Immunoblot-Analyse

Immuno-Blotting, oft auch als Western Blotting bezeichnet, wird verwendet, um innerhalb einer Proteinprobe spezifische Antigene zu identifizieren, die von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern erkannt werden. Dieses Verfahren folgt in der Regel einer Ein- oder 2D-Gelelektrophorese und beinhaltet den Transfer von getrennten Proteinen auf Nitrozellulosemembranen. Inkubation dieser Membranen mit primären und sekundären Antikörpern, die direkt oder indirekt an Enzyme konjugiert sind, und Visualisierung von Proteinantigenen auf diesen Membranen unter Verwendung von farbigen oder fluoreszierenden Substratreaktionen.

In diesem Video zeigen wir Ihnen Schritt für Schritt ein Immun-Blotting-Verfahren. Hallo, ich bin Sean Gallagher von der UVPI und arbeite mit einem Proteomikzentrum hier am KE Graduate Institute zusammen. Heute zeige ich Ihnen die Immun-Blotting-Analyse.

Es umfasst eine Reihe von Schritten, darunter die Proteintrennung, das Blotten der Proteine auf Membranen, Immunsondierung und Visualisierung mit chromogenen und kim-Lumineszenzsubstraten. Also lasst uns loslegen. Vor Beginn des Immun-Blotting-Verfahrens müssen die Proteinproben zunächst mittels Elektrophorese mit kleinen oder standardgroßen ein- oder zweidimensionalen Gelen getrennt werden.

Bereiten Sie die antigenen Proben vor und laden Sie sie in die Lanes auf dem Gel, fügen Sie vorgefärbtes oder biotinyliertes Protein und Molekulargewichtsstandards in eine oder mehrere der Gelbahnen ein. Diese Proteinmarker werden auf die Membran übertragen und zeigen die Membranausrichtung und -größe von Proteinen nach der Immunfärbung an. Sobald die Elektrophorese abgeschlossen ist, sind wir bereit, den Immunblot zusammenzubauen.

So bauen Sie den Immun-Blot zusammen Zerlegen Sie zunächst das Gel-Sandwich und entfernen Sie das Stapelgel Äquilibrieren Sie das Gel für 30 Minuten Bei Raumtemperatur im Transferpuffer ist diese Äquilibrierung erforderlich, um eine Veränderung der Größe des Gels während des Transfers während des Gleichgewichts des Gels zu verhindern. Beginnen Sie mit dem Zusammenbau des Transfersandwiches in einer Schale, die groß genug ist, um die Füllung der Kunststoff-Transferkassette mit dem Transferpuffer aufzunehmen, so dass die Kassette abgedeckt ist. Lege nun ein Scotch Bright Pad oder einen Schwamm auf die untere Hälfte der Kunststoff-Transferkassette.

Nehmen Sie dann ein Blatt Filterpapier, das auf die gleiche Größe wie das Gel zugeschnitten wurde. Befeuchten Sie es mit Transferpuffer und legen Sie es auf das Scotch Bright Pad. Sobald die 30-minütige Geläquilibrierung abgeschlossen ist, legen Sie das Gel auf das Filterpapier.

Entfernen Sie alle Luftblasen zwischen dem Gel und dem Filterpapier, indem Sie ein Reagenzglas oder einen Glasstab vorsichtig über die Oberfläche des Gels rollen. Oder Sie verwenden die BioRad-Walze, die mit dem BioRad-Kit geliefert wird. Denken Sie daran, Handschuhe zu tragen, wenn Sie Filterpapiere, Gele und Membranen manipulieren.

Öl aus Ihren Händen blockiert die Übertragung. Bereiten Sie als Nächstes die Transfermembran vor. Schneiden Sie die Membran auf die gleiche Größe wie das Gel plus ein bis zwei Millimeter an jeder Kante.

Legen Sie dann die Membran langsam mit einer Kante in einem 45-Grad-Winkel in destilliertes Wasser, das Wasser saugt sich in die Membran auf und benetzt schließlich die gesamte Oberfläche. Wenn es zwei schnell ins Wasser eingeführt wird, wird Luft eingeschlossen und erscheint als weiße Flecken in der Membran. Das Protein wird nicht auf diese Bereiche übertragen.

Sobald die Membran vollständig nass ist, äquilibrieren Sie sie 10 bis 15 Minuten lang und übertragen Sie den Puffer. Dieses Benetzungsverfahren funktioniert für Nitrozellulose- und Nylonmembranen. Nur PVDF-Membranen sind hydrophob und werden nicht nass, wenn sie einfach in destilliertes Wasser gelegt oder übertragen werden. Puffer.

PVDF-Membranen müssen zunächst ein bis zwei Sekunden lang in 100%iges Methanol getaucht und dann 10 bis 15 Minuten lang äquilibriert werden. Im Übertragungspuffer. Lassen Sie die Membran zu keinem Zeitpunkt austrocknen.

Geschieht dies, wird erneut mit Methanol und anschließend mit dem Transferpuffer benetzt. Sobald die Membran fertig ist, legen Sie die vorbenetzte Membran direkt auf die Oberseite des Gels. Denken Sie daran, alle Luftblasen zwischen dem Gel und der Membran zu entfernen, indem Sie ein Reagenzglas, einen Glasstab oder eine BioRad-Walze vorsichtig über die Oberfläche der Membran rollen.

Als nächstes nass, ein weiteres Stück Watman drei mm Filterpapier. Legen Sie es dann auf die Membran und entfernen Sie erneut alle Luftblasen. Lege dann ein weiteres Scotch Bright Pad oder einen Schwamm auf dieses Filterpapier.

Schließen Sie die Montage des Immun-Blot-Sandwiches ab, indem Sie die obere Hälfte der Transferkassette verriegeln. Jetzt, da das Immun-Blot-Sandwich zusammengebaut ist, sind wir bereit, die Proteine vom Gel auf die Membran zu übertragen. Um den Transfervorgang zu starten, füllen Sie den Elektro-Blotting-Tank mit Transferpuffer und setzen Sie die Transferkassette mit dem Sandwich in das Elektro-Blotting-Gerät ein.

Es ist wichtig, dass das Sandwich so ist, dass die Membran zur Anode oder zur positiv geladenen Seite des Tanks zeigt. Verbinden Sie die Kabel des Netzteils mit den entsprechenden Anoden- und Kathodenseiten des Elektrolöschgeräts. Dieses spezielle Kriteriumslöschblatt wird mit einem kühlenden Eisblock geliefert.

Nun werden Proteine elektrophoretisch für 30 bis 60 Minuten bei 50 Volt mit Kühlung vom Gel auf die Membran übertragen oder über Nacht bei 14 Volt in einem Kühlraum. Wenn die Übertragung abgeschlossen ist, schalten Sie die Stromversorgung aus und zerlegen Sie das Gerät. Entfernen Sie dann die Membran vom Blotting-Gerät und notieren Sie die Ausrichtung, indem Sie eine Ecke abschneiden.

Zu diesem Zeitpunkt können die Membranen getrocknet und in einem wiederverschließbaren Plastikbeutel bei vier Grad Celsius ein Jahr lang gelagert werden. Vor der Weiterverarbeitung müssen getrocknete PVDF-Membranen in eine kleine Menge 100%Methanol gegeben werden, um die Membran zu benetzen. Dann in destilliertem Wasser, um das Methanol zu entfernen.

Sobald die Ausrichtung markiert ist, färben Sie das Gel, um die Übertragungseffizienz zu überprüfen. Um übertragene Proteine sichtbar zu machen, können Sie die Membran entweder reversibel mit Cipro-Rubin oder irreversibel mit Kamasi-blauer Tusche, Naphtholblau oder kolloidalem Gold färben. Diese irreversiblen Färbeverfahren sind mit Nylonmembranen nicht kompatibel.

Nachdem die Proteine auf die Membran übertragen wurden, fahren Sie mit der Immunsondierung und dem visuellen Nachweis der Proteine fort. In diesem Schritt werden immobilisierte Proteine auf der Membran mit spezifischen Antikörpern untersucht, um eventuell vorhandene Antigene zu identifizieren und zu quantifizieren. Legen Sie die Membran zunächst in eine Inkubationsschale aus Kunststoff mit 20 Millilitern Blockierungspuffer

Einige Leute verwenden Beutel, aber die Trays werden oft stattdessen verwendet, da sie besonders nützlich sind, wenn eine große Anzahl von Streifen in verschiedenen Primärantikörperlösungen verarbeitet wird. Als nächstes inkubieren Sie die versiegelte Membran 30 bis 60 Minuten lang bei Raumtemperatur unter Rühren auf einem Orbitalschüttler oder einer Schaukelplattform. Während die Membran inkubiert, verdünnen Sie den Primärantikörper und den Blockierungspuffer.

Die Verdünnung wird empirisch bestimmt, liegt aber typischerweise zwischen eins zu 100 und eins zu 1000. Für einen polyklonalen Antikörper eins zu 10 zu eins zu 100 für hybride Überstände und mehr als eins zu 1000 für murine Säuren, die monoklonale Antikörper enthalten. Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, gießen Sie den Blockierungspuffer aus.

Ersetzen Sie den Puffer durch einen verdünnten Primärantikörper und inkubieren Sie ihn erneut 30 bis 60 Minuten lang bei Raumtemperatur unter ständigem Rühren. Waschen Sie anschließend die Membran viermal, indem Sie mit 100 Millilitern umrühren. TTBS für NITROCELLULOSE- oder PVDF-Filter oder TBS für Nylonfilter.

Waschen Sie die Membran jeweils 10 bis 15 Minuten lang, während die Membran gewaschen wird, und verdünnen Sie den Sekundärantikörper in Blockpuffer. Beispiele für sekundäre Antikörper sind Meerrettichperoxidase oder alkalische Phosphatase, Anti-IG-Konjugat und kommerziell erhältliche Enzymkonjugate. Sekundärantikörper werden in der Regel vor der Verwendung von einem bis 200 bis einem bis 25.000 verdünnt.

Nachdem die Waschschritte abgeschlossen und die Waschmaterialien entsorgt wurden, verdünnte Meerrettichperoxidase oder alkalische Phosphatase hinzufügen, Anti-IG-Konjugat hinzufügen und 30 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur unter ständigem Rühren inkubieren. Entfernen Sie nach 30 bis 60 Minuten die Membran aus dem Behälter und waschen Sie sie viermal, jeweils 10 bis 15 Minuten. In TTBS, wie zuvor beschrieben.

Sobald die Waschvorgänge abgeschlossen sind, können wir mit dem Visualisierungsschritt fortfahren. Zunächst werden wir jedoch ein alternatives Immunsondierungsverfahren demonstrieren. Dieses alternative Immunsondierungsverfahren basiert auf dem Vector Stain A BC Kit von Vector Labs.

Es verwendet einen avidanischen Biotin-Komplex, um Meerrettichperoxidase oder HRPO oder alkalische Phosphatase A A P an den biotinylierten Sekundärantikörper zu binden. Heute werden wir das HRPO-Kit vorführen. TTBS eignet sich gut als Blockierungspuffer für Avadon-Biotin-Systeme.

Für Nylonfilter werden jedoch proteinbindende Reagenzien empfohlen, da fettfreie Trockenmilch Restbiotin enthält, das den Immunoassay beeinträchtigt. Es darf im Blockierschritt nur verwendet werden, um mit dem Äquilibrieren der Membran in einem Blockierungspuffer in einer offenen Schale unter ständigem Rühren unter Verwendung eines Orbitalschüttlers oder einer Wippplattform zu beginnen. Inkubieren Sie die Membran 30 bis 60 Minuten lang bei Raumtemperatur, während sich die Membran im Gleichgewicht befindet.

Bereiten Sie die primäre Antikörperlösung vor. Verwenden Sie TTBS für NITROCELLULOSE- oder PVDF-Membranen mit hochempfindlichem Aden. Biotin-Systeme.

Die Verdünnung von Cera-haltigen Primärantikörpern liegt im Allgemeinen zwischen eins zu 1000 und eins zu 100.000. Die Verwendung der Chemilumineszenzchemie erfordert den höheren Verdünnungsbereich. In unserem Fall der Nachweis von chromogen.

Wir verwenden eine Verdünnung des Primärprodukts von eins zu 5.000. Sobald die e-Äquilibrierung abgeschlossen ist, entfernen Sie den Blockierungspuffer. Fügen Sie dann genügend Primärantikörperlösung hinzu, um die Membran zu bedecken.

Inkubieren Sie die Membran 30 Minuten lang bei Raumtemperatur und wiegen Sie sie nach 30 Minuten leicht. Waschen Sie die Membran dreimal in Fünf-Minuten-Intervallen in TTBS für Nitrocellulose. Bereiten Sie während des Waschschritts die biotinylierte Sekundärantikörperlösung vor, indem Sie einen Tropfen biotinylierten Antikörper mit 10 Millilitern TTBS verdünnen. Sobald die Waschschritte abgeschlossen sind, fügen Sie die sekundäre Antikörperlösung hinzu.

Inkubieren Sie die Membran 30 Minuten lang bei Raumtemperatur unter langsamem Schaukeln, während die Membran mit dem Sekundärantikörper inkubiert wird. Bereiten Sie das Avadon Biotin HRPO dafür vor. Mischen Sie zwei Tropfen vti Fleckenreagenz A und zwei Tropfen Reagenz B in 10 Milliliter.

TTBS für Nitrocellulose. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, wenn die Inkubation des Sekundärantikörpers abgeschlossen ist. Waschen Sie die Membran dreimal über einen Zeitraum von 15 Minuten mit TTBS oder TBS.

Geben Sie anschließend die Avidan-Biotin-Enzymlösung in die Membran und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur unter langsamem Schaukeln. Waschen Sie die Membran dann dreimal im Abstand von 10 Minuten mit TTBS. Jetzt, da das Immunsondierungsverfahren abgeschlossen ist, können die membrangebundenen Proteine mit chromogenen Substraten visualisiert werden.

Für diesen letzten Visualisierungsschritt werden die Substrate vier CN, Dab Slash, ICL zwei und TMB üblicherweise mit Meerrettich, Peroxidase-basierten Immunnachweisverfahren verwendet. Wenn die abschließende Membranwäsche während des Immunsondenverfahrens in TTBS durchgeführt wurde, dann waschen Sie die Membran 15 Minuten lang bei Raumtemperatur und 50 Millilitern. TBS platziert die Membran nun in einer chromogenen Visualisierungslösung.

Proteinbanden sollten in 10 bis 30 Minuten erscheinen. Nach der 30-minütigen Inkubation wird das Substratreaktionsgemisch verworfen und die Reaktion durch Zugabe von destilliertem Wasser beendet. Immuno-Blotting ist ein mehrstufiges Verfahren, das von Tausenden von Laboren verwendet wird, um das Vorhandensein bestimmter Proteine nach einer oder 2D-Elektrophorese nachzuweisen.

Ich habe Ihnen gerade gezeigt, wie Sie eine Immunblutanalyse durchführen. Das war's also. Viel Glück bei Ihren Experimenten und danke fürs Zuschauen.