Name: Xenopus laevis als Modell zur Übersetzung Impairment Identifizieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Erfahren Sie, wie Mutationen in Translationsinitiationsfaktoren mit Xenopus laevis-Oozyten untersucht werden. Diese Methode ermöglicht die Analyse der mos-mRNA-Translation ohne Störfaktoren.

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Diese Forschung wurde durch ein Stipendium von INSERM, Universität Lille 1, Universität Lille 2, Regionales Krankenhauszentrum Lille (CHR de Lille) unterstützt. Das MCCH bedankt sich bei der Unterstützung durch die Fondation de France und dankt dem IRCL, Prof. Sonenberg für die Spende der V5-Plasmide, Dr. Dissous (Pasteur Institute, Lille) für die Spende von Anti-GFP-Antikörpern, UMS 3387 (Universität Rennes), wo Xenopus-Eizellen gekauft wurden, und Dr. Taymans (JPArc, Lille) für die kritische Lektüre des Manuskripttextes.

Alle Xenopus Experimente wurden bei der Tierhaltung der Universität Lille 1 nach den Regeln des Gemeinschaftsrahmens des Europäischen (86/609 / EWG) für Labortierversuche durchgeführt. Das Tier-Protokoll wurde von der lokalen Ethikkommission genehmigt (Comité d&#39;Ethique en Experimentieren Animale Nord-Pas-de-Calais, CEEA 07/2010). 1. Oocyte Handhabung <ol><li> Bereiten Sie die Narkoselösung: 1 g Tricainmethansulphonat Pulver in einem 1 l sterilem Wasser. </li><li> Plunge weiblichen Xenopus laevis in diese Lösung, decken Sie den Becher, um das Entweichen zu vermeiden und warten Sie etwa 45 Minuten für das Tier vollständig sediert werden (ohne Reaktion an einem Bein Pinch). </li><li> Waschen Sie den Frosch mit Seife und spülen mit Leitungswasser legen Sie dann das Tier auf seinem Rücken auf saubere Aluminiumfolie. </li><li> Klemmen Sie die Haut des lateralen Teil des Bauches und an der Eierstöcke Ebene mit einer Pinzette.Einen Einschnitt von etwa 1 cm mit einer Schere vor dem Gebrauch mit Ethanol 70% gereinigt. Stellen Sie sicher, dass der Abschnitt ist tief genug, und die zugrunde liegenden Bauchwand zu Exzision des Eierstockgewebe, in dem mehrere Eizellen in verschiedenen Stadien der Entwicklung zu finden sind erlaubt zu erreichen. </li><li> Sezieren die Ovar Lappen, wäscht sie 4 mal in einer Petrischale (50 mm) mit ND96-Medium (96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 1,8 mM CaCl 2, 5 mM HEPES auf pH 7,4 mit NaOH, ergänzt mit 50 ug / ml Streptomycin / Penicillin, 225 ug / ml Natriumpyruvat, 30 ug / ml Sojabohnen-Trypsininhibitor, 1 &amp; mgr; l / ml Tetracyclin), um alle Spuren von Blut und Trümmer zu entfernen. Hinweis: Tetracycline ermöglicht eine optimale Konservierung und eine gute Erholung nach Mikroinjektion Behandlung. </li><li> Speichern sie in einer Petrischale abgedeckt im Medium bei 14 ° C eingetaucht, so dass ihre Erhaltung für eine Woche. </li><li> Nähen Sie die Bauchdecke und die Haut mit Tierarzt resorbierbaren tHread und eine Nähnadel (3 oder 4 Maschen notwendig). </li><li> Legen Sie das Tier in einem Becherglas ohne Wasser und feuchter die Haut mit Leitungswasser, bis der Frosch ist wieder in Bewegung. Das Becherglas, um eine Flucht zu verhindern. </li><li> Trennen Sie sorgfältig die Eierstöcke Keulen in dem Medium, in Gruppen von 5 bis 10 Oozyten unter Verwendung von 2 Pinzetten unter einem Stereomikroskop mit 10-facher Vergrößerung. Wählen Oozyten im Stadium VI. Sie können durch i mit einem braunen pigmentierten Tiermast und gelben vegetative Pol durch eine klare Band ii) ihrer Größe besser als 1,2 mm Durchmesser 10 getrennt erkannt werden) ihre Form und Farbe. </li><li> Während 45 Minuten die ausgewählten Oozyten in einer Collagenase-Lösung (1 mg / ml Collagenase A aus Clostridium histolyticum, in ND96 gelöst, ohne Tetracyclin) in einer Petrischale unter leichtem Schütteln inkubieren, um die Eizelle defolliculation erleichtern (Kollagenase verdaut Eizelle / follikulären Zellverbindungen). Spülung der Oozyten 3 oder 4 mal mit ND96-Medium bei 14 gehalten° C. Hinweis: die Oozyten weniger oder mehr als 45 min, da das Risiko von Oozyten Oberflächenproteine ​​zerstören und was eine schlechte Lebensfähigkeit inkubieren nicht. Collagenase-Behandlung kann spontane GVBD induzieren. </li><li> Oozyten Inkubieren im Medium für 3-4 Std. Entfernen Follikelzellen mit feinen Pinzette unter binokularen Lupe und halten sie bei 19 ° C in ND96 Medium. </li></ol> 2. Herstellung der mRNA-Synthese <ol><li> Linearisieren 5 ug der folgenden Plasmide durch enzymatischen Verdau mit Pme I-Enzym. HINWEIS: pcDNA6.2 / V5-DEST, die ein 1599 Aminosäuren eIF4G1 cDNA Wildtyp (eIF4G1-WT; NM_198241), pcDNA6.2 / V5-DEST, die eine eIF4G1 dominant negative cDNA (eIF4G1-DN) mit Mutationen c.2105T &gt; G c.2106A&gt; C, c.2120-&gt; G, c.2122T&gt; A, 2125T&gt; - und c.2126T&gt; G im Bereich der Wechselwirkung zwischen eIF4G1 und eIF4E an Position 612 bis 618 des entsprechenden Proteins störenden Interaktion between eIF4G1 und eIF4E 8, pcDNA6.2 / C-EmGFP enthält Chloramphenicolacetyltransferase (GFP). Vorzubereiten 2 Mischungen für jede der 3-Plasmiden: Die erste darunter Pme I-Enzym, und die zweite ohne Enzym als Kontrolle. </li><li> Ausfällung von Plasmid-DNA unter Verwendung eines klassischen Ethanol Verfahren und Resuspendieren in 20 ul Nuklease-freies H 2 O. </li><li> Bestimmen Sie die Konzentration mit einem Spektralphotometer. Die Konzentration sollte überlegen sein zu 150 ng / ul an cRNA zu transkribieren. </li><li> Versuch 1 &amp; mgr; l Proben und deren Steuerungen mit 5 ul Beladungspuffer auf einem 0,8% Agarose-Gel, um die Plasmid-Linearisierung zu verifizieren. </li><li> Verwenden ein Kit zur in vitro-Transkription und cRNA Reinigung gemß den Herstelleranweisungen. Die transkribierten cRNA werden in 20 &amp; mgr; l Nuklease-freies H 2 O resuspendiert Proben können bei -80 ° C, wenn erforderlich gespeichert. </li><li> Bereiten Sie die Migration MOPS 10X-Puffer, der 0,2 M MOPS (pH 7,0), 20 mM Natriumacetat und 10 mM EDTA (pH 8,0). Sterilisieren Lösung mit einem 0,45 um Filter. Aktien des von der Licht bei RT geschützt werden, um Oxidation zu vermeiden Lösung Lösung. </li><li> Reinigen Sie die Elektrophoresetank nacheinander mit NaOH, HCl und gründlich mit doppelt gefiltertes Wasser für einen O gespült / N, um RNase zu vermeiden und zu verhindern, RNA-Abbau. </li><li> Werfen ein 1,5% Agarose-Gel mit MOPS und Formaldehyd. Warm bis zur vollständigen Agarose-Auflösung und abkühlen lassen bis 55 ° C. Unter Abzug werden 0,1 Volumen MOPS 10X, 6,6% Formaldehyd und 4 ug Ethidiumbromid (10 mg / ml). Gießen Sie das Gel unter dem Abzug und warten Sie etwa 1 Stunde für das Gel zu härten. Hinweis: Formaldehyd und Ethidiumbromid sind giftig. </li><li> Vorbereitung der Proben für die Migration in einem 0,2-ml-Röhrchen mit 1 ul cRNA, 8,8% Formaldehyd, 60% Formamid und 0,1 Volumen MOPS 10X. Inkubation für 3 min bei 70 ° C und legte die Röhrchen auf Eis für 10 min. Centrifuge Proben paar Sekunden auf5.000 x g. In 2 ul Gelladepuffer. Hinweis: Formamid ist giftig. </li><li> Laufen Proben für 20 min bei 90V. Tränken Sie das Gel in Nuklease-freies H 2 OO / N, um das Gel vor der Analyse ist es, die Qualität zu überprüfen cRNA entfärben. </li><li> Bestimmen Sie cRNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer und lagern Sie sie bei -80 ° C. </li></ol> 3. Mikroinjektion von synthetisierten RNA und Eizellen Reifung Stimulation <ol><li> Bereiten Sie die notwendige Ausrüstung für Eizellen Mikroinjektion. Verwenden Sie einen Mikropipette Abzieher für kleine Glaskapillare zu ziehen. Unter Stereomikroskop, brechen Sie das Ende der Kapillare mit der Pinzette, um ein stumpfes Ende zu schaffen. Füllen der Kapillare Mikropipette mit Mineralöl unter Verwendung einer 1 ml Spritze mit einem Millipore-Filter 0,45 um am gegenüberliegenden Ende. Montieren Sie die Mikropipette auf die Mikroinjektion Pipette. Wählen Sie eine genaue Mikropipette vom Hersteller kalibriert, um eine gute Genauigkeit, wenn sie mit entsprechenden Glaskapillare verwendet zu geben. </li><li> Führen Sie die Mikroinjektion 1-2 Stunden nach defolliculation, notwendige Verzögerung für Eizelle Erholung an Eizellen gehalten bei 14 ° C. Verwenden Petrischalen mit dem Boden kratzte mit einer Pinzette, um eine Klebefläche für Eizellen zu erstellen und füllen sie mit ND96 Medium. </li><li> Ordnen Oozyten entlang einem Kratzspur in einer Petrischale ermöglicht eine sukzessive Injektion von Oozyten mit der Kapillare Mikropipette in einem Winkel von 45 ° C. </li><li> Injizieren in die Oozyte Äquatorialzone unterhalb der pigmentierten Tierbereich für eine optimale Diffusion der Proben im Zytoplasma. Legen Sie nur den dünnsten Teil der Kapillarspitze auf etwa 150-200 &amp; mgr; m Tiefe. </li><li> Injizieren 30 ng cRNA von den verschiedenen Plasmiden in einem Volumen von 60 nl in einer ersten Oozyte jeweils erhalten. Nach der Injektion, warten Sie 5-10 Sekunden, bevor Sie die Kapillarspitze zu Proben escape (2A) zu vermeiden. Hinweis: Nehmen Sie 120 nl nicht überschreiten. Spritzen Sie so langsam, wie Sie können. Ein Steuer mit destilliertem Wasser wird empfohlen. </li><li> Verschieben Sie manuell die Petrischale, um die nächste Eizelle zu injizieren. Hinweis: Achten Sie darauf, dass die Spitze nicht durch die Erzeugung eines kleinen Impulses aus dem Bad-Lösung nach 2 bis 3 Mikroinjektionen verstopft. </li><li> Übertragungs injizierten Oozyten in 24 Vertiefungen-Kulturplatten (10 Oocyten / Vertiefung) werden mit 3 ml frischem ND96 Medium gefüllt und lassen sie auf 19 ° C. </li><li> Die Eizellen in ND96 inkubieren mit Progesteron (PG) (2 ug / ml) zu der meiotischen Reifung (GVBD) bei 19 ° C ausgelöst werden, 15 Stunden oder 4 Stunden nach der Mikroinjektion von polyadenylierter cRNAs jeweils von pcDNA6.2 / V5-DESTeIF4G1 und pcDNA6 erhalten .2 / C-EmGFP verwendet als Kontrolle (Abbildung 2A). Anmerkung: Co-Injektion von Fluoreszenzmarker mit der cRNA ist ein schönes Werkzeug, um sicherzustellen, dass die cRNA injiziert wurde und blieb in der Oocyte. Zuführen, Vorversuchen unter Verwendung eines cRNA von Interesse mit einem GFP-Tag. </li><li> Microinject wie in # 3.5 unterschiedlichen Verhältnissen (1: 3, 2: 2; 3: 1) von polyadenyliert eIF4G1-WT und eIF4G1-DN cRNAs um test die Übersetzung Wirkung eIF4G1-WT cRNAs auf dem mutierten Phänotyp (2D). </li></ol> 4. Keimbläschen Pannen Bestimmung <ol><li> Zählen Sie die Anzahl der reifen Eizellen nach der PG-Stimulation durch die Beobachtung der Gegenwart von einem weißen Fleck auf der schwarzen Tiermast mit einem Stereomikroskop. Wiederholen Sie das Zählen jede Stunde bis zum vierundzwanzigsten Stunde (2B, 2C). </li></ol> 5. Western Blot (WB) Analyse <ol><li> Homogenisierung der Gruppe von 10 Oozyten von Hin- und Herbewegungen mit einer Mikropipettenspitze, bei 4 ° C in 200 &amp; mgr; l in dem folgenden Puffer: 50 mM Hepes, pH 7,4, 500 mM NaCl, 0,05% SDS, 5 mM MgCl 2, 1 mg / ml Rinderserumalbumin, 10 mg / ml Leupeptin, 10 mg / ml Aprotinin, 10 mg / ml Sojabohnen-Trypsininhibitor, 10 mg / ml Benzamidin, 1 mM PMSF, 1 mM Natriumvanadat. </li><li> Zentrifuge Proben für 15 min bei 10.000 × g, um das Lipid (obere Phase) und der Membran (untere Phase) f entfernenractions. Sammeln Sie die cytoplasmatische Fraktion, speichern eines Aliquots auf Proteinkonzentration zu bestimmen, und die restlichen mit Laemmli oder ein Bis-Tris-Probenpuffer (1: 1). Anmerkung: Bis-Tris Gelen und Ladepuffer einen neutraleren pH die Proteine ​​durch Hydrolyse schützt </li><li> Wärme 20 ug Probe bei 95 ° C für 10 min. Laden jeder Probe in die Vertiefungen der Acrylamidgel. Legen Sie das Gel in einem Behälter mit geeigneten Puffer. </li><li> Führen eine Elektrophorese für 1 h bei 200 V. </li><li> Realisieren WB in TBS pH 8,0 (Tris HCl 15 mM, NaCl 150 mM, Tween 0,1%, das 10% Rinderserumalbumin) mit einem Ziege-Anti-Aurora-A / Eg2 (1: 3000, 2 h) oder mit Kaninchen-Anti -Aurora A / Eg2-P (1: 1000, O / N bei 4 ° C), Maus-anti-ERK2 (1: 3000, 2 h), Ziege-anti-ERK2-P (Tyr204) (1: 3000, 2 h ), Kaninchen-Anti-mos (1: 5000, 4 h), Kaninchen-Anti-GFP (1: 3000, 2 h) antibodies.Use Antikörper Maus-anti-V5 (1: 10.000, 2 h) und Kaninchen-Anti-Rsk (1 : 1000, 2 h) (als Lade Kontrollen). </li><li> Washdie Membran 3 x 10 min in TBS-Tween und inkubiere 1 h entweder mit einem Anti-Maus oder Anti-Kaninchen oder Anti-Ziege (IgM) Meerrettichperoxidase-markierter sekundärer Antikörper in Verdünnungen von 1: 5.000, 1: 7.500 bis 1 : 5,000 auf. </li><li> Führen Sie 3 Waschungen von 10 min in TBS-Tween und erfassen die Antigen-Antikörper-Komplexe mit dem Advanced ECL-Nachweissystem. </li></ol> 6. Polyadenylierung Assay <ol><li> Probe 5 Oozyten pro Bedingung in einem 1,5 ml. Mit 1 ml Nuklease-freies PBS 1X (pH 7,4) waschen. Die folgenden Schritte werden unter Abzug durchgeführt werden. </li><li> Auszug RNA unter Verwendung eines klassischen organischen Verfahren (siehe Anweisungen des Herstellers). </li><li> Erholen RNA durch Zentrifugation (10.000 × g) für 5 min bei 4 ° C. Überstand entfernen und an der Luft trocknen RNA für 10 min. </li><li> Resuspendieren RNA-Pellet in 30 &amp; mgr; l Nuklease-freies H 2 O. </li><li> Nehmen Sie 15 ul der Proben in ein neues Röhrchen und fügen Sie 85 ul Nuklease-freies H 2 O. Bereinigen Sie diese Proben, um ihre Qualität zu Spalte Kieselsäure ist nach den Anweisungen des Herstellers zu verbessern. Elution der RNA unter Verwendung von 30 ul Nuklease-freies H 2 O </li><li> Versuch 1 ul-Proben mit 5 ul Beladungspuffer auf einem 0,8% Agarose-Gel, um die RNA-Integrität zu überprüfen. </li><li> Bestimmen Sie die RNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer. </li><li> Vorzubereiten 2 Ligierungsgemische pro Bedingung (dh eIF4G1-WT, eIF4G1-DN und die H 2 O-Kontrolle) mit den folgenden Reagenzien: 10 U RNA-Ligase, 0,1 Volumen 10x-Puffer, 1 mM ATP, 10% PEG8000 50% 0,1 ug Primer P1 (5&#39;-P-GGTCACCTTGATCTGAAGC-NH2-3 &#39;) 11 und bringen das Endvolumen auf 10 ul mit Nuklease-freiem H 2 O. Hinzufügen in dem ersten Gemisch aus RNA Oozyten ohne PG-Stimulation erhalten und in der zweiten Mischung RNA aus PG erhalten stimuliert Oozyten. </li><li> Inkubation für 1 h bei 37 ° C dann 20 min bei 65 ° C, um das Enzym zu inaktivieren. </li><li> Unsea cDNA Reverse Transkription (RT) Kit. Bereiten Sie die RT-Mischung, je Rohr: 0,1 Volumen 10X RT-Puffer, 0,1 ug Primer P2 (5&#39;-GCTTCAGATCAAGGTGACCTTTTT) 10, 4 mM dNTP-Mischung, 50 U der reversen Transkriptase und komplett mit Nuklease-freies H 2 O auf ein Endvolumen von 10 &amp; mgr; l. Zugabe von 10 ul Ligationsreaktions zuvor erhaltenen. Führen Sie die RT unter dem vom Hersteller beschriebenen Bedingungen. </li><li> Vorbereitung Polymerase Chain Reaction (PCR), die aus je Röhrchen: 0,1 Volumen Puffer 10X, 1,5 mM MgCl 2, 133 &amp; mgr; M dNTP-Gemisch, 0,2 uM spezifischen Primer, 0,2 &amp; mgr; M Primer P2, 0,025 U Taq-Polymerase, 1 &amp; mgr; l cDNA und komplett mit Nuklease-freies H2 O auf ein Endvolumen von 50 ul. Führen Sie die PCR unter den folgenden Bedingungen: 50 ° C für 2 min, 95 ° C für 10 min, [95 ° C für 1 min, 56 ° C für 30 sec, 72 ° C für 30 s] * 40 Zyklen, 72 ° C für 10 min 9. Die spezifischen Primer sind wie folgt: mos, GTTGCATTGCTGTTTAAGTGGTAA Histon-ähnlichen B4, AGTGACAAACTAGGCTGATATACT; Cyclin A1, CATTGAACTGCTTCATTTTCCCAG; Cyclin B1: GTGGCATTCCAATTGTGTATTGTT 9. </li><li> Bereiten Sie einen 3% igen Agarosegel. Fügen Sie in jeder PCR-Produkte 10 ul Auftragspuffer. Führen Sie das Gel mit 10 ul der Proben bei 110 V für eine optimale Migration. Analyse des Gels nach 10 und 20 Minuten, um eine Änderung der Größe des Reflexions Länge des Schwanzes poly (A) und somit der RNA-Reifung, die eine Voraussetzung für die Übersetzung ist zu beobachten. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Translation ist ein Mechanismus in der Pathophysiologie von zahlreichen menschlichen Erkrankungen einschließlich mehreren neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt. Zum Beispiel in der Parkinson-Krankheit mehrere Berichte vorgeschlagen, die Wertminderung in der Übersetzung mit erblichen Mutationen 8,12,13 verbunden. Mehrere zelluläre Modelle stehen zur Verfügung, um die Translation zu studieren. Hier wird, um die translatorische Folgen einer Mutation in eIF4G1, die als dominant-ne...

Proteine ​​sind wesentliche Elemente des zellulären Lebens und damit zu größeren Maßstab des Organismus. Sie sorgen für die Mehrzahl von Zellfunktionen einschließlich der Struktur, Transport, Reaktionskatalyse, Regulierung der Genexpression usw. Ihre Expression ist das Ergebnis eines komplexen Mechanismus der Übersetzung für die Konvertierung einer mRNA in Protein. Die Übersetzung wird auf verschiedene Kontrollen unterzogen, sich anzupassen und die Genexpression nach den Zell Anforderungen während der Entwicklung und Differenzierung, Alterung, physiologischen Spannungen oder pathologischen Erscheinungen regulieren. Über Internal Ribosome Entry Segment (IRES) Strukturen und CAP-unabhängige Translation Enhancers (cap-abhängige, cap-unabhängig: Die Übersetzung wird in 3 Phasen (Initiation, Elongation und Termination) und präsentiert 3 Einleitung Übersetzungssysteme, um auf diese Bedürfnisse zu reagieren unterteilt CITE). Meisten eukaryotischen mRNA in einer cap-depe setztenndent Weise über die 7-Methylguanosin 5&#39;-Triphosphat Kappe, die als Erkennungsfunktion während der Proteinsynthese dient. Diese Kappe bindet an eIF4E, einer Komponente von eIF4F Komplex mit eIF4G1 und eIF4A. Mit anderen Partnern wie Poly (A) Binding Protein (PABP) verbunden sind, eIF2-GTP-Met-tRNA Met, damit diese Translationsinitiationsfaktoren, um mRNA zirkularisieren und 43S-Komplex zur Verbesserung seiner Zugänglichkeit zu Formen bis zum August Initiationscodon Anerkennung 1. Dieses Ereignis entspricht dem Ende der Translationsinitiations dh dem ersten Schritt der Übersetzung. CAP-unabhängige Translation von mRNA-Codierung für essentiellen Proteine ​​unter Stressbedingungen, die beispielsweise Zellproliferation und Apoptose induzieren. Dieser Mechanismus beinhaltet Sekundärstrukturen der mRNA-5&#39;-untranslatierten Region (UTR) bezeichnet IRES, dem Carboxy-terminalen Ende mit eIF4G1 eIF4A und dem 43S-Komplex assoziiert. Die Bindung dieser 43S vorge Einleitung complexe IRES leitet die Kappe unabhängige Translation ohne eIF4E Faktor 2,3. Schließlich ist ein weiterer Übersetzungsmechanismus noch nicht gut verstanden unterstützt diese CAP-unabhängige Translation Aktivität unter Stressbedingungen über CITE Strukturen innerhalb mRNA UTR 4 entfernt. Durch diese verschiedenen Formen der Übersetzung, die sich um ihre Initiationsschritte spielt Übersetzung eine entscheidende Rolle bei der zellulären Homöostase und jede Änderung in einer dieser Prozesse würde somit beeinflussen den Organismus mit kleinen bis großen Skaleneffekten. In der Tat ist die Einleitung einer geschwindigkeitsbestimmenden Schritt über die richtigen Übersetzungsprozesse von mRNA in Proteine ​​und damit das Ziel von zahlreichen Kontrollen und Regulierungspunkte 5. Ob es sich für die letztere oder für Komponenten dieser Prozesse, wenn man stellt sich heraus, um defekt zu sein, wird es das vorgegebene Gleichgewicht in der Zelle zu stören und so konnten pathologische bedingungen führengen. In diesem Zusammenhang haben Mutationen in Translationsfaktoren in mehreren Erkrankungen einschließlich neurodegenerativer Störungen wie `Leukoenzephalopathie mit verschwindender weißen Materie&#39; (eIF2B1-5 Untereinheit) 6, in Walcott-Rallison Syndrom (EIF2AK3 kodierenden Gen PERK) 7, potentiell in involviert Parkinson-Krankheit (eIF4G1 p.R1205H) 8. Es ist daher wichtig, um zelluläre und molekulare Studien dieser mutierten Proteine ​​durchzuführen, um das Wissen über die Entwicklung der Krankheit und dem allgemeinen Verfahren der Translationsinitiation zu erhöhen. Zur Durchführung dieser Studien ist es wichtig, um die am besten geeigneten Modellen wählen, die Konsequenzen dieser Mutationen beobachten Xenopus laevis Oozyten sind besonders gut aufgrund ihrer physiologischen und biochemischen Eigenschaften angepasst:. Physiologische Synchronizität (in der Phase G2 des Zellzyklus blockiert) , hohe Kapazität der Proteinsynthese (200-400 ng / Tag / Eizelle), hohe Anzahl von extrahierten oocytes aus demselben Tier (800-1.000 Oozyten / weiblich) und der Zellgröße (1,2-1,4 mm Durchmesser), die ihre Handhabung vereinfacht. Mikroinjektion von Xenopus-Oozyten synthetisierte mRNA leicht durchgeführt werden, um die Translation Schritte zu zerlegen. In dieser Ansicht zeigt es andere Vorteile. Angesichts der Geschwindigkeit der Meiose Progression und der Übersetzung nach der mRNA Mikroinjektion (~ 24 Stunden), Xenopus-Oozyten eine schnelle System im Vergleich zu rekonstituierten Zellsystemen (aus E. coli extrahiert, Weizenkeime oder Kaninchen-Retikulozyten ...), in der eine mRNA ist setzten mit einer reduzierten Translationsrate und mit einer niedrigeren Geschwindigkeit. So werden die Auswirkungen einer Mutation in einer mRNA eingeführt schnell beobachtbar und einfach in verschiedenen Oozyten untersucht werden. Ein weiterer Vorteil des Xenopus-Oozyten, dass mütterliche mRNAs sind latent und Proteintranslation vor Progesteron Stimulation blockiert. Zugabe von Progesteron ist ein geeignetes Mittel zur Steuerung des Übersetzungs Induktion. Cytoplasmic polyadenylation nicht während der Oogenese auftreten. Es beginnt bei der Eizellreifung in Progesteron-stimulierten Eizellen in einer zeitlichen Reihenfolge und setzt sich während der frühen Entwicklung und könnte verwendet werden, um die verschiedenen Schritte der Übersetzung zu untersuchen. Die Polyadenylierung mos mRNA ist unter den ersten, auftreten, und es gehört mit Aurora A / Eg2, histonähnlichen B4 mRNA zur Klasse der &quot;frühen Reifung&quot; Gene als in Charlesworth et al definiert. (2004) 9. Die Translations Induktion der &quot;späten&quot; mRNA wie Cyclin A1 und Cyclin B1 tritt um die Zeit der Keimbläschen Aufteilung (GVBD). MOS-mRNA kodiert für ein Serin / Threonin-Proteinkinase. Die Übersetzung ist von entscheidender Bedeutung, da sie die MAP-Kinase-Kaskade, die indirekt aktiviert die Eizellreifung induziert. Zwar in Reaktion auf Progesteron, Polyadenylierung mos-mRNA wird durch ein Verfahren mit Aurora A / Eg2 regulatorische Proteine ​​und andere RNA-Bindungsproteine ​​mit verbesserten the 3&#39;UTR mos-mRNA. Diese erhöhte Polyadenylierung mos-mRNA führt zu einer Erhöhung des MOS Proteinebene, die wiederum aktiviert MEK1. Dieser Vorgang vermittelt die Aktivierung von extrazellulären signalregulierten Kinase 2 (ERK2) (Abbildung 1). Diese Signalkaskade kann dann lösen die Reifung M-Phasen-fördernde Faktoren, einen Komplex von Cyclin B und Cdc2 Kinase gebildet und schließlich zu meiotische Wiederaufnahme. Daher in Xenopus laevis Oozyten, könnte die Untersuchung der mütterlichen mRNA wie MOS leicht verwendet werden, um ihre Translatierbarkeit mit mehreren Endpunkten ihrer effiziente Polyadenylierung der Übersetzung mehrerer MOS-Signalkomponenten, darunter auch die Bestimmung des GVBD Geschwindigkeit testen. Dieses System ist daher interessant, die ersten Folgen von Mutationen in Translationsinitiationsfaktoren ohne Einmischung von neu transkribierten mRNA oder der Transfektionseffizienz zu bewerten, Probleme oft mit eukary vorkommendeOhrzellstudien. Hier wird ein Protokoll eingesetzt, wo eine Mutante eIF4G1 mRNAs mikroinjiziert in Xenopus laevis Oozyten und die Übersetzung der mütterlichen mRNA getestet. In Gegenwart von einem Defekt in GVBD Progression, mos mRNA Polyadenylierung, die durch die Eizelle meiotischen Zellzyklus und für die nachfolgende Übersetzung der frühen und späten Klasse mRNAs essentiell für Progression ermittelt. Die Phosphorylierung Aurora A / Eg2 und ERK wird auch untersucht, um die Folge der mos deregulation.Thus bestätigen Xenopus-Oozyten, sind ein einfacher Weg, um verschiedene Schritte der mRNA-Translation zu analysieren.

<table><tbody><tr><td>Tricain-Methansulfonat</td><td>Sandoz</td><td>MS-222</td><td>Eizellen für</td></tr><tr><td>den Umgang mit Zangen</td><td>Moria</td><td>Dumont MC40</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin/Penicillin</td><td>Sigma</td><td>781</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor</td><td>Sigma</td><td>T9128</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyclin</td><td>Sigma</td><td>T7660</td><td></td></tr><tr><td>Tierarzt resorbierbares Vicryl-Garn</td><td>Johnson& Johson Intl</td><td>JV1205</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase A</td><td>Roche Diagnostik</td><td>10103586001</td><td></td></tr><tr><td>PmeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0560S</td><td>Herstellung von synthetischer mRNA</td></tr><tr><td>DNAse/RNAse frei H2O</td><td>Life Technologies</td><td>10977</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetat</td><td>Merck</td><td>6268</td><td></td></tr><tr><td>Absolutes Ethanol</td><td>Sigma</td><td>02854</td><td></td></tr><tr><td>Nano Drop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TBE 10X</td><td>Eppendorf</td><td>0032006.507</td><td></td></tr><tr><td>Ethidiumbromid 10 mg/ml</td><td>Life Technologies</td><td>15585-011</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE Kit</td><td>Ambion by Life Technologies</td><td>AM1344</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fluka</td><td>03609</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Life Technologies</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd 37%</td><td>Merck</td><td>1.04003.1000</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Fluka</td><td>47671</td><td></td></tr><tr><td>Gel Doc Imager</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eizellpipette mit 100 8" Glaskapillaren</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-510-X</td><td>Mikroinjektion</td></tr><tr><td>Ersatzglas 8"</td> <td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-210-G8</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &micro; m Filter</td><td>Millipore</td><td>SLHA025NB</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma</td><td>P0130</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Biorad</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma</td><td>A4612</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin,</td><td>Sigma</td><td>L8511</td><td></td></tr>, <tr><td>Aprotinin</td>, <td>Sigma</td><td>A1153</td><td></td></tr>, <tr><td>Benzamidin</td><td>, Sigma</td><td>B6506</td><td></td></tr>, <tr><td>PMSF</td>, <td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr>, <tr><td>Natriumvanadat</td><td>, Sigma</td><td>S6508</td><td></td></tr>, <tr><td>Laemmli-Puffer</td>, <td>Biorad</td><td>161-0737</td><td></td></tr>, <tr><td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gele, 1,0 mm, 15 Well</td><td>Life Technologies</td><td>NP0323BOX</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE Elektrophorese, mini-Protean TGX</td><td>Biorad</td><td>456-1036 und -1096</td><td></td></tr><tr><td>horizontales Semi-Dry-Blotting-System</td><td>W.E.P. Compagny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Biorad</td><td>161-0718</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Biorad</td><td>161-0719</td><td></td></tr><tr><td>Hybond ECL Membran</td><td>Amersham Life Science</td><td>10401180</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>VWR</td><td>20846-292</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau Rot (0,5%)</td><td>Sigma</td><td>P3504</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP</td><td>Life Technologies</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>Anti-V5</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-58052</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Eg2</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-27884</td><td></td></tr><tr><td>anti-Eg2-P</td><td>Cell Signaling</td><td>C39D8</td><td></td></tr><tr><td>anti-ERK2</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-1647</td><td></td></tr><tr><td>anti-ERK2-P (Tyr204)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7976</td><td></td></tr><tr><td>anti-Rsk</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-231</td><td></td></tr><tr><td>anti-mos</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-86</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus-Meerrettich-Peroxidase-markierter Sekundärantikörper</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen-Meerrettich-Peroxidase-markierter Sekundärantikörper</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2812</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Meerrettich-Peroxidase-markierter Sekundärantikörper</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2378</td><td></td></tr><tr><td>Erweitertes ECL-Nachweissystem</td><td>Amershan Life Science</td><td>RPN2135</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td>Polyadenylierungsassay</td></tr><tr><td>TRIZOL (Qiazol Lysereagenz)</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>31998-8</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma</td><td>278475-1L</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini-Kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>RTL Puffer</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td></td></tr><tr><td>RNAse freie DNAse Set</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Primer</td><td>Eurogentec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA-Ligase 1&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204S</td><td></td></tr><tr><td>C-DNA-Reverse-Transkriptionskit mit hoher Kapazität</td><td>Applied Biosystems, Life Technologies</td><td>4368813 Taq-Polymerase</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Life Technologies</td><td>10342020</td><td></td></tr></tbody></table>

xenopus laevis als modell zur Übersetzung impairment identifizieren

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Die Proteinsynthese ist ein fundamentaler Prozess, um die Genexpression beeinflussen vielfältigen biologischen Prozesse, insbesondere die Anpassung an Umweltbedingungen. Die Initiierungsschritt, der den Zusammenbau der ribosomalen Untereinheiten auf der mRNA-Initiationscodon beteiligten Initiationsfaktor einschließlich eIF4G1 beinhaltet. Defekte in diesem geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Translation an verschiedenen Erkrankungen verbunden. Um die möglichen Folgen eines solchen Deregulierungen studieren, Oozyten von Xenopus laevis bilden ein attraktives Modell mit hohem Grad von der Erhaltung der wesentlichen zellulären und molekularen Mechanismen mit menschlichen. Darüber hinaus soll während meiotischen Reifung Oozyten transkriptionell unterdrückt und alle notwendigen Proteine ​​aus bereits vorhandenen, maternalen mRNAs umgerechnet. Dieses preisgünstige Modell ermöglicht exogene mRNA, um perfekt mit einem effektiven Übersetzungs integriert werden. Hier ist ein Protokoll für die Bewertung der Übersetzung mit einem Faktor von Interesse (hier eIF4G1) mit stor beschriebened mütterlichen mRNA, die die ersten sind, um polyadenylierte und während Oocytenreifung als physiologischer Auslese übersetzt werden. Zuerst mRNA durch in vitro-Transkription von Plasmiden von Interesse (hier eIF4G1) synthetisiert werden in Oozyten und die Kinetik der Oocytenreifung von Keimbläschen Schlagerkennung injiziert wird bestimmt. Die untersuchten mütterlichen mRNA Ziel ist die Serin / Threonin-Proteinkinase mos. Seine Polyadenylierung und die anschließende Übersetzung zusammen mit der Expression und Phosphorylierung von Proteinen des MOS-Signalkaskade in Eizellreifung Beteiligten untersucht. Variationen des derzeitigen Protokolls zu unterbreiten Translationsfehlern werden ebenfalls vorgeschlagen, um der Allgemeinheit zu betonen. Angesichts der zunehmend Hinweise, dass aberrante Proteinsynthese kann in der Pathogenese von neurologischen Erkrankungen beteiligt sein, bietet ein solches Modell die Möglichkeit, leicht zu beurteilen diese Beeinträchtigung zu erkennen und neue Ziele.

Kinetic Reifung des Xenopus-Oozyten und die Bestimmung des Prozent Eizelle GVBD nach 24 Stunden von PG-Stimulation (2B, 2C): Um die translatorische Folgen der eIF4G1-DN Genmutationsversuch die Reaktion auf PG in Xenopus laevis Oozyten mit cRNA eIF4G1-DN mikroinjiziert wird eIF4G1-WT und auf andere Steuerbedingungen (H 2 O, GFP) verglichen. Die Kontrollen zu ermöglichen, das Auftreten von Oozyten Mikroinjektion unabhängig von der Art des eingespri...

Die Kontrolle der Proteinsynthese erfolgt hauptsächlich im Initiationsschritt der Translation, dessen Mängel mit verschiedenen Störungen verbunden sind. Um ihre Ätiologie besser zu verstehen, haben wir hier ein Protokoll mit Xenopus laevis Eizellen beschrieben, das die Translation des mos-Transkripts in Gegenwart einer Mutante des Translationsinitiationsfaktors eIF4G1 bewertet.

Xenopus laevis als Modell zur Übersetzung Impairment Identifizieren

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die ersten Folgen von Mutationen in Translationsinitiationsfaktoren zu bewerten, ohne dass neu transkribierte mRNA oder Probleme mit der Transfektionseffizienz, wie sie häufig bei Studien an eukaryotischen Zellen auftreten, störend wirken. Dies wird erreicht, indem zunächst mutante, wilde Typ- und Kontroll-mRNA oder GFP-mRNA aus entsprechenden Plasmiden synthetisiert werden. Anschließend wird die synthetisierte RNA in XUS Lavis-Zellen im Stadium sechs mikroinjiziert, und ihre Reifung wird mittels Progesteron stimuliert.Dann wird die Oozytenreifung durch die Visualisierung des Keimblasenzerfalls bewertet, und einige Komponenten der MA-Kinase-Kaskade, deren Aktivierung von der Moss-Proteinexpression abhängt, werden mittels Western Blot analysiert. Schließlich wird die mRNA-Polyadenylierung von moss und anderen mRNA-Molekülen, die für die Wiederherstellung der Meiose in XPO-Oozyten notwendig sind, untersucht. Letztendlich die kinetische Oozytenreifung.Western Blot- und Polyadenylierungsanalysen werden verwendet, um einen möglichen Einfluss auf die Proteink表达ung zu zeigen, wenn ein Faktor der Translationsinitiierung mutiert ist. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber unseren bestehenden Methoden oder rekonstituierten zellulären Systemen, die aus gleichem Maße aus Keimzellen oder Kaninchenretikulozyten gewonnen wurden, besteht darin, dass die Auswirkungen einer in eine mRNA eingeführten Mutation schnell beobachtbar und leicht in mehreren Zelltypen untersucht werden können.Dieses Modell bietet die Vorteile der Einfachheit aufgrund seiner einzigen riesigen Zellen, und seine Verwendung führt zu einer beträchtlichen Menge an Material für biochemische Experimente. Dieser Prozess ist außerdem im Vergleich zur Erzeugung stabiler Zelllinien zeiteffizient. Dieses Miso kann helfen, zentrale Fragen in der Translationsforschung zu beantworten, beispielsweise um die Rolle spezifischer Domänen von Initiationsfaktoren besser zu verstehen oder die Spleißung dieser Faktoren zu untersuchen.Wir brachten die Idee für diese Methode erstmals ein, als wir die Auswirkungen eines mutierten Initiationsfaktors der Translation auf die Proteinsynthese ohne Störung durch die Transkription untersuchen wollten. Auf diese Weise vermeiden wir mögliche Rückkopplungsschleifen zwischen diesen beiden zentralen Mechanismen. Tatsächlich werden transkriptionelle Materialien gespeichert und bereitgestellt.Die Translation kann mit Progesteron ausgelöst werden. Nach dem Defäkieren, dem Waschen der Zellen und der Vorbereitung von CRN gemäß dem Textprotokoll, verwenden Sie 10 x MOPS und 6,6 % Formaldehyd, um ein 1,5 %iges AROS-Gel herzustellen. Bereiten Sie die Proben in einem 0,2-Milliliter-Röhrchen mit 8,8 % Formaldehyd, 60 Prozent für AMID, 0,1 Volumenanteilen 10 x MOPS und einem Mikroliter CRNA vor, inkubieren Sie bei 70 Grad Celsius für drei Minuten und stellen Sie die Röhrchen anschließend 10 Minuten lang auf Eis. Zentrifugieren Sie die Proben bei 5.000 × g für einige Sekunden, bevor Sie zwei Mikroliter Gelpuffer hinzufügen.Führen Sie die Proben 20 Minuten lang bei 90 Volt durch, um das Gel ablaufen zu lassen. Tauchen Sie es über Nacht in nukleasefreies Wasser ein. Analysieren Sie es anschließend, um die Qualität der CNA zu überprüfen.Verwenden Sie ein Spektrophotometer, um die CNA-Konzentration zu bestimmen, und lagern Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius, um eine Mikroinjektion von RNA durchzuführen. Füllen Sie eine angeritzte Petrischale ein bis zwei Stunden nach der Entlaubung mit ND-96-Medium. Ordnen Sie die Zellen entlang einer angeritzten Bahn in der Schale an.Danach unter Verwendung einer Kapillarmikropipette mit abgebrochener Spitze, die in einem Winkel von 45 Grad gehalten wird: Führen Sie die Kapillarspitze etwa 150 bis 200 Mikrometer tief in die äquatoriale Zone unterhalb des pigmentierten animalen Bereichs ein. Injizieren Sie 30 Nanogramm cRNA in 60 Nanolitern in die erste Oozyte.Warten Sie anschließend fünf bis 10 Sekunden, bevor Sie die Kapillarspitze entfernen, um ein Auslaufen der Probe zu verhindern. Um die nächste Zelle zu injizieren, bewegen Sie die Petrischale manuell. Überführen Sie die injizierten Zellen in 24-Well-Kulturplatten, die mit drei Millilitern ND 96-Medium gefüllt sind, und inkubieren Sie sie bei 19 Grad Celsius, um die mitotische Reifung auszulösen.Die Oozyten in ND 96 mit zwei Mikrogramm pro Milliliter Progesteron oder PG bei 19 Grad Celsius für 15 Stunden inkubieren. Den Translationseffekt von Wildtyp-EIF-4G-1-cRNAs am Mutantenphänotyp gemäß dem Textprotokoll prüfen. Den Grad des Keimvesikelbruchs unter einem Stereomikroskop bestimmen.Zählen Sie die Anzahl der reifen Zellen nach PG-Stimulation anhand des Vorhandenseins eines weißen Flecks am schwarzen Animalepol. Wiederholen Sie die Zählung stündlich bis zur 24. Stunde, um die Western-Blutanalyse durchzuführen. Verwenden Sie die vorwärts-rückwärts-Bewegungen einer Mikropipettenspitze bei vier Grad Celsius, um 10 Zellen in 200 Mikrolitern des hier gezeigten Puffers zu homogenisieren.Zentrifugieren Sie die Proben bei 10.000 ×g für 15 Minuten, um die cytoplasmatische Fraktion in der Mitte zu gewinnen. Trennen Sie die obere, lipidhaltige Fraktion, und die untere, zellulären Trümmern entsprechende Fraktion ab. Sammeln Sie die cytoplasmatische Fraktion und lagern Sie eine Aliquotprobe zur Bestimmung der Proteinkonzentration.Vermischen Sie das verbleibende Material im Verhältnis 1:1 mit Lämmli- oder Biss-Probeauftragpuffer, bevor Sie eine SDS-Page und eine Western-Blot-Analyse gemäß dem Textprotokoll durchführen. Um einen Polybelüftungs-Assay durchzuführen, geben Sie fünf Zellen pro Bedingung in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Milliliter nukleasefreiem 1x PBS und waschen Sie die Zellen.Danach unter dem Abzug gemäß Herstelleranweisungen ein RNA-Extraktionskit verwenden, um die RNA zu isolieren. Nach Überprüfung der RNA-Integrität und Bestimmung der Konzentration zwei Ligationsansätze pro CRNA-Bedingung mit den folgenden Reagenzien für den ersten Ansatz vorbereiten. RNA aus nicht mit pg stimulierten Zellen zum ersten Ansatz hinzufügen und zum zweiten Ansatz.Fügen Sie RNA aus PG-stimulierten Oozyten hinzu. Inkubieren Sie eine Stunde bei 37 Grad Celsius und anschließend 20 Minuten bei 65 Grad Celsius. Um das Enzym mit einem CD NA-Umkehrtranskriptionskit zu inaktivieren.Bereiten Sie für jede Probe die hier aufgeführte RT-Mischung vor. Geben Sie 10 µL der zuvor vorbereiteten Ligationsreaktion hinzu und führen Sie die RT gemäß den Herstelleranweisungen durch, nachdem Sie PCR mit der folgenden Reaktionsmischung und den Bedingungen durchgeführt haben. Geben Sie jeweils vier µL Ladebuffer zu jeder Reaktion hinzu und laufen Sie jeweils 10 µL jeder Probe auf einem 3 %igen Agarosegel bei 110 Volt. Analysieren Sie das Gel schließlich nach 10 und 20 Minuten, um eine Größenänderung zu beobachten, die die Länge des PolyA-Schwanzes und damit die RNA-Reifung widerspiegelt, eine Voraussetzung für deren Translation.Wie hier gezeigt, ist die kinetische Reifung von unter Kontrollbedingungen mikroinjizierten Oozyten vergleichbar mit der Wildtyp-Oozyten, wobei ähnliche Zahlen nach 12 und 24 Stunden nach PG-Stimulation, 24 Stunden nach PG-Stimulation, GVBD durchlaufen. Der Prozentsatz der Oozyten, die die Reifung erreichen, ist für den Wildtyp sowie für Wasser- und GFP-injizierte Kontrollen vergleichbar, was darauf hinweist, dass die Mikroinjektion mit Wasser oder Kontroll- oder EIF4G1-mRNAs kaum Auswirkungen auf die Oozytenmeiose hat. Die Mikroinjektion mit der dominant-negativen EIF4G1-mRNA führte dagegen zu einer dramatischen Abnahme der GVBD, selbst nach PG-Stimulation. Diese Abbildung zeigt, dass der Reifungsdefekt durch die Wildtyp-mRNA wiederhergestellt werden kann, wenn das Verhältnis von Wildtyp- zu dominant-negativer EIF4G1-mRNA zunimmt.Ebenso der Prozentsatz an Zellen, die wie erwartet die Reifung durchlaufen. Kein endogener MoSS-Ausdruck wird in Abwesenheit einer PG-Stimulation nachgewiesen, und die Überexpression von EIF4G1, einer dominanten negativen Form, hat, wie zuvor gezeigt, kaum Auswirkungen auf den endogenen MoSS. Zusätzlich zeigt Aurora AEEG2, das upstream der MoSS-Induktion wirkt, keinerlei Hinweise auf eine Proteinde-regulierung oder auf die nach PG-Stimulation induzierte phosphorylierte Form.Umgekehrt wird die durch Moos induzierte Phosphorylierung von irk zwei in Gegenwart des dominant-negativen EIF 4G eins gehemmt. Ist die Methode einmal beherrscht, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von fünf Tagen durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, 120 Nanoliter CNA mit einer Konzentration unterhalb bestimmter Nanogramm nicht zu überschreiten, wenn der Anweisung folgend vorgegangen wird.Obwohl Methoden wie die Polysomenprofilierungsanalyse durchgeführt werden können, um weitere Fragen zu beantworten, beispielsweise welche RNA möglicherweise schlecht oder stark translatiert wird.

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Dieser Artikel stellt eine bequeme und schnelle Methode für die verschiedenen neuronalen Zellpopulationen im zentralen Nervensystem von Xenopus - Embryonen zu visualisieren mit Immunfluoreszenzanfärbung auf Abschnitte.

Die Beurteilung Primäre Neurogenese in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonen Immunostaining

Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zum visualisieren und lokalisierte Übersetzung Veranstaltungen in subzelluläre Kompartimente zu quantifizieren. In diesem Manuskript vorgeschlagene Vorgehensweise erfordert eine grundlegende confocal imaging-System und Reagenzien und ist schnell und kostengünstig.

Quantitative Immunfluoreszenz Maßnahme Global lokalisierte Übersetzung

Xenopus Kaulquappen bieten eine einzigartige Plattform, um die Funktion des Nervensystems in vivo zu untersuchen. Wir beschreiben Methoden zur Bewertung der Verarbeitung der Geruchsinformation im Wohnzimmer Xenopus Larven unter Normalbedingungen Aufzucht oder nach Verletzungen.

Funktionsauswertung olfaktorische Wege im Leben Xenopus Kaulquappen

In diesem Artikel stellen wir zwei ergänzende Methoden vor, um spezifische Raten von translationalem Fehler und Fehlinterpretation im Modell mycobacterium, Mycobacterium smegmatis, mitGain-of-Funktions-Reporter-Systemen zu messen. Die Methoden können eingesetzt werden, um genaue Fehlerraten bei geringem Durchsatz oder relative Fehlerraten in einer höheren Durchsatzeinstellung zu messen.

Messung spezieller mycobakterieller Mistranslation-Raten mit Funktionsfunktionen

Dieses Protokoll soll zeigen, wie man ein DNA/DOTAP-Gemisch in Augenknospen von eintägigen Xenopus laevis Embryonen mikroinjiziert und wie man einzelne grüne fluoreszierende Proteine (GFP) abbilden und rekonstruieren kann, die optische axonale Lauben in tektalen Midhirnen von intakte, lebende Xenopus Kaulquappen.

Mikroinjektion von DNA in Augenknospen in Xenopus laevis Embryonen und Bildgebung von GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Dieses Protokoll beschreibt einen Reporter-Assay zur Untersuchung der Regulation der mRNA-Translation in einzelnen Eizellen während der In-vitro-Reifung.

Definition des Programms der mütterlichen mRNA-Translation während der In-vitro-Reifung mit einem Single Oocyte Reporter Assay

Die Entwicklung des Säugetiergehirns erfordert eine ordnungsgemäße Kontrolle der Genexpression auf der Ebene der Translation. Hier beschreiben wir ein Polysomen-Profiling-System mit einer einfach zu montierenden Sucrose-Gradientenerstellungs- und Fraktionierungsplattform, um den Translationsstatus von mRNAs im sich entwickelnden Gehirn zu bewerten.

Analyse der Übersetzung im sich entwickelnden Mausgehirn mit Polysome Profiling

Hier wird ein effektives Protokoll zur schnellen Blutperfusion vorgestellt, um Gewebeproben von afrikanischen Krallenfröschen für Transkriptomik- und Proteomik-Studien vorzubereiten.

Effektive schnelle Blutdurchblutung bei Xenopus

Erfahren Sie, wie Mutationen in Translationsinitiationsfaktoren mit Xenopus laevis-Oozyten untersucht werden. Diese Methode ermöglicht die Analyse der mos-mRNA-Translation ohne Störfaktoren.

Xenopus laevis als Modell zur Übersetzung Impairment Identifizieren

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