Identifizierung und Klassifizierung von positionsspezifischen GABA_A Rezeptor Subunit Missense Varianten für ihre Rolle in hippokampalen Pyramidenneuronen

Unsere Studie basiert auf der Idee, dass epileptogene und proximal vorhergesagte Mutationen in GABA-A-Rezeptor-Untereinheiten das CA1-Pyramidenneuronenmodell in ähnlicher Weise beeinflussen können. Wir untersuchen dies anhand eines Multi-Scale-Frameworks. Laborexperimente sind unerlässlich, um die Wahrheit zu entdecken, aber sie können die Vielfalt und Komplexität des Lebens auf allen Ebenen, von den Molekülen bis zu den Organismen, nicht vollständig erfassen. Es gibt einfach zu viele Möglichkeiten, das ist das Problem.

Unser Protokoll und unsere Ergebnisse ebneten den Weg für eine computergestützte Umgebung, die verwendet werden kann, um den Einfluss von Polymorphismen, wie z. B. GABA-A-Rezeptor-Untereinheitspolymorphismen, auf die neuronale Funktion zu untersuchen.

Unsere Studie wirft neue Fragen auf, inwiefern vorhergesagte pathogene Varianten und epileptogene Mutationen ähnliche Eigenschaften aufweisen und wie diese Zusammenhänge effektiv erfasst und simuliert werden können.

Unser derzeitiger Fokus liegt auf der Funktion des entorhinalen Kortex-Hippocampus-Mikroschaltkreises. Wir werden In-vivo-Tiermodelle und computergestützte Mikroschaltkreismodelle verfolgen, um die Septumkontrolle auf diesem Schaltkreis zu erforschen, insbesondere bei neuropsychiatrischen Störungen.

[Erzähler] Öffnen Sie zunächst die ursprüngliche Excel-Datei, die die genetischen Daten enthält, und entfernen Sie die nicht benötigten Spalten aus der Datei, sodass nur vier Spalten übrig bleiben: GRCh38Chromosome, GRCh38Location, Name und Protein change, bevor Sie die Datei wie data1.xlsx in dem für die R-Software relevanten Arbeitsverzeichnis speichern. Öffnen Sie zum weiteren Bereinigen und Formatieren der Daten die R-Software und RStudio. Öffnen Sie dann das R-Skript Data_GABAA R. Legen Sie das Arbeitsverzeichnis fest, und laden Sie die erforderlichen Bibliotheken, indem Sie auf die Schaltfläche Ausführen klicken. Laden Sie die Datendatei, und starten Sie die Datenbereinigung für Spalten, die diesen Vorgang erfordern. Bereinigen und kombinieren Sie die Daten in einer Spalte, die durch ein einzelnes Leerzeichen getrennt ist. Erstellen Sie einen neuen Datenrahmen für die kombinierte Ausgabe und fügen Sie die gewünschte ID der Ensemble-Transkriptvariante hinzu. Schreiben Sie das Ergebnis in eine neue Excel-Datei mit dem Namen data1output.xlsx. Um ein biophysikalisches Modell einer GABAergen Synapse auf einem auf mehreren Kompartimenten basierenden Hippocampus-Pyramidenneuron zu erstellen, installieren Sie Brian 2 und importieren Sie die erforderlichen Pakete. Entwerfen Sie das leitfähigkeitsbasierte Modell, indem Sie die Kinetik des Ionenkanal-Gatings, passive und aktive Parameter sowie die postsynaptische Leitfähigkeit definieren. Verwenden Sie die modifizierten Leitwerte vom Hodgkin-Huxley-Typ für Pyramidenneuronen im Hippocampus. Passen Sie die Dichteverteilung der spannungsgesteuerten Natriumkanäle für Soma, Axon-Anfangssegment, Ranvier-Knoten und Dendriten an. Stellen Sie die Leitwerte des Natrium- und Kaliumkanals in myelinisierten Segmenten auf Null ein. Eingebaute Ionenkanal-Gating-Kinetik für spannungsgesteuerte Natrium- und Kaliumkanäle. Führen Sie synaptische Ströme als Summe aller glutamatergen und GABAergen Synapsen in einem Kompartiment ein. Beziehen Sie sowohl schnellen AMPA-Rezeptor-vermittelten Strom als auch langsamen NMDA-Rezeptor-vermittelten Strom in den glutamatergen Strom ein. Beziehen Sie nur schnellen GABA-Rezeptor-vermittelten Strom in den GABAergen Strom ein. Nehmen wir an, dass für jeden präsynaptischen Spike eine konstante Menge an Glutamat an die Synapse abgegeben wird. Daher ist die Aktivierung von Rezeptoren von der Spike-Zeit abhängig, und die Gesamtrezeptorleitfähigkeiten, G-AMPA und G-NMDA, spiegeln die Menge an Glutamat wider, die bei jedem Ereignis freigesetzt wird. Stellen Sie die morphologischen Parameter ein, indem Sie den experimentell gemessenen Durchmesser für Soma und Neuriten sowie die Länge jedes Neuritenkompartiments und die Verzweigungsmuster verwenden. Reduzieren Sie die reale Neuronenmorphologie in ein Modell mit mehreren Kompartimenten, indem Sie die Zelle in mehrere Kompartimente unterteilen, die die Hauptverzweigungsstruktur genau beibehalten und die bilaterale Symmetrie aufrechterhalten. Bestimmen Sie die biophysikalischen Parameter für das GABAerge Synapsenmodell, indem Sie die zuvor erhaltenen Wildtyp-Kontrollmessungen auswerten und zur Verwendung im Modell importieren. Definition von Anstiegs- und Deaktivierungszeitkonstanten für den GABA-A-Rezeptor-vermittelten postsynaptischen Strom. Entwerfen Sie die Topologie des Neuronenmodells und weisen Sie morphologische und biophysikalische Parameter zu, was die Spezifizierung der räumlichen Anordnung und der Verbindungen der Kompartimente auf der Grundlage der zuvor erhaltenen morphologischen und verzweigten Informationen umfasst. Weisen Sie jedem Kompartiment des Modells die entsprechenden morphologischen Parameter wie Segmentlänge und -durchmesser sowie biophysikalische Parameter zu. Erstellen Sie die präsynaptische Aktivität mit SpikeGeneratorGroup. Verbinden Sie den Spike-Generator mit dem Zielkompartiment des Modellneurons mithilfe der Synapsen-Klasse, um synaptische Verbindungen zu modellieren. Stellen Sie einen konstanten Dauerstrom von 0,85 Nanoampere ein und platzieren Sie die Elektrode am Soma, um die unterschwellige Aktivität nachzuahmen, die durch die Ionenstrombelastung zu einem bestimmten Zeitpunkt ausgelöst wird. Um Aufzeichnungsmonitore zu erstellen, zeichnen Sie Spannungsspuren aus Zielabteilungen mit StateMonitor auf. Erstellen Sie abschließend das Netzwerk, und führen Sie es aus. Neuronale Spike-Züge unter einzeldistalem glutamaterger Input und somatischer GABAerger Hemmung zeigten die Feuerungsergebnisse von Wildtyp- und mutierten GABA-A-Rezeptoren. Die beta-3N110D-Mutation beeinträchtigte die Hemmung, was dazu führte, dass das Feuern von Neuronen nach dem vierten präsynaptischen Spike mit einer kurzen postsynaptischen Verzögerung an den exzitatorischen Glu-S1-Eingang gebunden war. Die gamma-2K328M-Mutation beeinträchtigte auch die Hemmung, wobei das Feuern der Neuronen um den fünften Glu-S1-Spike herum und mit einer längeren postsynaptischen Verzögerung als beta-3N110D auftrat. Unter dualem synaptischem Input verursachte die gamma-2P302L-Mutation ein Feuern, das nahezu synchron mit dem medialen apikalen Glu-S2-Input war, was wahrscheinlich eine verzögerte Summation von Glu-S1 widerspiegelt. Die beta-3T288N-Mutation zeigte ein ähnliches Muster mit Spikes, die an Glu-S2-Eingängen ausgerichtet waren, und einem zweiten Spike, der nahezu synchron auftrat. Die beta-3N110D-Mutation unter dualen Eingangsbedingungen löste Spikes für fast alle exzitatorischen Eingänge aus, mit Ausnahme der ersten beiden, mit deutlich verkürzten Inter-Spike-Intervallen. Die gamma-2K328M-Mutante zeigte ein vergleichbares Feuermuster, reagierte aber nicht auf den zweiten und dritten exzitatorischen Input. Unter dreifachen exzitatorischen Eingangsbedingungen reagierten sowohl beta-3N110D- als auch gamma-2K328M-Mutanten auf fast alle präsynaptischen Spikes und feuerten Spike-Paare als Reaktion auf kumulativen exzitatorischen Antrieb ab.