Name: High-Plex-Bildgebung mittels spektral-konfokaler Mikroskopie zur Minimierung unspezifischer Gewebefluoreszenz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Erfahren Sie die optimierte IBEX-Workflow-Integration mit Heparin-Blocking und spektraler Detektion zur Unterdrückung unspezifischer Gewebefluoreszenz in eosinophilen humanen Geweben. Diese Methode ermöglicht präzise hochmultiplexe räumliche Proteomanalysen.

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<table><tbody><tr><td>2N-Schwefelsäure (H2SO4)-Lösung</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Was auch immer im Labor verfügbar oder verwendet wird</td></tr><tr><td>500-mL-Becher</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Was auch immer im Labor verfügbar oder verwendet wird</td></tr><tr><td>6-Well-Platte</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Was auch immer im Labor verfügbar oder verwendet wird</td></tr><tr><td>Bcl-6 - Alexa Fluor 647</td><td>BD Biosciences</td><td>561525</td><td>Verdünnungsfaktor 1:100</td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit</td><td>BD Biosciences</td><td>554722</td><td></td></tr><tr><td>Tisch-Sektionsmikroskop</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Was auch immer im Labor verfügbar oder verwendet wird</td></tr><tr><td>Rinderserum-Albumin (BSA)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>CD11c - Alexa Fluor 700</td><td>BD Biosciences</td><td>561352</td><td>Verdünnungsfaktor 1:100</td></tr><tr><td>CD138/Syndecan-1 - PE</td><td>BioLegend</td><td>356503</td><td>Verdünnungsfaktor 1:200</td></tr><tr><td>CD20 - Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>53020282</td><td>Verdünnungsfaktor 1:100</td></tr><tr><td>CD21 - Alexa Fluor 532</td><td>NovusBio</td><td>NBP2-60733AF532</td><td>Verdünnungsfaktor 1:100</td></tr><tr><td>CD23 - PE</td><td>BioLegend</td><td>338507</td><td>Verdünnungsfaktor 1:200</td></tr><tr><td>CD3 - iFluor 594</td><td>AAT Bioquest</td><td>100320C0</td><td>Verdünnungsfaktor 1:100</td></tr><tr><td>CD31 - Alexa Fluor 700</td><td>BioLegend</td><td>303134</td><td>Verdünnungsfaktor 1:100</td></tr><tr><td>CD34 - iFluor 594</td><td>AAT Bioquest</td><td>103400C0</td><td>Verdünnungsfaktor 1:100</td></tr><tr><td>CD38 - Alexa Fluor 700</td><td>BioLegend</td><td>303523</td><td>Verdünnungsfaktor 1:100</td></tr><tr><td>CD4 - Alexa Fluor 647</td><td>BioLegend</td><td>300520</td><td>Verdünnungsfaktor 1:100</td></tr><tr><td>CD45 - Alexa Fluor 532</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>58045942</td><td>Verdünnungsfaktor 1:100</td></tr><tr><td>CD54/ICAM-1 - Alexa Fluor 647</td><td>BioLegend</td><td>353113</td><td>Verdünnungsfaktor 1:100</td></tr><tr><td>Chrom-Alum-Gelatine-Klebstoff</td><td>Neuankömmling-Versorgung</td><td>1033A</td><td></td></tr><tr><td>Cryomold</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>NC9511236</td><td>Außerdem Katalognummer 50-465-347 für größere Samples</td></tr><tr><td>DAPI-Kalibrierungsfolie</td><td>Agar Scientific</td><td>AG2273</td><td></td></tr><tr><td>DAPI-Lösung, 1 mg/mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62248</td><td>Verdünnungsfaktor 1:3000</td></tr><tr><td>E-Cadherin/CD324 - Alexa Fluor 647</td><td>BioLegend</td><td>147307</td><td>Verdünnungsfaktor 1:100</td></tr><tr><td>EpCAM/CD326 - Alexa Fluor 594</td><td>BioLegend</td><td>324228</td><td>Verdünnungsfaktor 1:100</td></tr><tr><td>Eppendorf/Falkenröhren</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Was auch immer im Labor verfügbar oder verwendet wird</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Was auch immer im Labor verfügbar oder verwendet wird</td></tr><tr><td>FoxP3 - eFluor 660</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50577382</td><td>Verdünnungsfaktor 1:100</td></tr><tr><td>Objektträger mit frostigen Enden</td><td>Chemiewissenschaft</td><td>GEW45-2575-W</td><td></td></tr><tr><td>GL7 - Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>53590282</td><td>Verdünnungsfaktor 1:100</td></tr><tr><td>Heparinnatriumsalz</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H3393</td><td>10KU</td></tr><tr><td>HLA-DR – PE</td><td>NovusBio</td><td>NB100-77855PE</td><td>Verdünnungsfaktor 1:200</td></tr><tr><td>Humanes TruStain FcX (Fc-Rezeptor-Blockierlösung)</td><td>BioLegend</td><td>422302</td><td>Verdünnungsfaktor 1:100</td></tr><tr><td>Feuchtigkeitskammer</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Was auch immer im Labor verfügbar oder verwendet wird</td></tr><tr><td>Eiskübel mit Deckel</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Was auch immer im Labor verfügbar oder verwendet wird</td></tr><tr><td>IgD - Alexa Fluor 488</td><td>BioLegend</td><td>348215</td><td>Verdünnungsfaktor 1:100</td></tr><tr><td>IL4Ra/CD124 - PE</td><td>BioLegend</td><td>144803</td><td>Verdünnungsfaktor 1:200</td></tr><tr><td>Imaris-Dateikonverter</td><td>OXFORD-Instrumente</td><td>N/A</td><td>Umstellung eines beliebigen Bilddateiformats auf .ims-Format (https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial#file-converter)</td></tr><tr><td>Isopentan (2-Methylbutan)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Was auch immer im Labor verfügbar oder verwendet wird</td></tr><tr><td>Ki-67 - Alexa Fluor 488</td><td>BD Biosciences</td><td>558616</td><td>Verdünnungsfaktor 1:100</td></tr><tr><td>Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Sensitive Task Wischer, einlagig</td><td>Kimtech-Wissenschaft</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Große (d. h. 25 cm lange) Pinzetten</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Was auch immer im Labor verfügbar oder verwendet wird</td></tr><tr><td>Flüssiger Stickstoff</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Was auch immer im Labor verfügbar oder verwendet wird</td></tr><tr><td>Lithiumborhydrid (LiBH4)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>222356</td><td></td></tr><tr><td>MECA-79 – Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>53603680</td><td>Verdünnungsfaktor 1:100</td></tr><tr><td>Mikroskop-Objektträger-Deckglas Nr. 1 22x50 mm</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12-542A</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q-Wasser</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Was auch immer im Labor verfügbar oder verwendet wird</td></tr><tr><td>MUC2 - Alexa Fluor 488</td><td>NovusBio</td><td>NB120-11197AF488</td><td>Verdünnungsfaktor 1:100</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Kammerdeckglas</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>155380</td><td></td></tr><tr><td>PAP-Stift</td><td>abcam</td><td>AB2601</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) Lösung</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Was auch immer im Labor verfügbar oder verwendet wird</td></tr><tr><td>Skalpell</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Was auch immer im Labor verfügbar oder verwendet wird</td></tr><tr><td>SimpleITK Imaris-Erweiterungen</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Software, die verwendet wird, um Bilder aus verschiedenen Runden auszurichten (https://github.com/niaid/imaris_extensions)</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T.-Compound</td><td>Sakura Finetek USA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 980</td><td>ZEISS-Mikroskopie</td><td>N/A</td><td>Das in dieser Studie verwendete Bildgebungssystem</td></tr><tr><td>Zen Blue</td><td>ZEISS-Mikroskopie</td><td>N/A</td><td>Die für die Nachbearbeitung verwendete Bildverarbeitung</td></tr></tbody></table>

high-plex-bildgebung mittels spektral-konfokaler mikroskopie zur minimierung unspezifischer gewebefluoreszenz

High-plex Imaging using Spectral Confocal Microscopy to Minimize Non-specific Tissue Fluorescence

High-Plex-Bildgebung mittels spektral-konfokaler Mikroskopie zur Minimierung unspezifischer Gewebefluoreszenz

Highly multiplexed imaging enables the study of functionally diverse cells and their niches within their native tissue environments. Iterative Bleaching ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir haben eine neue Technik zur Quantifizierung nikotinergen Acetylcholin-Rezeptors Veränderungen innerhalb subzellulären Regionen spezifischen Subtypen von ZNS-Neuronen zum besseren Verständnis der Mechanismen der Nikotinabhängigkeit, indem eine Kombination von Ansätzen einschließlich fluoreszierendes Protein Markierung des Rezeptors mit dem Knock-in-Ansatz entwickelt und spektrale konfokale Bildgebung.

Spectral konfokale Bildgebung von fluoreszenzmarkierten Nikotinrezeptoren in Knock-in Mäusen mit chronischer Gabe von Nikotin

Wir demonstrieren die Verwendung von Fluoreszenz-Photoaktivierungs-Lokalisierungsmikroskopie (FPALM), um gleichzeitig mehrere Arten von fluoreszenzmarkierten Molekülen in Zellen abzubilden. Die beschriebenen Techniken ermöglichen die Lokalisierung von Tausenden bis Hunderttausenden einzelner fluoreszierend markierter Proteine mit einer Genauigkeit von Dutzenden von Nanometern innerhalb einzelner Zellen.

Simultane Multicolor-Imaging biologischer Strukturen mit Fluoreszenzphotoaktivierung Lokalisationsmikroskopie

Die Abbildung des dynamischen Verhaltens von Organellen und anderen subzellulären Strukturen in vivo kann Aufschluss über ihre Funktion unter physiologischen und Krankheitsbedingungen geben. Hier stellen wir Methoden vor, mit denen zwei Organellen, Zentrosomen und Mitochondrien, genetisch markiert und ihre Dynamik in lebenden Zebrafischembryonen mittels Weitfeld- und Konfokalmikroskopie abgebildet werden können.

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

Amyloid-Ablagerungen ist ein Markenzeichen von verschiedenen Krankheiten und viele andere Organe befällt. Dieses Papier beschreibt die Anwendung der leuchtenden konjugierte Oligothiophene Fluoreszenz Färbung in Kombination mit Fluoreszenz-Mikroskopie-Techniken. Diese Färbung Methode darstellt, ein leistungsstarkes Tool für die Erkennung und Erforschung von Proteinaggregaten in klinischen und wissenschaftlichen Einrichtungen.

Imaging-Amyloid Gewebe gebeizt mit lumineszierenden konjugierte Oligothiophenes von hyperspektralen konfokalen Mikroskopie und Fluoreszenz Lifetime Imaging

Antikörper, die Ziel-Rezeptoren auf der Zelloberfläche binden können Konformation und clustering Veränderungen verleihen. Diese dynamischen Veränderungen haben Auswirkungen für die Charakterisierung von Arzneimittelentwicklung in Zielzellen. Dieses Protokoll nutzt konfokalen Mikroskopie und Bild Korrelation Spektroskopie durch ImageJ/Fidschi, das Ausmaß des Rezeptors auf der Zelloberfläche clustering zu quantifizieren.

Konfokale Mikroskopie zeigt Zelle Oberfläche Rezeptor Aggregation über Bild Korrelation Spektroskopie

Spektrale Bildgebung hat sich zu einer zuverlässigen Lösung für die Identifizierung und Trennung mehrerer Fluoreszenzsignale in einer einzigen Probe und kann Signale von Interesse leicht von Hintergrund- oder Autofluoreszenz unterscheiden. Die hyperspektrale Bildgebung beim Erregungsscannen verbessert diese Technik, indem die erforderliche Bildaufnahmezeit verringert und gleichzeitig das Signal-Rausch-Verhältnis erhöht wird.

Excitation-Scanning Hyperspektrale Bildgebungsmikroskopie zur effizienten Unterscheidung von Fluoreszenzsignalen

Wir beschreiben eine schnelle Färbemethode zur multispektralen Bildgebung an gefrorenen Geweben.

Eine schnelle Methode zur multispektralen Fluoreszenz-Bildgebung von tiefgefrorenen Gewebeabschnitten

Hier wird ein Verfahren beschrieben, mit dem fünf oder mehr Fluoreszenzparameter mittels Immunfluoreszenzmikroskopie abgebildet werden können. Es wird eine Analysepipeline für die Extraktion einzelner Zellen aus diesen Bildern und die Durchführung von Einzelzellanalysen durch durchflusszytometrie-ähnliche Gating-Strategien skizziert, mit der Zelluntergruppen in Gewebeschnitten identifiziert werden können.

Generierung und Analyse von High-Parameter-Histologiebildern mit Histoflow-Zytometrie

Dieses Protokoll beschreibt die fortschrittlichen Bildgebungsanwendungen und das gemeinsame Ressourcenmanagement eines laserabtastenden konfokalen Mikroskopsystems, das mit einem multiplexierten Array-Detektor für hochauflösende zelluläre und subzelluläre Bildgebung integriert ist. Der Workflow ermöglicht multimodale Bildgebung von Konfokal bis Superauflösung (~120 nm) innerhalb einer einzigen Plattform und macht die Visualisierung im Nanomaßstab zugänglicher.

Superauflösende Bildgebung und gemeinsames Management: Ein Protokoll für konfokale Mikroskopie mit Multiplex-Detektion

Diese visualisiert Experiment ist ein Leitfaden für die Verwendung eines fluoreszierenden molekularen Klon des HIV für Live-konfokale Abbildung Experimente.

Visualizing Zell-Zell-Transfer von HIV unter Verwendung von fluoreszierenden Klone von HIV und Live-konfokale Mikroskopie

Erfahren Sie die optimierte IBEX-Workflow-Integration mit Heparin-Blocking und spektraler Detektion zur Unterdrückung unspezifischer Gewebefluoreszenz in eosinophilen humanen Geweben. Diese Methode ermöglicht präzise hochmultiplexe räumliche Proteomanalysen.

High-Plex-Bildgebung mittels spektral-konfokaler Mikroskopie zur Minimierung unspezifischer Gewebefluoreszenz

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