Charakterisierung von Elektronentransport durch lebende Biofilme

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Verfahrens ist es, die Strommenge zu bestimmen, die durch ein lebendes Material in situ geleitet werden kann, sowie den Mechanismus, den das lebende Material zum Transport des Stroms einsetzt. Diese Methode könnte dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der mikrobiellen Elektrochemie zu beantworten, wie zum Beispiel: Wie können bestimmte Biofilme Elektronen über Hunderte von Mikrometern bewegen, um den Zellstoffwechsel zu unterstützen? Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die interdigitalisierten Elektroden ein sehr hohes Signal-Rausch-Verhältnis aufweisen und so skaliert werden können, dass sie in viele verschiedene Reaktorkonfigurationen passen.

Diese Methoden können Einblicke in den extrazellulären Elektronentransport von mehreren Zellen in Biofilmen geben. Es kann auch auf andere Systeme angewendet werden, wie z. B. elektrisch leitfähige Polymerfolien. Forscher, die neu in dieser Methode sind, werden Schwierigkeiten haben, da sie einen Bipotentiostaten benötigt, um die Potentiale beider Elektroden getrennt einzustellen und den Strom an jeder Elektrode separat zu messen.

Besorgen Sie sich zunächst kommerziell erhältliche IDA-Elektroden, die auf einem nichtleitenden Substrat strukturiert sind, oder synthetisieren Sie sie mit lithographischen Standardmethoden. Bereiten Sie leitfähiges Silberepoxidharz gemäß den Anweisungen des Herstellers mit einem Mischstab oder einer Pipettenspitze vor. Legen Sie dann einen Draht auf jedes Goldpad und befestigen Sie sie mit Laborklebeband.

Decken Sie den Draht und das Pad mit einem Mischstab oder einer Pipettenspitze mit silbernem Epoxidharz ab. Stellen Sie das Gerät vorsichtig für eine Stunde zum Aushärten in einen 80 Grad Celsius heißen Ofen. Nachdem das Epoxidharz ausgehärtet ist, verwenden Sie ein Multimeter, um die elektrische Leitfähigkeit zwischen dem Ende des Drahtes und den Pads sicherzustellen.

Der Widerstand zwischen dem Draht und den Pads sollte weniger als fünf Ohm betragen. Verwenden Sie außerdem das Multimeter, um sicherzustellen, dass kein leitfähiges Epoxidharz mehrere Elektrodenpads verbindet, da dies das Array kurzschließen kann. Wenn leitfähiges Epoxidharz mehrere Leitungen verbindet, verwenden Sie den Anreißer, um die Leitungen zu isolieren.

Entfernen Sie anschließend die Spitze eines konischen 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchens, um es als Form für das Isoliermaterial zu verwenden. Verwende eine 21-Gauge-Nadel, um zwei kleine Löcher in den Boden der Form zu bohren, durch die die Drähte herausragen können. Führen Sie die IDA in die Form ein und führen Sie die Drähte durch die Löcher im Boden der Form.

Bereiten Sie als Nächstes ein thermisches, elektrisches und wasserdichtes Isoliermaterial vor. Häufig eignen sich schwer entflammbare Polyurethanharze. Pipettieren Sie den Isolator in die Form, so dass das Silberepoxidharz vollständig bedeckt ist, und lassen Sie den Isolator gemäß den Herstellerangaben trocknen.

Um die elektrochemische Zelle einzurichten, setzen Sie die IDA, die Gegenelektrode und die Referenzelektrode in die elektrochemische Zelle ein. Füllen Sie die elektrochemische Zelle mit sterilem Medium, das für das Biofilmwachstum geeignet ist. Für Geobacter sulfurreducens ist ein Süßwassermedium ohne Fumarat zu verwenden.

Verbinden Sie anschließend die Elektroden mit einem Bipotentiostaten. Verbinden Sie eine IDA-Elektrode mit der Arbeitsleitung eins, die andere IDA-Elektrode mit der Arbeitsleitung zwei, die Referenzelektrode mit der Referenzleitung und die Gegenelektrode mit der Gegenleitung. Führen Sie ein Kontrollexperiment durch, indem Sie eine zyklische Voltammetrie an der ersten Elektrode durchführen und die zweite Elektrode in den offenen Stromkreis halten, um sicherzustellen, dass die Elektroden nicht angeschlossen sind.

Um den relevanten elektroaktiven Biofilm zu züchten, inokulieren Sie den elektrochemischen Reaktor aus einer Stammkultur oder einer Anreicherung der gewünschten elektrochemisch aktiven Mikroorganismen unter Verwendung aseptischer mikrobiologischer Standardtechniken. Für Standardtests ist das Inokulum-Reaktor-Volumen in einem Verhältnis von 1 zu 20 zu impfen. Stellen Sie das Rühren im Reaktor auf das gewünschte Niveau ein und stellen Sie den Inkubator oder das Wasserbad auf die gewünschte Temperatur ein, basierend auf den Wachstumsbedingungen des interessierenden Biofilms.

Inkubieren Sie das System basierend auf den spezifischen Anforderungen des interessierenden Mikroorganismus, bis der Biofilm die Lücke zwischen den beiden Elektroden überbrückt. Bei stationärem Geobacter sulfurreducens Biofilm sieben bis zehn Tage bei 30 Grad Celsius inkubieren. Beginnen Sie mit der Einrichtung der experimentellen Parameter, die zur Bestimmung der Strompotentialabhängigkeit für die Gating-Messungen verwendet werden, wie im Textprotokoll beschrieben.

Richten Sie die Bipotentiostat-Software so ein, dass die Gating-Messungen über den ausgewählten Bereich bei der ausgewählten Source-Drain-Spannung und der gewünschten Abtastrate durchgeführt werden. Führen Sie zusätzlich eine Basismessung durch, wie im Textprotokoll beschrieben. Gating-Messungen werden unter den gleichen Bedingungen unter den Bedingungen des Umsatzes mit einem löslichen Elektronendonor oder -akzeptor durchgeführt, der ohne den Zustand eines löslichen Elektronendonors oder -akzeptors ohne Umsatz vorhanden ist.

Besorgen Sie sich eine Regeldrossel, um sicherzustellen, dass der Sollwert und die tatsächliche Temperatur des Mediums gleich sind. Platzieren Sie ein Thermometer oder ein Thermoelement in einer Regeldrossel, in der sich der IDA befinden würde. Führen Sie dann mit dem Bipotentiostaten Messungen des Quelldehnungsstroms über den Temperaturbereich durch, der unter Umsatz- und Nichtumsatzbedingungen ausgewählt wurde.

Stellen Sie dazu den IDA mit dem Bipotentiostaten auf das Gate-Potential ein und halten Sie es fest, das den maximalen leitungsgebundenen Strom liefert. Zeichnen Sie den maximal leitungsgebundenen Strom mit dem Bipotentiostaten auf, während die Temperatur zwischen dem Temperaturbereich geschaltet wird, der mit den integrierten Reglern des Wasserbads oder des Inkubators ausgewählt wurde. Schalten Sie die Temperatur von einem Sollwert zum anderen und wieder zurück, indem Sie die integrierten Bedienelemente des Inkubators oder des Wasserbads verwenden.

Dadurch wird die Reversibilität der Reaktion bestimmt, um sicherzustellen, dass der Temperaturzyklus den Biofilm nicht schädigt. Setzen Sie abschließend die Temperatur wieder auf die normale Wachstumstemperatur zurück und lassen Sie das System stabilisieren. Hier sind repräsentative Ergebnisse einer IDA zu sehen, die im Süßwassermedium einwandfrei funktioniert.

Im Gegensatz zu einem, bei dem die Elektroden kurzgeschlossen wurden. Repräsentative elektrochemische Gating-Messungen, die an einem Geobacter-Schwefelreduktions-Biofilm unter Nicht-Umsatzbedingungen mit einer Quelldehnungsspannung von 10 Millivolt durchgeführt wurden, zeigen die für die Redoxleitfähigkeit charakteristische spitzenförmige leitungsgebundene Strom-Gate-Potential-Kurve. Hier zeigen repräsentative Rohdaten die Abhängigkeit des leitungsgebundenen Stroms von der Temperatur des Reaktormediums.

Die Abnahme des leitungsgebundenen Stroms mit abnehmender Temperatur ist ein weiteres Merkmal von Redoxleitern. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa zwei Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, darauf zu achten, dass die IDA-Bänder vor der Inokulation des Reaktors nicht kurzgeschlossen werden.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie, wenn sie angewendet wird, um zu untersuchen, wie der zelluläre Stoffwechsel von biofilmbildenden Krankheitserregern gestört werden kann. Dieses Verfahren kann auf jedes lebende Material angewendet werden, das in der Lage ist, Elektronen zu transportieren, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Korrelation zwischen Biofilmrefologie und Leitfähigkeit.