im Kontext der Parkinson-Krankheit.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Neuropharmakologie
Hintergrund
- Verbesserung der Protokolle zur Differenzierung menschlicher dopaminerger Neuronen.
- Die Automatisierung hat die Handhabung und Reproduzierbarkeit differenzierter Neuronen verbessert.
- Zu den Herausforderungen gehört die Sicherstellung der Quantifizierbarkeit und Reproduzierbarkeit phänotypischer Profile.
- Es besteht ein Bedarf an einem Ausgleich zwischen technischer Durchführbarkeit und physiologischer Relevanz bei automatisierten Protokollen.
Zweck der Studie
- Erstellung phänotypischer Profile, um die Wirkung chemischer Verbindungen auf Neuronen zu verstehen.
- Untersuchung von Unterschieden in den phänotypischen Profilen von Neuronen im Zusammenhang mit der Parkinson-Krankheit.
- Untersuchung der Wechselwirkungen dopaminerger Neuronen mit anderen Zelltypen des Gehirns.
Verwendete Methoden
- Die primäre Plattform ist die Zellkultur, insbesondere humaner dopaminergener Neuronen.
- Das biologische Modell umfasst dopaminerge Mittelhirnneuronen von gesunden Spendern und Trägern der LRRK2-G2019S-Mutation.
- Zu den Methoden gehören das Auftauen, Kultivieren und Behandeln der Neuronen sowie anschließende Färbung und Bildgebung zur Analyse.
- Zu den wichtigsten Schritten gehören das Auftauen der Neuronen, das Ausplattieren in definierten Konzentrationen und die Behandlung mit Verbindungslösungen.
- Der Einsatz der PhenoLink-Software für die Bildsegmentierung und Merkmalsextraktion wurde hervorgehoben.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Kultivierung dopaminerger Neuronen, wobei Bildgebungsdaten die Extraktion von 126 phänotypischen Merkmalen ermöglichen.
- Charakterisierung neuronaler Reaktionen auf verschiedene Behandlungen, mit besonderem Fokus auf die Wirkung von LRRK2-Kinaseinhibitoren.
- Erkenntnisse zu phänotypischen Unterschieden, die mit genetischen Hintergründen und Behandlungsbedingungen verknüpft sind.
- Entwicklung einer robusten Methode zur Erstellung quantifizierbarer neuronaler phänotypischer Profile.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie bietet ein umfassendes Protokoll zur Charakterisierung menschlicher dopaminerger Neuronen und ermöglicht so eine breitere Forschung in der neuronalen Phänotypisierung.
- Die Methode ermöglicht ein besseres Verständnis von Krankheitsmodellen, insbesondere im Hinblick auf die Parkinson-Krankheit.
- Dazu zählen verbesserte Ansätze für mechanistische Studien zur Neuroneninteraktion und phänotypischen Variationen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Das phänotypische Profiling von menschlichen, aus iPSCs abgeleiteten dopaminergen Mittelhirnneuronen ermöglicht eine mehrdimensionale, quantitative Beurteilung krankheitsrelevanter zellulärer Reaktionen in der Parkinson-Forschung. Dieser Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit in der frühen Entdeckungsphase, indem komplexe Phänotypen erfasst und die mechanistische Entlastung zur Zielvalidierung unterstützt wird. Skalierbare, bildbasierte Hochdurchsatzverfahren ermöglichen eine robuste Portfolio-Priorisierung und vergleichbare Bewertung über verschiedene Programme hinweg in Neurodegenerations-Pipelines.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht eine unvoreingenommene Untersuchung krankheitsrelevanter neuronaler Phänotypen zur mechanistischen Entlastung von Risiken.
- Unterstützt die funktionelle Zielvalidierung durch gleichzeitige Quantifizierung mehrerer zellulärer Marker.
- Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Zielstrukturauswahl anhand mehrdimensionaler phänotypischer Daten.
- Bietet eine Plattform zum Vergleich genetisch und durch Wirkstoffe induzierter phänotypischer Veränderungen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Liefert standardisierte, reproduzierbare phänotypische Assays unter Verwendung automatisierter Flüssigkeitshandhabung und hochdurchsatzfähiger Bildgebung.
- Erzeugt quantitative Ausgaben über 126 Merkmale hinweg zur robusten Wirkstoffbewertung.
- Ermöglicht skalierbare Durchmusterung in 384-Well-Formaten für eine effiziente Assay-Entwicklung.
- Unterstützt die Wiederverwendung der Plattform für vielfältige Wirkstoff- und genetische Störungsstudien.
Translationale und präklinische Forschung
- Koppelt in-vitro-Phänotypen mit krankheitsrelevanten Biomarkern für eine translationale Kontinuität.
- Ermöglicht risikoadjustierte Entscheidungen zum Fortschreiten durch Vergleich der neuronalen Reaktionen von gesunden Proben mit solchen von krankheitsbedingten Mutanten.
- Liefert mechanistische Einblicke in die Wirkung von Substanzen in menschlichen neuronalen Systemen.
- Erleichtert die Kreuzvalidierung mit anderen präklinischen Modellen, sofern sie durch phänotypische Ausgangsparameter unterstützt wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieser Workflow zur phänotypischen Profilierung verbindet die frühe Entdeckung, die Identifizierung von Wirkstoffkandidaten und die präklinische Forschung, indem er eine quantitative, reproduzierbare Beurteilung neuronaler Phänotypen in krankheitsrelevanten Systemen ermöglicht.
- Entdeckungsbiologie Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch mehrdimensionale phänotypische Messungen.
- Screening: Bietet Assay-Bereitschaft und Reproduzierbarkeit mit automatisierten, bildgebenden Hochdurchsatzplattformen.
- Analytik: Liefert quantitative Messungen und statistische Auswertungen für eine robuste Bedingungsvergleichung.
- Translationale Forschung Verbindet in-vitro-Phänotypen mit Krankheitsbiomarkern für die präklinische Abstimmung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Etabliert eine skalierbare, wiederverwendbare Plattform für die neuronale phänotypische Profilierung über verschiedene Programme hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unschärfen in der Neurodegenerationsforschung.
- Operativer Wert: Standardisiert Arbeitsabläufe zur Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit in Hochdurchsatzumgebungen.
- Strategischer Wert: Ermöglicht fundierte Go/No-Go-Entscheidungen und kapitaleffizientes Portfolio-Management.
- Portfolio-Beitrag: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Neurodegenerationstherapien.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Kultur von Stammzellen, der neuronalen Differenzierung und der Analyse von Hochdurchsatzmikroskopiebildern.
- Benötigt Zugang zu automatisierter Flüssigkeitshandhabung, konfokaler Mikroskopie und fortschrittlicher Bildanalyse-Software.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei Färbung, Bildgebung und Datenverarbeitungsprotokollen.
- Die Anpassung an andere neuronale Subtypen oder Krankheitsmodelle kann eine Optimierung der Protokolle erfordern.
- Die Balance zwischen Automatisierung und physiologischer Relevanz ist entscheidend für robuste phänotypische Ergebnisse.
Biopharma-Häufig gestellte Fragen
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:05
Thawing Human iPSC‐Derived mDA Neurons for Seeding
4:22
Human iPSC‐Derived mDA Neurons Seeding and Compound Treatment for Phenotypic Profiling
6:53
Image Processing of Fluorescently‐Stained Human iPSC‐Derived mDA Neurons for Phenotypic Profile Generation
