Eine einfache und schnelle Methode zur gleichzeitigen Isolierung von primären Inselchen und primären Pankreas-Acinarzellen von Mäusen

Diese Studie entwickelte eine vereinfachte Methode zur effizienten Gewinnung funktioneller primärer Inselchen und Acinarzellen aus der Bauchspeicheldrüse der Maus, die ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der intrazellulären Kommunikation in der Pathogenese von akuter Pankreatitis-induzierter Diabetes (PPDMA) bietet. Aktuelle Methoden zur Isolierung von primären Inselchen von Mäusen basieren hauptsächlich auf Gallengang-Cannulation. Diese Technik erfordert eine präzise Lokalisierung und Kanüle des Gallengangs, gefolgt von einer in vivo Perfusion der pankreatischen Parenchyma-Collagenase-P-Lösung.

Ohne spezialisierte Ausbildung ist es ziemlich schwierig, eine effektive und effiziente Pankreasperfusion zu erreichen, ist eine Herausforderung. Dieses Video verhindert eine einfache und schnelle Methode zur Isolierung primärer Berginseln, die für Forscher ohne Perfusionserfahrung geeignet sind. Die Methode ermöglicht außerdem die gleichzeitige Aufnahme primärer Pankreas-Acinarzellen, wodurch eine ausreichende Menge hochwertiger Inselchen und Acinarzellen liefert.

Sie ermöglicht es Forschern, Experimente im selben pathologischen und physiologischen Kontext durchzuführen und so eine tiefgehende Analyse des Wechselwirkungsmechanismus zwischen Inselchen und Acinarzellen zu ermöglichen. Isolierung von Bauchspeicheldrüseninseln und Bauchspeicheldrüsen-Acinarzellen (PACs). Fügen Sie Hanks ausgewogene Salzlösung und Kollagenase-P-Lösung zur 12-Well-Platte hinzu und geben Sie drei Milliliter Kollagenase-P-Lösung in ein 50-Milliliter-Zentrifugenrohr für die spätere Verdauung.

Betäuben Sie die Maus vor der Operation mit 1,25 % Tribromoethanol und anschließend Euthanasie. Machen Sie einen V-förmigen Bauchschnitt, um die Bauchhöhle der Maus zu öffnen. Das dunkelrote lymphoide Organ im linken hypochondrischen Bereich ist die Milz, und das weiße Organ, das an der Milz befestigt ist, ist die Bauchspeicheldrüse.

Führen Sie vorsichtig eine stumpfe Sektion der Bauchspeicheldrüse entlang des unteren Magenrandes und des Pankreatikoduodenalübergangs durch. Waschen Sie das isolierte Bauchspeicheldrüsengewebe in Hanks ausgewogener Salzlösung und entfernen Sie verbleibende mesenteriale Ansätze, die Milz und das peripankreatische Fettgewebe. Bringen Sie die vorverarbeitete Bauchspeicheldrüse auf eine 12-Well-Platte, die mit zwei Millilitern Kollagenase-P-Lösung vorgegeben wird.

Halten Sie die Bauchspeicheldrüse mit einer Pinzette mit der linken Hand fest und mit einer Ein-Milliliter-Spritze, um mit der rechten Hand die Kollagenase-P-Lösung in das Pankreasparenchym zu injizieren, bis das Bauchspeicheldrüsengewebe durchsichtig und ömatös erscheint. Schneiden Sie die Bauchspeicheldrüse schnell mit einer chirurgischen Schere in ein bis zwei Millimeter abgetrennte Gewebestücke. Schneiden Sie die distale bis 1,5 Zentimeter einer ein-Milliliter-Pipettenspitze ab, um die Öffnung zu vergrößern, und verwenden Sie diese modifizierte Spitze, um die Bauchspeicheldrüsengewebestücke zusammen mit zwei Millilitern Kollagenase-P-Lösung in ein 50-Milliliter-Zentrifugenrohr zu übertragen, das mit drei Millilitern Kollagenase-P-Lösung vorgeladen ist.

Inkubieren Sie das Zentrifugenrohr in einem 37 Grad Celsius heißen Wasserbad für 12 Minuten und schütteln Sie das Rohr alle fünf bis sechs Minuten sanft. Fügen Sie 10 Milliliter RPMI 1640 Complete Medium hinzu, um die Verdauungswirkung der Collagenase-P-Lösung zu beenden. Pipettieren Sie das Pellet wiederholt mit einer fünf-Milliliter-Pasteur-Pipette, 15 bis 20 Auf- und Abstreiche, bis keine offensichtlichen großen Gewebeklumpen mehr übrig sind.

Gib 10 Milliliter RPMI 1640 Complete Medium dazu. Dann zentrifugieren Sie bei 180 Mal G für zwei Minuten bei vier Grad Celsius. Und entsorge das Supernatantant, suspendiere das Pellet mit 20 Millilitern RPMI 1640 Complete Medium.

Filtern Sie die Federung durch ein Sieb mit 40 Gittern. Dann zentrifugieren Sie bei 180 Mal G für zwei Minuten bei vier Grad Celsius. Werfen Sie das Supernatant vorsichtig weg.

Gib 20 Milliliter Ficoll-Lösung hinzu, um das Pellet wieder aufzuhängen. Dann fügen Sie langsam 15 Milliliter RPMI 1640 Complete Medium hinzu. An diesem Punkt kann eine klare Flüssigkeitsgrenze beobachtet werden.

Zentrifugieren Sie sanft bei 640 Grad G für 20 Minuten bei 25 Grad Celsius. Entfernen Sie vorsichtig das Zentrifugenrohr und saugen Sie die obere rote Mittelschicht mit einer fünf Milliliter Pasteur-Pipette an. Dann werden die flüssigkeitshaltigen Inseln an der Schnittstelle der Flüssigkeitsschicht vorsichtig aspiriert und in ein neues 50-Milliliter-Zentrifugenrohr übertragen.

Füge 20 Milliliter RPMI 1640 Complete Medium hinzu. Zentrifugiere bei 180 Mal G für zwei Minuten bei vier Grad Celsius und entsorge das Supernatant. Das Pellet mit 20 Millilitern RPMI 1640 Complete Medium wieder aufhängen.

Zentrifugiere bei 180 Mal G für zwei Minuten bei vier Grad Celsius und entsorge das Supernatant. Das Pellet wird mit 10 Millilitern RPMI 1640 Complete Medium wieder aufgehängt. Und sie in eine 60-Millimeter-Zellkulturschale umleiten.

Unter einem umgekehrten biologischen Mikroskop mit 100-facher Vergrößerung werden Inselchen manuell mit einer 20-Mikroliter-Pipette ausgewählt. Übertragen Sie die ausgewählten Inselchen auf eine 24-Well-Zellkulturplatte, vorgeladen mit 500 Mikrolitern RPMI 1640 komplettem Medium pro Bohrloch. Verwerfen Sie die Ficoll-Lösungsschicht.

Die Kugel wird mit 10 Millilitern DMEM Complete Medium wieder aufgehängt. Filtern Sie durch ein 100-Mikrometer-Zellsieb. Zentrifugiere bei 180 Mal G für zwei Minuten bei vier Grad Celsius.

Und entsorge das Supernatantant. Die Kugel wird mit 10 Millilitern DMEM Complete Medium wieder aufgehängt. Zentrifugiere bei 180 Mal G für zwei Minuten bei vier Grad Celsius und entsorge das Supernatant.

Anschließend wird das Pellet mit fünf Millilitern DMEM-Komplettmedium für spätere Experimente wieder suspendiert. Nach der Zentrifugation der Ficoll-Lösungsdichte wurden Inselchen nahe der Grenzfläche zwischen der transparenten, farblosen Flüssigkeitsschicht und dem Medium beobachtet, wobei Packungen als Sediment am Boden des Rohrs vorhanden waren. Die Inselchen waren meist rund, oval, goldbraun, mit einer stabilen Erträge von 120 plus oder minus fünf pro Maus, Abbildung A und Abbildung B. Frisch isolierte PACs waren kugelförmig und gruppiert.

Acinarzellen hatten dunklere apikale Enden mit sichtbaren Zymogengranulaten, und die Ausbeute lag bei 1,6 bis 1,95 mal 10 bis dem siebten Kraftzellen pro Maus, Abbildung C und Abbildung D. Insel- und Acinarzell-Clacein-PI-Färbungen zeigen, dass die meisten Zellen grün gelagert Kalkstein, lebend und wenige rote PI, tot sind, zeigen, Abbildung A. Abbildung J-basierte quantitative Analyse zeigt, dass isolierte Inselchen und Acinarzellen Lebensfähigkeitsraten von 97,52 plus/minus 0,16 % und 96,55 plus oder minus 0,95 % jeweils, Abbildung B. Isolierte Pankreas-Acinarzellen, eine basale Amylase-Aktivität von 0,79 plus oder minus 0,01 Einheiten pro Milliliter. Nach Stimulation mit 10 nanomolaren, 20 nanomolaren und 50 nanomolaren Caerulein betrugen ihre Amylase-Aktivitäten 1,45 plus/minus 0,03 Einheiten pro Milliliter, 1,65 plus/minus 0,05 Einheiten pro Milliliter und 1,39 plus oder minus 0,02 Einheiten pro Milliliter. Die Einweg-ANOVA zeigte, dass alle Caerulein-Gruppen signifikant unterschiedliche Amylase-Aktivitäten als die Kontrollgruppe aufwiesen, alle mit einem P-Wert unter 0,001.

Zusätzlich unterschied sich die 20-nanomolare Gruppe signifikant von der 10-nanomolaren Gruppe, P-Wert weniger als 0,001, Abbildung A. Isolierte Inselchen mit einer Insulinsekretion von 0,27 plus oder minus 0,04 Nanogramm pro Milliliter und Insel pro Stunde bei Stimulation mit 5,6 millimolaren Glukose und 0,94 plus oder minus 0,04 Nanogramm pro Milliliter pro Insel pro Stunde mit 22 millimolaren Glukose, GSI entspricht 3,44, Abbildung B. Diese Studie etablierte eine Methode zur gleichzeitigen Isolierung primärer Mausinselchen und pankreasischer Akinarzellen ohne komplexe in vivo Perfusion. Mit einer langen technischen Hürde ist die Methode einfach zu bedienen und liefert 120 plus/minus 5 Inselchen und 1,6 bis 1,95 mal 10 bis zur siebten Potenz Acinarzellen pro Maus, wobei beide Zelltypen eine Lebensfähigkeit von über 96 % aufweisen. Die isolierten Inselchen weisen eine normale glukosestimulierte Insulinsekretion auf, und die Acinarzellen sind empfindlich gegenüber Caeruleinstimulation. Dies bestätigt, dass die durch diese Methode gewonnenen Zellen intakte Funktionen haben, was sie für Studien zu pankreasischen exokrinen und endokrinen Interaktionen geeignet macht.

Allerdings ist die Methode durch den Bedarf an grundlegenden Kenntnissen in der Mausanatomie, die Notwendigkeit von Anpassungen der Reagenziendosierung, Beschränkungen der Anzahl der gleichzeitig verarbeiteten Mäuse und das Risiko der nicht validierten Anwendung begrenzt. Es bietet dennoch ein zuverlässiges Zellisolationsprotokoll für Forscher ohne Perfusionserfahrung.