High-Plex-Bildgebung mittels spektral-konfokaler Mikroskopie zur Minimierung unspezifischer Gewebefluoreszenz

Wir optimieren einen IBEX-Workflow, der Heparinblockierung und spektrale Detektion kombiniert, um den Hintergrund in eosinophilreichem menschlichen Gewebe zu unterdrücken. Autofluoreszenz und Eosinophil-Granulärbindung verdecken das wahre Signal. Wir zielen auf beide ab, um saubere High-Plex-Maps zu ermöglichen.

Zu Beginn zeichnen Sie mit einem Pap-Pen einen Kreis auf dem Glasschlitze um das montierte Taschentuch, um eine hydrophobe Barriere zu schaffen. Geben Sie etwa 100 Mikroliter PBS zu jedem Gewebe, um es wieder zu hydratisieren, und inkubieren Sie den Objektträger etwa zwei Minuten bei Raumtemperatur, um die optimale Schnitttemperatur abzuwaschen. Saugen Sie das PBS aus dem Gewebe mit einer Pasteur-Saugglaspipette ab.

Dann gib jedem Gewebe 100 Mikroliter Blockpuffer hinzu und inkubiere bei Zimmertemperatur in einer Feuchtigkeitskammer eine Stunde. Jetzt aspirieren Sie den Blockpuffer mit einer Pipette. Fügen Sie jedem Gewebe 100 Mikroliter Färbung hinzu und brüten Sie das Objektträger über Nacht in einer überdachten Feuchtigkeitskammer in einem Kühlschrank bei vier Grad Celsius aus.

Ebenso wird Schnitt mit nur einem Fluorophor und einer Negativkontrolle ohne Färbung hergestellt, um das Fluorophor-Spektrum und die Gewebeautofluoreszenz zu definieren. Nach dem Aspirieren der Färbungsmischung das Gewebe dreimal mit PBS waschen und nach jedem Waschen die Flüssigkeit einsaugen. Stellen Sie die Probe für Bildgebung am Mikroskop fest.

Fokussiere dich auf die Probe mit Hellfeld- oder differentiellem Interferenzkontrastmodus. Dann wechselt man in den Fluoreszenzmodus und konfiguriert die spektralen Erfassungsparameter entsprechend den experimentellen Anforderungen. Weisen Sie den im Experiment verwendeten Fluorophoren die passenden Laser zu.

Wählen Sie einen Strahlteiler, der den gewählten Laserlinien entspricht. Ermöglichen Sie allen Detektoren, das gesamte Emissionsspektrum zu erfassen, und stellen Sie die Bildauflösung auf eine der vordefinierten Auflösungen an. Oder wähle die maximale Auflösung.

Passen Sie die Lochgröße auf eine Flächeneinheit an, um eine optimale optische Schnittung zu gewährleisten. Optimieren Sie die Lasereinstellungen vor der Aufnahme. Mit einem mit allen Markern gefärbten Abschnitt starten Sie den kontinuierlichen Scan-Modus bei niedriger Laserleistung.

Passen Sie die Masterverstärkung sowie die Laserintensitäten jedes Detektors an, bis alle Marker mit einem guten Signal-Hintergrund-Verhältnis identifiziert werden. Feinjustieren Sie die Laserintensitäten und wechseln Sie iterativ zwischen Einzel- und Mehrfärbungsabschnitten, bis alle Fluorophorsignale ohne Übersättigung sichtbar sind. Aktivieren Sie die Kachelfunktion in der Erfassungssoftware und definieren Sie die Kachelaufnahmeregion um das Gewebe, um eine vollständige Bildabdeckung sicherzustellen.

Optimieren Sie den Fokus für die Kachelaufnahmeregion im Zentrum des Gewebes. Identifizieren Sie ein einzigartiges strukturelles Merkmal, wie zum Beispiel eine bestimmte Gruppe von Zellen in einer erkennbaren Anordnung, die als Referenz für die Ausrichtung in späteren Bildaufnahmen dient. Aktivieren Sie nun die Z-Stack-Funktion und navigieren Sie zum Z-Stack-Tab.

Unter dem Mittel-Tab stellen Sie die Anzahl der Schnitte auf mindestens sechs mit einem Abstand von mindestens einem Mikrometer zwischen den Schnitten. Klicken Sie auf die mittlere Taste, um den aktuellen Fokuspunkt, der im vorherigen Schritt bestimmt wurde, als mittleren Schnitt des Stapels einzustellen. Klicken Sie auf den Start-Experiment-Button, um die Bildaufnahme zu starten.

Sobald die Aufnahme abgeschlossen ist, klicke mit der rechten Maustaste auf das Bild-Thumbnail, wähle 'Speichern unter'. Wähle einen Dateistandort und benennen Sie das Bild. Sichere die Bilddaten in einen sicheren Speicher. Entmischen Sie das Bild mit denselben optimierten Einstellungen, die während der Kachel-Region-Erfassung angewendet werden.

Nehmen Sie einen Schnappschuss von jeder einzeln gefärbten Kontrolle auf, um das wahre Signalspektrum zu erhalten, und von der ungefärbten Kontrolle, um Hintergrund- oder Autofluoreszenz zu erfassen. Verwenden Sie diese Bilder ausschließlich für das spektrale Entmischen. Bestätigen Sie, dass die ausgewählte Region ein echtes Signal darstellt, indem Sie prüfen, ob Intensität und Morphologie fehlen oder den Hintergrundwerten der unverfärbten Kontrolle entsprechen und dass die Markerlokalisierung dem erwarteten zellulären Muster wie Membran-, Nuklear-, Zytoplasma- oder Sekretionsverteilung entspricht.

Öffne das Snap-Bild in der Software. Klicken Sie auf den Unmixing-Tab und wählen Sie eines der Regionsauswahlwerkzeuge unter dem Tab Unmixed Tools aus, zeichnen Sie eine Region von Interesse oder ROI um das positive Signal, um das Spektrum dieser Region zu generieren. Vergleichen Sie jedes erzeugte Spektrum mit dem theoretischen Emissionsspektrum des entsprechenden Fluorophors.

Stellen Sie sicher, dass der Bereich das wahre Signal genau repräsentiert. Benennen Sie jedes Spektrum nach der Identität des Fluorophors und speichern Sie es in der Spektraldatenbank. Lade als Nächstes das kachelte Bild und öffne das Entmisch-Werkzeug.

Verwenden Sie die Plus-Taste, um die Referenzspektren für jedes Fluorophor zur Entmischungsliste hinzuzufügen. Klicken Sie auf die lineare Entmischungs-Taste, um die spektralen Signale zu trennen und das ungemischte Bild zu speichern. Bereite die Bleichlösung in einer Abzugshaube vor.

Mit einem Mikrospatel wiegt man 10 Milligramm Lithiumborhydrid direkt in einen trockenen Becher. Geben Sie vorsichtig 10 Milliliter ultrareines Wasser in den Becher und rühren, bis die Verbindung vollständig gelöst ist. Geben Sie etwa 100 Mikroliter der frisch vorbereiteten Bleichlösung zu jedem Gewebeabschnitt mit einer Glas-Pasteur-Pipette und inkubieren Sie die Objektträger bei Raumtemperatur 15 Minuten im Dampfhaube.

Wenn Bleaching Brilliant Violet stirbt, übertrage den Objektträger vorsichtig auf ein Epifluoreszenzmikroskop und wähle den Suppy-Filter. Fokussiere die Probe und beleuchte sie mit voller Leistung. Verwenden Sie nun ein 5-faches Objektiv, um ein größeres Beleuchtungsfeld zu erzielen, und senken Sie die Stufe vollständig, um jeglichen Kontakt zwischen dem Schlitten und dem Objektiv oder dem Gehäuse zu verhindern.

Schließlich wird die Lithiumborhydridlösung aus jedem Bohrloch mit einer Glas-Pasteur-Pipette dekantiert und in den ursprünglichen Becher der Bleichlösung zurückgegeben. Waschen Sie die Objektträger dreimal mit einem Verdünnungspuffer und inkubieren Sie sie während jeder Wäsche etwa drei Minuten. Fügen Sie die Antikörpermischung hinzu und färben Sie die Probe, wie zuvor gezeigt.

Bei unbehandelten nasalen Polypenfärbungen mit CD3, CD4 und CD20 zeigten intensive nichtspezifische granulare Fluoreszenz in eosinophilreichen Regionen. Während das echte membranlokalisierte Signal bei geringerer Intensität vorhanden war. Die Vorbehandlung mit 5 % Magermilch konnte die unspezifische Fluoreszenz nicht vollständig blockieren und auch die Signalintensität für Fluorophore wie AF 532 verringern.

Die Dab-Vorbehandlung reduzierte die unspezifische Fluoreszenz von CD20, CD3 und CD4, verringerte aber auch die wahre Signalintensität über mehrere Kanäle, einschließlich DAPI und AF 532. Die Vorbehandlung mit Heparin blockierte effektiv die unspezifische Bindung, während die hohe Signalintensität für CD3, CD4, CD20 und DAPI aufrechterhalten wurde. Heparin blockierte ein unspezifisches Signal auf konzentrationsabhängige Weise mit vollständiger Unterdrückung bei 10 Einheiten und ohne nachteilige Effekte bei höheren Konzentrationen.

Ein dreispuriges Bildgebungssystem verkürzte die Aufnahmezeit, führte jedoch zu Crosstalk einschließlich Durchblendung von AF 594 in den PE-Kanal und verbesserter Gewebeautofluoreszenz durch mehrere Laseranregungen. Die spektrale Bildgebung eliminierte nahezu jegliches Hintergrund- und Übersprechen, verkürzte zudem die Aufnahmezeit und verbesserte das Signal-Hintergrund-Verhältnis. Die spektrale IBEX-Bildgebung eines menschlichen Nasenpolypen zeigte epitheliale Strukturen, die durch EpCAM markiert sind.

Immunzellen wie CD3-positive und CD20-positive Lymphozyten sowie Gefäße, die CD31 und CD34 exprimieren. Die Heparinbehandlung eliminierte die Granulationsbindung, ohne das Signal zu reduzieren, wodurch eine starke Hintergrundsuppression über IBEX-Zyklen hinweg aufrechterhalten wurde. Spektrales Entmischen minimiert Durchblenden, Autofluoreszenz erhöht das Signal zum Hintergrund und beschleunigt die Mehrfachaufnahme im Vergleich zu Mehrspur-Konfektions.

Dies ermöglicht eine robuste räumliche Proteomik und herausfordernde Gewebe, die eine genaue Zellzustandskartierung und Analyse auf Nachbarschaftsebene unterstützen.