Optimierte Analyse von Proteinen aus Xenopus-Eizellen und Embryonen durch Immunoblotting

Im Laufe des Lebens eines Tieres finden kontinuierlich Sulfatentscheidungen statt, die eine normale Entwicklung und Gesundheit eines erwachsenen Organismus ermöglichen. Diese Entscheidungen hängen von spezifischen Proteinen ab, die als Sulfatregulatoren bezeichnet werden. Das Ziel unserer Forschung ist es, die Mechanismen zu finden, die die Synthese dieser kritischen Regulatoren steuern.

Unser Protokoll bietet nicht nur einen detaillierten Überblick über Immunblotting und Xenopus-Eizellen und -Embryonen, sondern gibt auch einen Einblick in die Herausforderungen, die diesem Modellorganismus gemeinsam sind, wie z. B. die Beschaffung von Antikörpern. Durch eingehende Untersuchungen der Bindungs- und Repressionsmechanismen von Bicaudal C hat unsere Forschung dazu beigetragen, eine Informationsgrundlage für den Vergleich anderer translationaler Regulatoren zu schaffen. Um mit der Verarbeitung von Zellen für das Immunblotting zu beginnen, fügen Sie 10 Mikroliter gekühlten Zelllysepuffer hinzu, der auf eine einmalige Konzentration mit doppelt deionisiertem Wasser pro Embryo oder Eizelle verdünnt ist.

Mit einem Mikrostößel die Proben auf Eis homogenisieren. Legen Sie die Röhrchen in eine Tischzentrifuge und schleudern Sie die Proben bei 5.000 g bei vier Grad Celsius für 10 Minuten, um Rückstände, einschließlich Eigelb und unlösliche Pigmente, zu pelletieren. Übertragen Sie den Überstand in ein sauberes 1,5-Milliliter-Röhrchen und stellen Sie sicher, dass das Pellet während des Transfers nicht gestört wird.

Dem gesammelten Überstand wird ein gleiches Volumen zweifachen Laemmli-Probenpuffers, ergänzt mit 5 Vol.-% 2-Mercaptoethanol, zugegeben. Erhitzen Sie die Mischung 10 Minuten lang bei 95 bis 100 Grad Celsius, um die Proteine zu denaturieren. Nehmen Sie nun ein vorgefertigtes Gel mit 4 bis 12 % Bis-Tris SDS aus der Verpackung und ziehen Sie den Aufkleber von der Unterseite des Gels ab.

Führen Sie das Gel in die Elektrodenbaugruppe gegenüber einem Pufferdamm ein und platzieren Sie die gesamte Baugruppe in einem vertikalen Elektrophoresetank. Füllen Sie dann sowohl die Elektrodeneinheit als auch den Boden des Tanks mit dem Tris-MOPS-SDS-Laufpuffer. Entfernen Sie vorsichtig den Gelkamm und pipettieren Sie den Laufpuffer in die Vertiefungen, um Blasen zu entfernen und den Puffer auszugleichen.

Laden Sie nun fünf Mikroliter vorgefärbter Proteinstandards in die erste Vertiefung und 10 Mikroliter jeder vorbereiteten Probe in die verbleibenden Vertiefungen. Setzen Sie den Deckel auf den Elektrophoresebehälter und schließen Sie ihn an eine Stromversorgung an. Stellen Sie dann die Spannung auf 200 Volt ein, um die Elektrophorese einzuleiten.

Stoppen Sie die Elektrophorese, sobald die Probenpuffer-Farbstofffront das Gel verlässt. Bevor die Elektrophorese abgeschlossen ist, beginnen Sie mit dem Zusammenbau des Transfersandwiches im Transferclip. Füllen Sie eine Glasauflaufform mit gekühltem Transferpuffer und tauchen Sie während der Montage alle Transfermaterialien in diesen Puffer.

Legen Sie den Transferclip so in die Schale, dass die schwarze Hälfte am Boden anliegt, die weiße Hälfte nach oben zeigt und der Clip nach links geöffnet wird. Lege ein oder zwei Faserschwämme flach auf die schwarze Hälfte des Transferclips. Nachdem Sie zwei Stücke 0,35 Millimeter Zellulosechromatographiepapier zugeschnitten haben, legen Sie eines auf die Schwämme.

Sobald die Elektrophorese abgeschlossen ist, nehmen Sie das Gel aus dem Elektrophoresetank. Hebeln Sie die Gelplatten mit dem Öffnungshebel der Gelkassette vorsichtig auseinander und achten Sie darauf, dass das Gel an einer Seite haftet. Schneiden Sie die Vertiefungen von der Oberseite des Gels mit dem Gelablöser ab.

Legen Sie das Gel, das noch an einer Hälfte der Kunststoffkassette befestigt ist, auf das Filterpapier und entfernen Sie die verbleibende Kassettenhälfte, damit das Gel flach auf dem Papier bleibt. Schneiden Sie als Nächstes ein Stück 0,45 Mikrometer große Nitrozellulosemembran so zu, dass es den Abmessungen des Gels entspricht. Entfernen Sie die Membran vom Schutzpapier, befeuchten Sie sie kurz mit Transferpuffer und legen Sie sie vorsichtig auf das Gel.

Legen Sie dann ein zweites Stück Filterpapier auf die Nitrozellulosemembran. Drücken Sie mit einer Rolle vorsichtig aber fest alle Luftblasen heraus. Stapeln Sie ein oder zwei zusätzliche Faserschwämme auf das Filterpapier, um das Sandwich zu vervollständigen.

Schließen Sie die Transferkassette und klemmen Sie sie fest, um das zusammengebaute Sandwich zu verschließen. Führen Sie dann das geschlossene Transfersandwich mit dem Clip nach oben in den Transferkern ein und stellen Sie sicher, dass die schwarze Seite des Clips zur schwarzen Seite des Kerns zeigt. Setzen Sie den Transferkern in den Elektrophoresebehälter ein.

Legen Sie einen Eisbeutel und einen Rührstab in den Tank, um sicherzustellen, dass sich der Rührstab frei drehen kann. Füllen Sie den Tank mit gekühltem Transferpuffer, bis das Gerät vollständig untergetaucht ist, und befestigen Sie den Deckel oben. Schließen Sie das Gerät an die Stromversorgung an, passen Sie die Elektrodenfarben an und stellen Sie die Bedingungen für eine Stunde auf 100 Volt ein, während sich der Rührstab dreht.

Sobald die Übertragung abgeschlossen ist, öffnen Sie vorsichtig die Kassette und zerlegen Sie das Sandwich. Entfernen Sie die Nitrozellulosemembran und markieren Sie die Seite, die mit dem Gel in Kontakt war. Legen Sie dann die Nitrozellulosemembran in ein kleines Gefäß, so dass sie flach am Boden anliegt.

Decken Sie die Membran vollständig mit Ponceau-Beize ab und wiegen Sie sie 5 bis 10 Minuten lang vorsichtig auf einer Wippe. Spülen Sie die Membran nach dem Eingießen des Ponceau-Flecks mehrmals mit doppelt deionisiertem Wasser aus, bis der überschüssige Fleck entfernt ist und Proteinbanden in den Bahnen sichtbar werden. Führen Sie dann die Schritte Membranblockierung, Antikörperinkubation und Waschen wie gezeigt durch.

Sobald die Inkubation und das Waschen des Sekundärantikörpers abgeschlossen sind, ist die Membran bereit für die Bildgebung. Schalten Sie in einem dunklen Raum den Filmentwickler ein und lassen Sie ihn aufwärmen. Schneide zwei Quadrate Plastikfolie aus, die groß genug sind, um die Membran vollständig zu bedecken.

Legen Sie die Nitrozellulosemembran mit einer Pinzette mit der Vorderseite nach oben auf das erste Quadrat der Plastikfolie. Mischen Sie in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen gleiche Voluminien des verbesserten Chemilumineszenz-Luminols und der Enhancer-Reagenzien. Verwenden Sie dann etwa einen Milliliter der Mischung, um die meisten Membranen abzudecken.

Manipulieren Sie die Membran vorsichtig mit der Plastikfolie, um sicherzustellen, dass die gesamte Oberfläche gleichmäßig beschichtet ist, und inkubieren Sie sie eine Minute lang. Entfernen Sie dann überschüssiges ECL-Reagenz, indem Sie die Membran mit einer Pinzette greifen und die Flüssigkeit leicht abschütteln. Legen Sie die Membran mit der Vorderseite nach oben auf das zweite Quadrat der Plastikfolie, falten Sie sie locker über die Membran und kleben Sie die Folie sicher in eine Autoradiographiekassette.

Nehmen Sie anschließend die Membran mit einem Autoradiographiefilm in einem dunklen Raum ab, indem Sie die gezeigten Schritte ausführen. Nachdem die gewünschte Proteinvisualisierung erreicht wurde, richten Sie den entwickelten Film an den im Dunkeln leuchtenden Markern aus und verwenden Sie diese als Leitfaden, um die Position der vorgefärbten Proteinstandards auf dem Film zu markieren. Sobald die Bildgebung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Membran vorsichtig aus der Plastikfolie und tauchen Sie sie in TBSTW, um das restliche ECL-Reagenz abzuwaschen.

Die Ponceau-Färbung der Membran bestätigte den erfolgreichen Proteintransfer. Endogenes B1-Protein wurde in Eizellproben nicht nachgewiesen, aber in Embryoproben der Stadien sieben und 10,5 mit etwa 107 Kilodalton eindeutig nachgewiesen. Eine kleinere 70-Kilodalton-Proteinbande wurde in injizierten Proben in allen Stadien mit dem Bicc1-Antikörper nachgewiesen, was auf eine erfolgreiche Expression der HA-Bicc1 C-terminalen Fusion hinweist.

Der HA-Antikörper wies die gleiche 70-Kilodalton-Bande nur in injizierten Proben nach, was die Spezifität des Bicc1-Antikörpers für das Fusionsprotein bestätigt. Zwei hochmolekulare Banden, etwa 250 und 270 Kilodalton, wurden in allen Proben mit dem CNOT1-Antikörper nachgewiesen. Die Expression des 54-Kilodalton-Proteins DDX6 wurde in allen Proben nachgewiesen, war jedoch in Embryonen im Stadium 10,5 sichtbar reduziert.