Translation extrazellulärer Elektronentransferaktivitäten mit organischen elektrochemischen Transistoren

Unsere Forschung konzentriert sich auf die Entwicklung von Bioelektronik, die den bakteriellen extrazellulären Elektronentransfer (EET) integriert, um Biosensorik und Biocomputing-Anwendungen zu erweitern. Wir suchen nach Antworten darauf, wie EET mit elektronischen Materialien interagiert, wie EET genetisch reguliert werden kann, um die elektrische Leistung zu optimieren, und ob es neue emergente Funktionen in diesen elektrochemischen Systemen gibt, die lebende Zellen enthalten. Fortschritte in der bakteriellen HR-Zell- oder Elektronentransferforschung nutzen die synthetische Biologie für die Entwicklung von EET-Signalwegen, elektrochemische Systeme für die Redoxüberwachung zum Beispiel und die Mikroskopie von Zellaktivitäten, die Durchführung von Rasterkraftmikroskopie und Makroelektroden für die Elektronenflussanalyse und fortschrittliche Spektroskopie wie UAVs Raman für die Charakterisierung von Grenzflächen in der Materialbiologie.

Wir zeigen, dass gentechnisch veränderte Stoffe, die an Krankheiten gezeigt werden, die OECT-Ausstoßung modulieren und biologisch gesteuerte elektrische Reaktionen ermöglichen können. Zu den Ergebnissen gehören die Veranschaulichung der direkten und indirekten EET-Signalwege, die sich auf die Leistung der Bioelektronik auswirken, die Kopplung genetischer Logik an elektrische Ergebnisse und die Abstimmung der genetischen Plastizität über EET. Im Vergleich zur traditionellen OECT-Arbeit bieten lebende Zellen Vorteile wie dynamische, genetisch programmierbare Steuerungen durch extrazellulären Elektronentransfer und die Möglichkeit, den Zellstoffwechsel für Echtzeitreaktionen zu nutzen.

Im Vergleich zu herkömmlichen biologischen Schaltkreisen, die Fluoreszenzreporter verwenden, liefern OECT-Benutzer schnellere direkte elektrische Ergebnisse mit hoher Empfindlichkeit. Unsere zukünftige Arbeit umfasst den Ausbau genetischer Schaltkreise zur Steuerung der EET und die Entwicklung der Epigenetik oder Optogenetik, um die Elektronik in die Lage zu versetzen, die EET-Genexpression zu modulieren. Wir sind auch daran interessiert, Regelkreise für Anwendungen wie das Training neuronaler Netze zu schaffen.

Schließlich untersuchen wir verschiedene OECT-Kanalmaterialien und die Einbeziehung von Mikrofluidik und Institutssauerstofferzeugung, um die Leistung der Geräte weiter zu kontrollieren. Um mit dem Autoklavieren des organischen elektrochemischen Transistors oder der OECT-Objektträger, Polydimethylsiloxan- oder PDMS-Platten und der Silber-, Silberchlorid-Referenzelektrode zu beginnen. Backen Sie die Komponenten im Autoklaven bei 80 Grad Celsius, um sie zu trocknen.

Übertragen Sie die OECT-Objektträger im Autoklaven und die Referenzelektrode Silber, Silberchlorid in die Handschuhbox. Setzen Sie die PDMS-Platten vier Stunden lang einem Vakuum in der Antikammer des Handschuhfachs aus, um den eingeschlossenen Sauerstoff zu desorbieren. Um das OECT-Gerät zusammenzubauen, legen Sie dann die PDMS-Blätter über die OECT-Objektträger.

Injizieren Sie 45 Mikroliter Shewanella-Basalmedium oder SBM in jede OECT-Kammer. Decken Sie die Anschlüsse der OECT-Kammer mit PDMS-Platten ab, um eine Verdunstung und Kontamination des Mediums zu verhindern. Beginnen Sie die erste elektrochemische OECT-Messung, indem Sie den Kanalstrom IDS für einen Gate-Spannungsschritt von null bis 0,2 Volt messen.

Überwachen Sie den OECT-Kanaldrain-Course-Strom oder IDS bei einer konstanten Kanaldrain-Source-Spannung (VDS) von minus 0,05 Volt und einer Gate-Spannung VGS von 0,2 Volt, bis sich der Strom stabilisiert hat. Konfigurieren Sie den ersten Gerätekanal für die Messung des aktuellen IDS des OECT-Kanals. Legen Sie den Namen der Technik auf Schnelle Amperometrie, die Äquilibrierungszeit auf eine Sekunde, die Äquilibrierungsspannung auf minus 0,05 Volt, die Bias-Spannung auf minus 0,05 Volt, die Laufzeit auf 14 Sekunden und das Abtastintervall auf 0,5 Millisekunden fest.

Konfigurieren Sie als Nächstes den zweiten Instrumentenkanal, um die Gate-Spannung VGS zu steuern. Legen Sie den Techniknamen auf Mixed Mode, die Bedingungszeit auf eine Sekunde, die Bedingungsspannung auf null Volt, den Modus der ersten Stufe auf konstant E, die Bias-Spannung der ersten Stufe auf null Volt fest. Bereiten Sie eine Laufzeit auf vier Sekunden vor.

Modus der zweiten Stufe auf konstante E, Bias-Spannung der zweiten Stufe auf 0,2 Volt. Stufe zwei Laufzeit auf 10 Sekunden und Stichprobenintervall auf 0,5 Millisekunden. Legen Sie an alle OECT-Geräte eine konstante Kanalspannung VDS von minus 0,05 Volt und eine Gate-Spannung VGS von 0,2 Volt an.

Zentrifugieren Sie die Shewanella oneidensis-Suspension bei 1500 3G für vier Minuten und waschen Sie das Zellpellet dreimal mit einem Milliliter frischem Wachstumsmedium. Nach dem letzten Waschen resuspendieren Sie die Zellen in 0,5 Milliliter oder der Hälfte des ursprünglichen Kulturvolumens, um eine konzentrierte Zellsuspension mit einer optischen Dichte von 600 von eins bis 3,5 zu erhalten. Übertragen Sie die konzentrierte Zellsuspension in die Handschuhbox.

Bereiten Sie das Inokulum vor, indem Sie die Zellen auf eine vorgesehene optische Dichte von 0,1 verdünnen, indem Sie das SBM+ mit Laktat ergänzen, das frisch in der Glovebox mit gereinigten Medienmaterialien zubereitet wurde. Stoppen Sie den Potentiostaten. Injizieren Sie fünf Mikroliter des vorbereiteten Inokulums in die OECT-Kammer mit 45 Mikrolitern SBM, um eine endgültige Absorption von 0,01 zu erreichen.

Decken Sie die Anschlüsse der OECT-Kammer mit PDMS-Platten ab, um Verdunstung und Kontamination des Mediums zu vermeiden. Bei anaeroben Kulturen verdünnen Sie die Shewanella-Zellkultur zehnfach mit einem Verdünnungsmedium mit der gleichen Konstitution wie das Wachstumsmedium. Nach dem Stoppen des Potentiostaten injizieren Sie fünf Mikroliter des anaeroben Inokulums in die OECT-Kammer, die 45 Mikroliter SBM-Medium enthält.

Decken Sie die OECT-Kammeranschlüsse mit PDMS-Platten ab. Legen Sie konstante Vorspannungen an die OECT-Kanäle mit einer Kanalspannung VDS von minus 0,05 Volt und einer Gate-Spannung VGS von 0,2 Volt für 24 Stunden an. Trennen Sie den Potentialstat von einzelnen OECT-Geräten nur während der Zeitpunktmessungen zur Charakterisierung.

Überwachen Sie signifikante Änderungen des Dotierungszustands des OECT-Kanals während der ersten acht Stunden. Führen Sie nach 24 Stunden die Silber-Silberchlorid-Referenzelektrode in die OECT-Kammer ein, indem Sie sie vorsichtig drehen und durch die Flüssigkeitsaustauschöffnung schieben. Messen Sie die Übertragungskurven des OECT, indem Sie die Gate-Spannung von minus 0,1 Volt auf 0,6 Volt durchschwenken, während Sie den Kanalstrom IDS mit einer konstanten Bias-Spannung VDS von minus 0,05 Volt überwachen.

Messen Sie gleichzeitig die genauen Potentiale der Gate- und Source-Elektrode gegen die Referenzelektrode. Konfigurieren Sie den ersten Gerätekanal so, dass der aktuelle IDS des OECT-Kanals mithilfe der Chronoamperometrie-Technik gemessen wird. Stellen Sie die Äquilibrierungszeit auf fünf Sekunden, die Äquilibrierungsspannung auf minus 0,05 Volt, die Bias-Spannung auf minus 0,05 Volt, die Laufzeit auf 35 Sekunden und das Abtastintervall auf 0,09915 Sekunden ein.

Konfigurieren Sie dann den zweiten Instrumentenkanal so, dass die OECT-Gate-Spannung VGS mithilfe der linearen Sweep-Voltammetrie gesteuert wird. Stellen Sie die Äquilibrierungszeit auf fünf Sekunden ein, die Äquilibrierungsspannung auf minus 0,1 Volt. Anfangsspannung auf minus 0,1 Volt einstellen.

Endspannung auf 0,6 Volt. Spannungsschritt auf 0,002 Volt und Abtastrate auf 0,02 Volt pro Sekunde. Konfigurieren Sie den dritten Gerätekanal so, dass das OECT-Quellpotential VS anhand der Silber-Silberchlorid-Referenzelektrode mithilfe der Öffnungspotentiometrie gemessen wird.

Legen Sie die Laufzeit auf 40 Sekunden und das Stichprobenintervall auf 0,09915 Sekunden fest. Konfigurieren Sie den vierten Gerätekanal so, dass das OECT-Gate-Potential VG mithilfe der Open-Circuit-Potentiometrie gegen die Referenzelektrode gemessen wird. Legen Sie die Laufzeit auf 40 Sekunden und das Stichprobenintervall auf 0,09915 Sekunden fest.

Spülen Sie die Referenzelektrode nach jeder Messung mit 70 % Ethanol ab und wischen Sie sie mit einem neuen fusselarmen Handtuch ab. Die angepassten Geschwindigkeitskonstanten für die Elektronentransferaktivität zeigten signifikante Unterschiede zwischen den Stämmen, wobei die Delta MtrC- und Delta MTR-Mutanten im Vergleich zu Wildtyp-S.oneidensis MR-1 reduzierte Konstanten aufwiesen. Die Komplementation von Mutanten mit MtrC oder MTRC AB führte unter Induktorbedingungen zu einem erneuten Raten auf Wildtyp-Niveau.

Der OECT-Kanalstrom zeigte eine schnelle Detektion der Elektronentransferaktivität mit Drain-Quellstrom und normalisiertem Drain-Quellstrom, was statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Stämmen innerhalb von 1,5 Stunden nach der Inokulation zeigte. Abiotische Kontrollen und nicht-induzierte Mutanten zeigten minimale Veränderungen, die die Sensitivität des Hybridsystems verstärkten.