Name: Charakterisierung von Elektronentransport durch lebende Biofilme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Erfahren Sie die Messung der elektrischen Leitfähigkeit lebender mikrobieller Biofilme unter physiologischen Bedingungen. Diese Methode nutzt interdigitale Elektroden und einen Bipotentiostaten, um den Elektronentransport in situ zu untersuchen.

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L.M.T, M.D.Y und S.M.G-S. bestätigen das Office of Naval Research (Award-#N0001415WX01038 und N0001415WX00195), Naval Research Laboratory und das Naval Research Laboratory Nanowissenschaften Institute; M.Y.E.-N. wird durch die US Abteilung von Energie Grant DE-FG02-13ER16415 unterstützt.

1. die Mikroelektrode Array (IDA) Vorbereitung
<ol><li>Erhalten Sie im Handel erhältlichen IDA Elektroden auf leitfähigem Untergrund gemustert oder synthetisieren sie Lithographische Standardverfahren verwenden. 28 Hinweis: IDA Abmessungen und/oder Materialien können je nach gewünschten Bedingungen für verschiedene Experimente variiert werden. IDAs verwendet hier waren kommerziell erhältlich und bestand aus zwei ineinandergreifenden gold Mikroelektroden gemustert auf einem Glassubstrat, verbunden mit großen Elektroden an den entgegengesetzten Enden des Arrays. Die Elektroden sind ausgesetzt, während die Buslinien verbinden die Elektroden mit großen Kontaktflächen mit dünnen isolierenden Material beschichtet sind. IDAs verwendet hier bestehen aus zwei Sätze von 10 µm breiten und 2 mm lange gold Mikroelektrode Bändern (Source und Drain) Abstand auseinander 5 µm auf einer flachen Glasoberfläche gemustert. IDAs verwendet hier hatte 65 Elektrodenpaare (130 insgesamt die Bänder). Wechselnde Bänder werden mit Elektroden an den entgegengesetzten Enden des Arrays verbunden.</li>
	<li>Draht und IDA zu isolieren<ol>
<li>Legen Sie einen Draht auf jede große Elektrode-Pad mit leitfähigen Silber Epoxy.<ol>
<li>Bereiten Sie leitende Epoxid nach Herstellerangaben für die spezifische Epoxy im Einsatz mit einer Rute oder Pipette Mischkanüle (Anweisungen variieren je nach Hersteller).</li>
			<li>Legen Sie einen Draht auf jeder gold, sichere mit Lab Band. Decken Sie den Draht und Pad mit Silber Epoxy mit Stab- oder Pipette Mischkanüle.</li>
			<li>Vorsichtig bewegen zu einem Ofen 80 ° C für 1 h, zu heilen oder Heilung basierend auf Empfehlungen des Herstellers für die spezielle leitfähige Silber Epoxy verwendet.</li>
			<li>Nachdem das Epoxidharz aushärtet, benutzen Sie ein Multimeter elektrische Verbindung zwischen dem Ende des Drahtes und die Pads gewährleistet. Der Widerstand zwischen dem Draht und dem Pad sollte &lt; 5 Ω. Auch verwenden Sie das Multimeter, um sicherzustellen, dass keine leitende Epoxid mehrere Elektroden verbunden ist wie das Array kurz kann. Wenn leitende Epoxid mehrere Leitungen verbunden ist, verwenden Sie einen Schreiber, um die Leitungen zu isolieren.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Isolieren Sie die epoxied Verbindung durch die Beschichtung der Verbindung mit einer thermischen, elektrischen und wasserdichten Dämmstoff. Schwer entflammbar Polyurethan Harze sind oft geeignet.<ol>
<li>Entfernen Sie die Spitze des 15 mL konische Zentrifugenröhrchen (bei ca. 2,5 mL) als Form für das isolierende Material. Machen Sie zwei kleine Löcher in den Boden für die Drähte vorstehen mithilfe einer Nadel 21g.</li>
			<li>Legen Sie die IDA in die Form und den Draht durch die Löcher in den Boden der Form.</li>
			<li>Bereiten Sie die spezifischen isolierende Material. Befolgen Sie die Anweisungen, die mit dem speziellen Harz gewonnen.</li>
			<li>Pipette den Isolator in der Form, damit der Silberne Epoxy komplett ist abgedeckt (~2.5 mL) und nach Herstellerangaben trocknen lassen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. elektrochemische Reaktor Setup, Test und Impfung
<ol><li>Richten Sie die elektrochemische Zelle.<ol>
<li>IDA, Gegenelektrode und Bezugselektrode in der elektrochemischen Zelle einfügen. Hinweis: Die elektrochemische Reaktor eingesetzt kann stark variieren, solange alle Elektroden reinpassen. Eine Überlegung ist, dass die Bezugselektrode so nah wie möglich an der Arbeitselektrode die praktischen Grenzen des Reaktors gegeben werden sollte. Hier verwenden wir einen Einkammer-Reaktor mit dem Referenz-Elektrode ~ 2-3 cm von den Elektroden arbeiten. Die Gegenelektrode sollten auch größer als die Arbeitselektrode um sicherzustellen, dass es nicht in das System begrenzt ist.</li>
		<li>Arbeiten mit einer Reinkultur Sterilisieren Sie den Reaktor mit der Gegenelektrode im Inneren. Sterilisieren Sie die Referenzelektrode durch Einweichen in Bleichmittel für 10 min und sterile deionisiertes Wasser für 10 Minuten die IDA sterilisieren durch Eintauchen in Bleichmittel für 5 s gefolgt von sterilen deionisiertes Wasser für 10 s vor dem einsetzen in den Reaktor.</li>
		<li>Füllen Sie die elektrochemische Zelle mit steriles Medium für Biofilm Wachstum geeignet. Verwenden Sie für G. Sulfurreducens17,18Süßwasser Medium mit Ausnahme Fumarat. Verwenden Sie für Biocathode MCL9 künstliches Meerwasser Medium. 9
</li>
		<li>Verbinden Sie die Elektroden mit einem Bipotentiostat. Die Zähler-Führung einer IDA-Elektrode auf der Arbeit-Zuleitung 1, IDA Elektrode zu arbeiten-Zuleitung 2, die Referenzelektrode, die Referenz-Führung und Gegenelektrode herstellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Elektrochemische Prüfung von IDAs. Hinweis: Das Hauptziel dieses Tests ist es, sicherzustellen, dass die beiden Elektroden elektrisch isoliert sind. Alle elektrochemische Techniken sind in der Software verwendet, um die Bipotentiostat zu steuern.<ol>
<li>Führen Sie Leitfähigkeit Kontrolltests (vor Biofilm Wachstum) um richtige IDA-Funktion mit einem Bipotentiostat zu gewährleisten.<ol>
<li>Maßnahme das offener Stromkreis Potential jeder Elektrode für 1 min. Hinweis: Auf einigen Instrumenten potenzielle offener Stromkreis muss erreicht werden durch die Galvanostatic Sammlung-Bedienung und Einstellung des Stroms auf 0 mA.</li>
			<li>Maßnahme das offener Stromkreis Potential der Elektrode 2 während der Durchführung zyklischer Voltammetrie Elektrode 1 zwischen + 0,2 V auf + 0,6 V (gegen sie) bei 20 mV/s. Hinweis: Andere Grenzen und Abtastraten für CV können verwendet werden, falls gewünscht. Vermeiden Sie jedoch Potenziale, die in Wasserstoff oder Sauerstoff Generation führt.</li>
			<li>Vergewissern Sie sich, dass die offenen Kreislauf potenzielle gemessen an Elektrode 2 nicht das Potential der Elektrode 1 während der CV mit dem potentiostaten Software widerspiegelt. Hinweis: Die offenen Stromkreis Potential der Elektrode 2 kann sich ändern, aber es soll das Potential der Elektrode 1 unabhängig.</li>
			<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.2.1.1 durch 2.2.1.3 außer Kontrolle das Potential der Elektrode 2 und Maß das offener Stromkreis Potential der Elektrode 1.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Legen Sie das Potenzial der Elektroden Arbeiten zum gewünschten Wachstumspotenzial des relevanten Elektroaktive Biofilms mit der Bipotentiostat Software. Z. B. 0,5 V (gegen sie) für Geobacter Sulfurreducens oder 0,31 V (gegen sie) für Biocathode MCL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Relevanten Elektroaktive Biofilm wachsen<ol>
<li>Die elektrochemischen Reaktor aus einem Lager Kultur/Bereicherung der gewünschten elektrochemisch aktiven Mikroorganismen mit standard-aseptische mikrobiologische Techniken zu impfen. Für standard-Tests, impfen in eine 01:20 Verhältnis (Inokulum zu Reaktorvolumen) ein OD600 = 0,5 Kultur.</li>
		<li>Legen Sie das Rühren im Reaktor auf das gewünschte Niveau (~ 200 u/min) und dem Inkubator / Wasserbad auf die gewünschte Temperatur basierend auf den Wachstumsbedingungen des Biofilms von Interesse. Verwenden Sie für G. Sulfurreducens30 ° C für ein optimales Wachstum.</li>
		<li>Inkubieren Sie das System basierend auf spezifischen Anforderungen der Anmelder von Interesse, bis der Biofilm überbrückt die Kluft zwischen die beiden Elektroden. Für den stationären G. Sulfurreducens Biofilm inkubieren ~ 7-10 Tage. Inkubieren Sie für Biocathode MCL ~ 7 Tage. In jedem Fall Steuern Sie die Temperatur auf 30 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. elektrochemische gating Experimente
<ol><li>Wählen Sie die experimentellen Parameter, die verwendet werden, um die Abhängigkeit von Strom-Potenzial für die gating Messungen zu bestimmen.
	<ol>
<li>Bestimmen Sie den Bereich der Tor-Potenziale, die auf der IDA, die durchgeführten Strom (ISD) versus Tor potenzielle (E-G) Kurve für das System zu erhalten angewendet werden. Hinweis: Das Tor Potenziale untersucht sollten alle Potentiale mit möglichen Redox Aktivität abdecken. Wenn keine Informationen über das System des Interesses zur Verfügung steht, sollte einen weiten Potentialbereich verwendet (-0.55, + 0,6 V vs. sie). Ein Versuch und Irrtum-Ansatz kann verwendet werden, zur Feinabstimmung der Reihe basiert auf dem System unter Studie. Potenzielle Tor ist wie folgt definiert: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/54671/54671eq1.jpg"> wo ist das Potenzial der Drain-Elektrode ED und ES ist das Potenzial der Quelle-Elektrode. Das Spektrum der Tor Potentiale verwendet wird durch die Anforderungen und Einschränkungen des spezifischen Systems von Interesse eingeschränkt. 18 Hinweis: Source und Drain Potenziale, die in Sauerstoff und Wasserstoff Evolution führt sollte vermieden werden, da diese Prozesse den Biofilm beschädigen können.</li>
		<li>Bestimmen Sie die Source-Drain-Spannung (VSD), die als treibende Kraft für Elektronentransport durch den Film von der Quelle zum Abfluss verwendet wird. Source-Drain-Spannung ist wie folgt definiert: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/54671/54671eq2.jpg"> Hinweis: Die Source-Drain-Spannung sollte klein genug sein, damit ichSD VSDlinear skaliert. 17
</li>
		<li>Wählen Sie eine Scan-Rate (V) an der EG linear mit der Zeit, das unabhängig vom ichSD ist geändert, so dass das System angenähert werden kann, um im Steady-State für jedes mögliche Tor zu sein. Hinweis: Eine Scan-Rate von weniger als 0,002 V/s wird oft für biologische Systeme verwendet. 29 , 30
</li>
		<li>Richten Sie die Bipotentiostat Software gating Messungen durchführen (d. h. fegen das Tor potenzielle) über den ausgewählten Bereich an der ausgewählten Source-Drain-Spannung und an den gewünschten Scan-Rate basierend auf der obigen Überlegungen. Hinweis: bei früheren gating Messungen mit G. Sulfurreducens,17,19 EG =-0.55 V bis 0,6 V (gegen sie), VSD = 0,01 V oder 0,1 V, V = 0,001 V/s. Für Biocathode MCL, EG = 0,25 V bis 0,7 V (gegen sie), VSD = 0,002 V, V = 0,0002 V/s.<ol>
<li>Darüber hinaus führen Sie eine Basismessung mit VSD = 0,000 V (d. h. einen Lebenslauf an jede einzelne Elektrode gleichzeitig genommen) an der gleichen v in Schritt 3.1.3 ausgewählt.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Messungen Sie gating mit den Allgemeine Geschäftsbedingungen in 3.1.4 unter sowohl Umsatz (mit löslichen Elektron Spender oder Akzeptor vorhanden) und nicht-Umsatz (ohne lösliche Elektronen-Donor und Akzeptor). Hinweis: Nicht-Umsatz Bedingungen sind vorteilhaft da Messungen nicht durch die Oxidation oder Reduktion der lösliche Verbindungen für Zellstoffwechsel verdeckt sind, obwohl ähnliche Ergebnisse erhalten werden sollte, unabhängig davon, denen welchen Zustand nach verwendet wird subtrahieren Hintergrund Strömungen (siehe 3.1.8).<ol>
<li>Erzielen Sie Umsatz Bedingungen mithilfe der gleichen Reaktor Medium wie verwendet für Bakterienwachstum auf der Elektrode. Dieses Medium enthält lösliche Elektron Spender, wie Acetat für G. Sulfurreducens,17 oder Akzeptor, wie Sauerstoff für Biocathode MCL.</li>
			<li>Zu erreichen-Umsatz Bedingungen machen das gleiche Reaktor Medium für Bakterienwachstum auf der Elektrode verwendet, außer dem löslichen Elektron Spender oder Akzeptor weglassen. Entfernen Sie nachdem Sie sichergestellt haben, dass die potentiostaten ausgeschaltet ist das Medium aseptisch und fügen Sie in frisches Medium ohne die Elektron-Spender für anodische Systeme oder Akzeptor für kathodischen Systeme. Alternativ kann einen kontinuierlichen Fluss-System einrichten, langsam das Medium mit dem gewünschten Medium für nonturnover Bedingungen zu ersetzen. Hinweis: Wenn Sauerstoff die löslichen Elektronen-Akzeptor (z. B. für Biocathode MCL) ist, sparge das System mit einer Mischung von ~ 15 % CO2 und 85 % N2 (oder einer Gasmischung, die den richtigen pH-Wert im Medium beibehält).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Nach Beendigung der gating Messungen Anwendung der potentiostaten das Potential jeder Elektrode zurück zum Wachstum Potenzial, um das System wieder zu stabilisieren (mit denselben Werten wie 2.2.2) fest.</li>
		<li>Wenn alle oben beschriebenen Bedingungen erfüllt sind (ISD ist unabhängig von v und skaliert linear mit V-SD), ichSD -Werte zu konvertieren, Leitfähigkeit mit den folgenden Gleichungen als zuvor beschriebenen31 <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/54671/54671eq3.jpg"> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/54671/54671eq4.jpg">
</li>
		<li>wo ist G die Leitfähigkeit und S ein Skalierungsfaktor, der ist systemabhängig und Faktoren in Variablen z. B. elektrodengröße Lückengröße und Biofilm-Höhe. Für bestimmte Systeme kann S aus vorgegebenen Gleichungen bestimmt werden. 31 Alternativ kann S mit berechnet werden numerisch eine Modelling-Software, wie zuvor. 17
</li>
		<li>Subtrahieren Sie die Hintergrund-Strömungen um die Form und den Umfang der durchgeführten aktuellen zu identifizieren. Entweder ziehen Sie am VSD erzeugten Strom = 0.00 V aus dem aktuellen generiert bei VSD = 0,01 V oder Subtrahieren der Drain-Strom aus der aktuellen Quelle generiert mit einer V-SD = 0,01 V. entweder Methode entfernt Hintergrund Strömungen, so dass nur die durchgeführte aktuelle.</li>
	</ol></li>
	<li>Abhängige elektrochemische gating Temperaturmessungen
	<ol>
<li>Ermitteln der Temperatur von Interesse. Dieser Bereich ist stark abhängig von das System untersucht, jedoch physiologisch relevante Temperaturen verwendet werden soll. Hinweis: Frühere Studien haben einen Temperaturbereich von 10 ° C bis 30 ° C verwendet, Elektronentransport unter physiologisch relevanten Bedingungen für mesophile Mikroorganismen zu studieren. 17
</li>
		<li>Erhalten Sie einen umlaufenden Wasserbad oder Inkubator, Reaktortemperatur und eine Kontrolle-Reaktor um sicherzustellen, dass die soll- und ist-Temperatur des Mediums ist dasselbe zu regulieren.<ol>
<li>Legen Sie ein Thermometer oder Thermoelement in einem Reaktor Kontrolle wo wäre die IDA.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Mache ichSD -Messungen (siehe 3.1.4) über die Strecke der Temperaturen unter Umsatz ausgewählt und Nonturnover (siehe Schritt 3.1.5) Bedingungen der Bipotentiostat Anschluss an eines der beiden nachstehend beschriebenen Verfahren verwenden.<ol>
<li>Generieren Sie ichSD vs. E-G -Kurven, wie beschrieben (siehe 3.1), für jede Temperatur über den Temperaturbereich von Interesse. Für Materialien aufweisen, Redox, Leitfähigkeit, wie z. B. G. Sulfurreducens und Biocathode MCL, der Spitzenstrom von jeder Temperatur dient zur Bestimmung der ISD vs. T-Abhängigkeit. Hinweis: Diese Methode wird verwendet, um eine vollständige generieren, die ichSD vs. EG für jede Temperatur-Kurve, die aber erfordert mehr Zeit als die zweite Option.</li>
			<li>Alternativ gesetzt und halten die IDA an der Pforte potenzielle, die maximale durchgeführt ergibt aktuelle mit der Bipotentiostat (gewonnen aus dem i.SD Vs E-G -Kurve, Schritt 3.1.4) und notieren Sie den Maximalstrom durchgeführten mit dem Bipotentiostat während die Temperatur ist zwischen dem Bereich des gewählten mit den integrierten Steuerelementen Wasserbad oder Inkubator Temperaturen radelte. Hinweis: mit der Elektrode/reaktorgeometrie verwendet hier die ichSD und T dürfen für mindestens 20 min und einem Durchschnitt stabil ichSD zu stabilisieren ist für jede Temperatur verwendet. Mehr oder weniger evtl. Stabilisierungszeit auf Basis des spezifischen Systems. Diese Methode ist schneller als die erste und verursacht weniger Stress auf den Biofilm. Volle gating Kurven werden jedoch nicht generiert.</li>
			<li>Zyklus die Temperatur von einem Satz Punkt zum anderen und zurück, wieder mit den integrierten Steuerelementen des Inkubators oder im Wasserbad die Reversibilität der Reaktion um sicherzustellen, dass die Temperatur zu bestimmen Radfahren schadet nicht den Biofilm.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Die Temperatur auf das normale Wachstum Temperatur mit den integrierten Steuerelementen Inkubator oder Wasserbad zurückgesetzt und lassen Sie das System zu stabilisieren. Hinweis: Für eine Redox-Dirigent kann ichSD gegen 1/T Daten mit der Arrhenius-Rate-Ausdruck fit sein ermöglicht die Berechnung der Aktivierungsenergie wie folgt: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/54671/54671eq5.jpg"> <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/54671/54671eq6.jpg"> wo ist Eeine Aktivierungsenergie für Elektronentransfer zwischen benachbarten Redox Cofaktoren und k die Boltzmann-Konstante.</li>
	</ol></li>
</ol>

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Während der Einrichtung der IDA ist es wichtig zu überprüfen, ob die Quelle und den Abfluss nicht zusammen vor dem elektrochemischen gating Messungen kurzgeschlossen werden da dies ändert die ichSD vs. E-G -Kurve und zu falschen Ergebnissen und Interpretationen führen könnte. Es ist auch entscheidend für VSD und v wählen, so dass der Strom linear abhängig VSD und unabhängig von v ist. Wenn dies nicht der Fall ist, können nicht die oben beschriebenen Gleichungen genutzt werden, ...

Extrazelluläre Elektronentransport (EET) ist ein Prozess, der bestimmte Mikroorganismen ermöglicht zu transportieren Elektronen zwischen intrazellulären Stoffwechselprozessen und unlöslichen Elektronen Akzeptoren oder Spender, die sich außerhalb der Zelle, von natürlichen Mineralien, bis hin zu befinden Elektroden. In einigen Fällen kann EET Mikroorganismen zu elektrisch leitfähigen multizelle dicken Biofilme auf Elektrodenflächen, bilden die Zellen nicht in direktem Kontakt mit der Elektrode immer noch es als metabolische Elektron Akzeptor oder Spender nutzen können. Gibt es erhebliches Interesse an solchen Biofilmen als Elektrode Katalysatoren für verschiedene Anwendungen, wie z. B. mikrobiellen Electrosynthesis, Schadstoff sensing/Entfernung, und remote Energieerzeugung und Speicherung,7,8,9 ,10,11,12,13,14 aufgrund der Vielfalt der Stoffwechselvorgänge von Mikroorganismen und die Haltbarkeit der mikrobielle Biofilme im Vergleich durchgeführt auf Enzymbasis Bioelectrodes. 15 , 16 außerdem EET Wege können potenziell auf elektrisch Kontrolle oder Signal Veränderungen in natürlich vorkommenden genutzt werden oder mikrobiellen Stoffwechselvorgängen beteiligt, zum Beispiel in der Produktion eines gewünschten Produkts oder Detektion gentechnisch ein Ziel Analyten oder Anregung. Die elektrische Leitfähigkeit des elektrokatalytische Biofilme, die sie von anderen biologischen Materialien unterscheidet, ist ein zentraler Aspekt ihrer elektrokatalytische Eigenschaften, doch ist wenig über den zugrunde liegenden EET-Prozess in der Elektrode Umwelt verstanden, und das, was bekannt ist ist stark umkämpft. 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24
Hier beschrieben ist eine 2-Elektroden-Methode zur Messung der Leitfähigkeit durch lebendige, Elektrode angebautes Biofilme über die Elektroden (IDAs). IDAs bestehen aus parallelen rechteckige Elektroden auf Flachglas Oberfläche gemustert, so dass jede andere Band an gegenüberliegenden Seiten des Array resultierenden verbunden ist in 2 Elektroden (Source und Drain). Sorgfältiger Prüfung eine IDA zeigt (siehe zum Beispiel Abbildung 6.12b der Ref #1), dass die Lücken, die Trennung von benachbarten Bands auch eine einzige Lücke in solch eine Weise hinsichtlich Form verbunden, die hin und her über das Array trennen die beiden Elektroden webt. Das Ergebnis ist eine lange und schmale Kluft zwischen Source und Drain Elektroden, sehr hohe Source-Drain-Ströme nachgeben, wenn ein leitendes Material gebildet, gegossen, polymerisiert oder das Array (im Falle der Art von Biofilmen hier betrachteten) gewachsen. Darüber hinaus führt die geringe Größe der Elektroden im kleinen Hintergrund aktuelle Kapazität aufgeladen und in Oxidationsstufe des leitenden Materials mit Tor Potenzial zu ändern, da die Menge des Materials erforderlich, um die Leitfähigkeit zu machen Messungen mit IDAs ist so klein. Die Technik der IDA-basierte beschriebenen elektrochemischen Anspritzung entwickelt, um Dünnschicht leitfähigen Polymeren zu charakterisieren,2,3,4,25 wurde erst vor kurzem auf lebende Systeme angewendet. 18 eine andere Technik zur Messung der Leitfähigkeit von Biofilmen leben verwendet eine großformatige split Source und Drain Elektroden und Quelle Metern das Tor potenzielle festlegen. 26 , 27 jedoch haben Bedenken im Hinblick auf diese Methoden vorher detailliert wurde. 18
Das Protokoll unten kapselt unsere Erfahrung mit Messungen der Leitfähigkeit des Lebens Geobacter Sulfurreducens und Biocathode MCL Biofilmen. G. Sulfurreducens ist ein Modell-Elektrode reduziert Organismus unlösliche Materialien, einschließlich Elektroden, als den alleinigen metabolische Elektron Akzeptor verwenden. Darüber hinaus bildet es dicken Biofilme, die in der Lage, Elektronen über mehrere Zelle Längen, so dass es eine ideale Modellorganismus anodische Fernverkehr extrazelluläre Elektronentransfer studieren zu transportieren sind. Wir berücksichtigen auch Details für das Studium der Biocathode MCL, eine aerobic, autotroph gemischte Gemeinde Biofilm isoliert von der Kathode einer benthische mikrobielle Brennstoffzelle. Biocathode MCL (benannt nach den drei primäre Bestandteile – Marinobacter, Chromatiaceaea und Labrenzia) ist in der Lage, eine Elektrode als seinen alleinigen Elektron Spender oxidiert und den Transport von Elektronen über mehrere Zelle Längen machen es ein interessantes kathodischen System zu studieren. Darüber hinaus hat Biocathode MCL gemeldeten höchste Leitfähigkeit für ein lebendiges System bis dato mit diesen Methoden. Die Einbeziehung von diesen vielfältigen Elektroaktive Biofilmen in diesem Protokoll soll darauf hinweisen, dass diese Technik für den Transport von Elektronen durch jede lebende Biofilm mit Elektroden elektrisch interagieren zu messen gilt.

<table><tbody><tr><td>IDAs</td><td>CH Instruments</td><td>012125</td><td>Hergestellt von ALS-Japan; verkauft von CH Instruments</td></tr><tr><td>Draht</td><td>Digikey</td><td>W7-ND</td><td></td></tr><tr><td>Leitfähiges Silber-Epoxid</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>Sciences 12670-EE</td><td></td></tr><tr><td>Isoliermaterial</td><td>3M</td><td>2131-B</td><td>Scotchast flammhemmende Verbindung</td></tr><tr><td>15 mL konisches Zentrifugenröhrchen</td><td>VWR</td><td>89004-368</td><td></td></tr><tr><td>21 g Nadel</td><td>VWR</td><td>BD-305165</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pipettenspitzen</td><td>VWR</td><td>82018-842</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pipette</td><td>VWR</td><td>89079-976</td><td></td></tr><tr><td>Süßwasser Medium Komponenten</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Alle gängigen Laborchemikalien</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; Ammoniumchlorid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; Natriumphosphat monobasisch</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; Natriumbicarbonat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Künstliche Bestandteile des Meerwassermediums</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Alle gängigen Laborchemikalien</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; Natriumchlorid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; Magnesiumchlorid-Hexahydrat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; Magnesiumsulfat-Heptahydrat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; Kaliumchlorid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; Natriumbicarbonat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; Calciumchlorid-Dihydrat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; Ammoniumchlorid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; Kaliumphosphat dibasische</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ag/AgCl-Referenzelektrode</td><td>Basi</td><td>MF-2079</td><td></td></tr><tr><td>Graphitstab-Gegenelektrode</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaft</td><td>70230</td><td></td></tr><tr><td>Zirkulierendes Wasserbad</td><td>Thermo Scientific</td><td>152-5256</td><td></td></tr><tr><td>Bipotentiostat</td><td>Kiefer Instrumente</td><td>WD-20</td><td>http://www.voltammetry.net/pine/aftermath/user</td></tr><tr><td>Rührstäbchen</td><td>VWR</td><td>58947-114</td><td></td></tr><tr><td>G. Schwefelreducens Kultur</td><td>ATCC</td><td>51573</td><td></td></tr><tr><td>Ummantelter Reaktor</td><td>Pine Instruments</td><td>RRPG085</td><td></td></tr></tbody></table>

charakterisierung von elektronentransport durch lebende biofilme

Characterizing Electron Transport through Living Biofilms

Hier zeigen wir die Methode der elektrochemischen gating verwendet, um elektrische Leitfähigkeit der Elektrode angebautes mikrobielle Biofilme unter physiologisch relevanten Bedingungen zu charakterisieren. 1 diese Messungen werden durchgeführt auf lebende Biofilmen im wässrigen Medium mit Quelle und abtropfen lassen Elektroden gemustert auf einer Glasoberfläche in einer speziellen Konfiguration als Array die Elektrode (IDA) bezeichnet. Ein Biofilm wird angebaut, die durch die Lücke zwischen Source und Drain erstreckt. Potentiale gelten für die Elektroden (ES und E-D) erzeugen einen Source-Drain-Strom (ISD) durch den Biofilm zwischen den Elektroden. Die Abhängigkeit der elektrischen Leitfähigkeit auf Tor Potenzial (der Durchschnitt der Source und Drain Potenziale, EG = [ED + ES] / 2) ergibt sich aus systematisch verändert das Tor potenzielle und Messung der resultierenden Source-Drain aktuelle. Die Abhängigkeit der Leitfähigkeit auf Tor potenzielle informiert mechanistischen über den extrazellulären Elektronentransport-Prozess zugrunde liegt die elektrische Leitfähigkeit des spezifischen Biofilms untersucht. Die elektrochemische gating Messmethode, die hier beschriebenen basiert direkt auf, die von M. S. Wrighton2,3 und Kollegen und Kolleginnen und Kollegen im R. W. Murray4,5,6 verwendet die 1980's, um Dünnschicht-leitfähige Polymere zu untersuchen.

IDAs wurden verdrahtet, isoliert und getestet, um sicherzustellen, dass die beiden Elektroden elektrisch isoliert voneinander unterscheiden (Abbildung 1). Reaktoren wurden montiert, mit G. Sulfurreducensbeimpft und inkubiert, bis ein Biofilm die Lücke zwischen den Elektroden überbrückt. G. Sulfurreducens Biofilm sieht optisch das Array abdecken. Andere Biofilme kann verlangen, dass den Forscher dazu eine elektrochemische gating Messungen zu ...

Ein Protokoll zur Messung der elektrischen Leitfähigkeit von lebenden mikrobielle Biofilme unter physiologisch relevanten Bedingungen wird vorgestellt.

Charakterisierung von Elektronentransport durch lebende Biofilme

Here we demonstrate the method of electrochemical gating used to characterize electrical conductivity of electrode-grown microbial biofilms under ...

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Verfahrens ist es, die Strommenge zu bestimmen, die durch ein lebendes Material in situ geleitet werden kann, sowie den Mechanismus, den das lebende Material zum Transport des Stroms einsetzt. Diese Methode könnte dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der mikrobiellen Elektrochemie zu beantworten, wie zum Beispiel: Wie können bestimmte Biofilme Elektronen über Hunderte von Mikrometern bewegen, um den Zellstoffwechsel zu unterstützen? Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die interdigitalisierten Elektroden ein sehr hohes Signal-Rausch-Verhältnis aufweisen und so skaliert werden können, dass sie in viele verschiedene Reaktorkonfigurationen passen.Diese Methoden können Einblicke in den extrazellulären Elektronentransport von mehreren Zellen in Biofilmen geben. Es kann auch auf andere Systeme angewendet werden, wie z. B. elektrisch leitfähige Polymerfolien. Forscher, die neu in dieser Methode sind, werden Schwierigkeiten haben, da sie einen Bipotentiostaten benötigt, um die Potentiale beider Elektroden getrennt einzustellen und den Strom an jeder Elektrode separat zu messen.Besorgen Sie sich zunächst kommerziell erhältliche IDA-Elektroden, die auf einem nichtleitenden Substrat strukturiert sind, oder synthetisieren Sie sie mit lithographischen Standardmethoden. Bereiten Sie leitfähiges Silberepoxidharz gemäß den Anweisungen des Herstellers mit einem Mischstab oder einer Pipettenspitze vor. Legen Sie dann einen Draht auf jedes Goldpad und befestigen Sie sie mit Laborklebeband.Decken Sie den Draht und das Pad mit einem Mischstab oder einer Pipettenspitze mit silbernem Epoxidharz ab. Stellen Sie das Gerät vorsichtig für eine Stunde zum Aushärten in einen 80 Grad Celsius heißen Ofen. Nachdem das Epoxidharz ausgehärtet ist, verwenden Sie ein Multimeter, um die elektrische Leitfähigkeit zwischen dem Ende des Drahtes und den Pads sicherzustellen.Der Widerstand zwischen dem Draht und den Pads sollte weniger als fünf Ohm betragen. Verwenden Sie außerdem das Multimeter, um sicherzustellen, dass kein leitfähiges Epoxidharz mehrere Elektrodenpads verbindet, da dies das Array kurzschließen kann. Wenn leitfähiges Epoxidharz mehrere Leitungen verbindet, verwenden Sie den Anreißer, um die Leitungen zu isolieren.Entfernen Sie anschließend die Spitze eines konischen 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchens, um es als Form für das Isoliermaterial zu verwenden. Verwende eine 21-Gauge-Nadel, um zwei kleine Löcher in den Boden der Form zu bohren, durch die die Drähte herausragen können. Führen Sie die IDA in die Form ein und führen Sie die Drähte durch die Löcher im Boden der Form.Bereiten Sie als Nächstes ein thermisches, elektrisches und wasserdichtes Isoliermaterial vor. Häufig eignen sich schwer entflammbare Polyurethanharze. Pipettieren Sie den Isolator in die Form, so dass das Silberepoxidharz vollständig bedeckt ist, und lassen Sie den Isolator gemäß den Herstellerangaben trocknen.Um die elektrochemische Zelle einzurichten, setzen Sie die IDA, die Gegenelektrode und die Referenzelektrode in die elektrochemische Zelle ein. Füllen Sie die elektrochemische Zelle mit sterilem Medium, das für das Biofilmwachstum geeignet ist. Für Geobacter sulfurreducens ist ein Süßwassermedium ohne Fumarat zu verwenden.Verbinden Sie anschließend die Elektroden mit einem Bipotentiostaten. Verbinden Sie eine IDA-Elektrode mit der Arbeitsleitung eins, die andere IDA-Elektrode mit der Arbeitsleitung zwei, die Referenzelektrode mit der Referenzleitung und die Gegenelektrode mit der Gegenleitung. Führen Sie ein Kontrollexperiment durch, indem Sie eine zyklische Voltammetrie an der ersten Elektrode durchführen und die zweite Elektrode in den offenen Stromkreis halten, um sicherzustellen, dass die Elektroden nicht angeschlossen sind.Um den relevanten elektroaktiven Biofilm zu züchten, inokulieren Sie den elektrochemischen Reaktor aus einer Stammkultur oder einer Anreicherung der gewünschten elektrochemisch aktiven Mikroorganismen unter Verwendung aseptischer mikrobiologischer Standardtechniken. Für Standardtests ist das Inokulum-Reaktor-Volumen in einem Verhältnis von 1 zu 20 zu impfen. Stellen Sie das Rühren im Reaktor auf das gewünschte Niveau ein und stellen Sie den Inkubator oder das Wasserbad auf die gewünschte Temperatur ein, basierend auf den Wachstumsbedingungen des interessierenden Biofilms.Inkubieren Sie das System basierend auf den spezifischen Anforderungen des interessierenden Mikroorganismus, bis der Biofilm die Lücke zwischen den beiden Elektroden überbrückt. Bei stationärem Geobacter sulfurreducens Biofilm sieben bis zehn Tage bei 30 Grad Celsius inkubieren. Beginnen Sie mit der Einrichtung der experimentellen Parameter, die zur Bestimmung der Strompotentialabhängigkeit für die Gating-Messungen verwendet werden, wie im Textprotokoll beschrieben.Richten Sie die Bipotentiostat-Software so ein, dass die Gating-Messungen über den ausgewählten Bereich bei der ausgewählten Source-Drain-Spannung und der gewünschten Abtastrate durchgeführt werden. Führen Sie zusätzlich eine Basismessung durch, wie im Textprotokoll beschrieben. Gating-Messungen werden unter den gleichen Bedingungen unter den Bedingungen des Umsatzes mit einem löslichen Elektronendonor oder -akzeptor durchgeführt, der ohne den Zustand eines löslichen Elektronendonors oder -akzeptors ohne Umsatz vorhanden ist.Besorgen Sie sich eine Regeldrossel, um sicherzustellen, dass der Sollwert und die tatsächliche Temperatur des Mediums gleich sind. Platzieren Sie ein Thermometer oder ein Thermoelement in einer Regeldrossel, in der sich der IDA befinden würde. Führen Sie dann mit dem Bipotentiostaten Messungen des Quelldehnungsstroms über den Temperaturbereich durch, der unter Umsatz- und Nichtumsatzbedingungen ausgewählt wurde.Stellen Sie dazu den IDA mit dem Bipotentiostaten auf das Gate-Potential ein und halten Sie es fest, das den maximalen leitungsgebundenen Strom liefert. Zeichnen Sie den maximal leitungsgebundenen Strom mit dem Bipotentiostaten auf, während die Temperatur zwischen dem Temperaturbereich geschaltet wird, der mit den integrierten Reglern des Wasserbads oder des Inkubators ausgewählt wurde. Schalten Sie die Temperatur von einem Sollwert zum anderen und wieder zurück, indem Sie die integrierten Bedienelemente des Inkubators oder des Wasserbads verwenden.Dadurch wird die Reversibilität der Reaktion bestimmt, um sicherzustellen, dass der Temperaturzyklus den Biofilm nicht schädigt. Setzen Sie abschließend die Temperatur wieder auf die normale Wachstumstemperatur zurück und lassen Sie das System stabilisieren. Hier sind repräsentative Ergebnisse einer IDA zu sehen, die im Süßwassermedium einwandfrei funktioniert.Im Gegensatz zu einem, bei dem die Elektroden kurzgeschlossen wurden. Repräsentative elektrochemische Gating-Messungen, die an einem Geobacter-Schwefelreduktions-Biofilm unter Nicht-Umsatzbedingungen mit einer Quelldehnungsspannung von 10 Millivolt durchgeführt wurden, zeigen die für die Redoxleitfähigkeit charakteristische spitzenförmige leitungsgebundene Strom-Gate-Potential-Kurve. Hier zeigen repräsentative Rohdaten die Abhängigkeit des leitungsgebundenen Stroms von der Temperatur des Reaktormediums.Die Abnahme des leitungsgebundenen Stroms mit abnehmender Temperatur ist ein weiteres Merkmal von Redoxleitern. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa zwei Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, darauf zu achten, dass die IDA-Bänder vor der Inokulation des Reaktors nicht kurzgeschlossen werden.Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie, wenn sie angewendet wird, um zu untersuchen, wie der zelluläre Stoffwechsel von biofilmbildenden Krankheitserregern gestört werden kann. Dieses Verfahren kann auf jedes lebende Material angewendet werden, das in der Lage ist, Elektronen zu transportieren, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Korrelation zwischen Biofilmrefologie und Leitfähigkeit.

characterizing-electron-transport-through-living-biofilms

Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

Quelle: Tokunou, Y. et al., Elektrochemische Detektion des Deuterium-kinetischen Isotopeneffekts auf den extrazellulären Elektronentransport in Shewanella oneidensis MR-1. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video demonstriert den Zusammenbau und Betrieb eines elektrochemischen Reaktormodells, das zur Simulation der Biofilmbildung auf Elektrodenoberflächen entwickelt wurde. Kontrollierte elektrochemische Stimulation fördert die mikrobielle Adhäsion, was zur allmählichen Entwicklung eines bakteriellen...

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Charakterisierung von Elektronentransport durch lebende Biofilme

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