Xenopus laevis als Modell zur Übersetzung Impairment Identifizieren

Die Kontrolle der Proteinsynthese erfolgt hauptsächlich im Initiationsschritt der Translation, dessen Mängel mit verschiedenen Störungen verbunden sind. Um ihre Ätiologie besser zu verstehen, haben wir hier ein Protokoll mit Xenopus laevis Eizellen beschrieben, das die Translation des mos-Transkripts in Gegenwart einer Mutante des Translationsinitiationsfaktors eIF4G1 bewertet.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die ersten Folgen von Mutationen in Translationsinitiationsfaktoren ohne Interferenz mit neu transkribierter mRNA oder von Transfektionseffizienzproblemen, die bei eukaryotischen Zellstudien häufig auftreten, zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst mutierte Wildtyp- und Kontroll-RNA (GFP-mRNA) aus entsprechenden Plasmiden synthetisiert wird. Als nächstes wird synthetisierte RNA im sechsten Stadium in XUS Lavis-Zyten mikroinjiziert, und ihre Reifung wird mit Progesteron stimuliert.

Dann wird die Cyt-Reifung durch Visualisierung des Keimvesikulaabbaus bewertet und einige der Komponenten der MA-Kinase-Kaskade, deren Aktivierung von der Moosproteinexpression abhängt, werden mittels Western Blot analysiert. Schließlich wird die mRNA-Polyadenylierung von Moos und anderen mRNAs, die für die Wiederherstellung der Myose von XPO-Zyten notwendig sind, untersucht. Letztendlich kinetische Zytreifung.

Western-Blot- und Polyadenylierungsanalysen werden verwendet, um einen möglichen Einfluss der Proteinexpression zu zeigen, wenn ein Translationsinitiationsfaktor mutiert ist. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber unseren bestehenden Methoden oder rekonstituierten zellulären Systemen, die gleichermaßen aus Keim- oder Kaninchenretikulozyten extrahiert wurden, besteht darin, dass die Auswirkungen einer Mutation, die in einem MRT eingeführt wird. NA wird schnell beobachtbar sein und in mehreren Xop-Abgaben leicht untersucht werden können. Zyten Allgemein.

Dieses Modell hat den Vorteil, dass es mit seinen einzelnen Riesenzellen einfach ist, und seine Verwendung führt zu einer beträchtlichen Menge an Material für biochemische Experimente. Dieser Prozess ist im Vergleich zur Generierung stabiler Zelllinien auch zeitsparend. Dieses Miso kann helfen, Schlüsselfragen in der Translationswissenschaft zu beantworten, z. B. um die Rolle bestimmter Domänen von Faktoren besser zu verstehen oder das Spleißen dieser Faktoren zu untersuchen.

Die Idee zu dieser Methode haben wir erstmals hinzugefügt, als wir den Einfluss eines mutierten Translationsinitiationsfaktors auf die Proteinsynthese ohne Interferenz der Transkription untersuchen wollten. Auf diese Weise vermeiden wir mögliche Rückkopplungsschleifen zwischen diesen beiden Mechanismen. In der Tat werden materielle Transkripte gespeichert und abgelegt.

Die Translation kann mit Progesteron ausgelöst werden Nach dem Stuhlgang, den Xus Lados-Zyten und der Vorbereitung von CRN gemäß dem Textprotokoll verwenden Sie 10 x Mopps und 6,6% Formaldehyd, um ein 1,5%iges AROS-Gel zu gießen. Bereiten Sie die Proben in einem 0,2-Milliliter-Röhrchen mit 8,8 % Formaldehyd, 60 Prozent für AMIDE 0,1 Volumina von 10 x Mopps und einem Mikroliter CRNA vor, inkubieren Sie drei Minuten lang bei 70 Grad Celsius und legen Sie die Röhrchen 10 Minuten lang auf Eis. Zentrifugieren Sie die Proben einige Sekunden lang bei 5.000 G, bevor Sie zwei Mikroliter Gelladepuffer hinzufügen.

Lassen Sie die Proben 20 Minuten lang bei 90 Volt laufen, um das Gel zu verachten. Weichen Sie es über Nacht in nukleasefreiem Wasser ein. Analysieren Sie es dann, um die Qualität des CNA zu überprüfen.

Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die CNA-Konzentration zu bestimmen, und lagern Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius, um die Mikroinjektion von RNA durchzuführen. Verwenden Sie ND 96 medium, um eine geschabte Petrischale ein bis zwei Stunden nach der Entlaubung zu füllen. Ordnen Sie die Zyten entlang einer abgekratzten Gasse in der Schale an.

Verwenden Sie anschließend eine Kapillar-Mikropipette mit einer abgebrochenen Spitze, die in einem Winkel von 45 Grad platziert ist. Führen Sie die Kapillarspitze etwa 150 bis 200 Mikrometer tief in die Äquatorzone unterhalb des pigmentierten Tierbereichs ein. Injizieren Sie 30 Nanogramm CRNA in 60 Nanolitern in die erste Eizelle.

Warten Sie dann fünf bis 10 Sekunden, bevor Sie die Kapillarspitze entfernen, um ein Auslaufen der Probe zu verhindern. So injizieren Sie den nächsten Cyten Bewegen Sie die Schale manuell. Die injizierten Zyten werden in 24-Well-Kulturplatten überführt, die mit drei Millilitern ND 96-Medium gefüllt sind, und bei 19 Grad Celsius geführt, um die mitotische Reifung auszulösen.

Inkubieren Sie die Eizellen in ND 96 mit zwei Mikrogramm Progesteron oder PG pro Milliliter bei 19 Grad Celsius für 15 Stunden. Testen Sie den Translationseffekt von Wildtyp-EIF-4G-CRNAs auf den mutierten Phänotyp gemäß dem Textprotokoll. Bestimmung des Ausmaßes des Zerfalls von Keimbläschen unter einem Stereomikroskop.

Zählen Sie die Anzahl der reifen Zyten nach PG-Stimulation anhand des Vorhandenseins eines weißen Flecks am schwarzen Tierpol. Wiederholen Sie die Zählung stündlich bis zur 24. Stunde, um eine westliche Blutanalyse durchzuführen. Verwenden Sie die Hin- und Herbewegungen einer Mikropipettenspitze bei vier Grad Celsius, um 10 Zyten in 200 Mikrolitern des hier gezeigten Puffers zu homogenisieren.

Zentrifugieren Sie die Proben 15 Minuten lang bei 10.000 mal G, um die zytoplasmatische Fraktion in der Mitte zu extrahieren. Phasenweise werden die oberen Lipide in die obere Fraktion versetzt und die untere zu zellulären Trümmern. Sammeln Sie die zytoplasmatische Fraktion und lagern Sie ein Aliquot, um die Proteinkonzentration zu bestimmen.

Kombinieren Sie den verbleibenden Puffer im Verhältnis eins zu eins mit Lamely- oder Biss-Probenpuffer, bevor Sie SDS-Seite und Western Blotting ausführen. Gemäß dem Textprotokoll. Um einen Polyventilationsassay durchzuführen, geben Sie fünf Zyten pro Bedingung in 1,5-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen mit einem Milliliter nukleasefreiem Nuklease-Röhrchen und waschen Sie die Zyten.

Verwenden Sie dann unter dem Abzug ein RNA-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers, um die RNA zu isolieren. Nach Überprüfung der Integrität der RNA und Bestimmung der Konzentration werden zwei Ligationsmischungen pro CRNA-Bedingung mit den folgenden Reagenzien für die erste Mischung hergestellt. RNA von Cyten, die nicht mit pg stimuliert wurden, zur zweiten Mischung hinzufügen.

Fügen Sie RNA von PG-stimulierten Eizellen hinzu. Inkubieren Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und dann 20 Minuten lang bei 65 Grad Celsius. Zur Inaktivierung des Enzyms mit einem CD-NA-Reverse-Transkriptionskit.

Bereiten Sie für jede Probe die hier aufgeführte RT-Mischung vor. Fügen Sie 10 Mikroliter der zuvor vorbereiteten Ligationsreaktion hinzu und führen Sie die RT gemäß den Anweisungen des Herstellers nach der PCR durch, wobei Sie die folgende Reaktionsmischung und die folgenden Bedingungen für jede Reaktion bei vier Mikrolitern Ladepuffer verwenden und 10 Mikroliter jeder Probe auf einem 3%igen Agros-Gel bei 110 Schrauben laufen lassen. Analysieren Sie das Gel schließlich nach 10 und 20 Minuten, um eine Größenänderung zu beobachten, die die Länge des polyA-Schwanzes und damit die RNA-Reifung widerspiegelt, die eine Voraussetzung für ihre Translation ist.

Wie hier gezeigt, ist die kinetische Reifung von Eizellen, die unter kontrollierten Bedingungen mikroinjiziert wurden, ähnlich wie beim Wildtyp, wobei eine ähnliche Anzahl von Eizellen 12 und 24 Stunden nach der PG-Stimulation und 24 Stunden nach der PG-Stimulation einer GVBD unterzogen wurde. Der Prozentsatz der Eizellen, die die Reifung erreichen, ist sowohl bei Wildtyp- als auch bei Wasser- und GFP-injizierten Kontrollen ähnlich, was darauf hindeutet, dass die Mikroinjektion mit Wasser oder Kontroll- oder EIF 4G one CRNAs nur einen geringen Einfluss auf die Eizellmyose-Mikroinjektion mit dem dominanten negativen EIF 4G hatte, jedoch auch nach PG-Stimulation zu einer dramatischen Abnahme der GVBD führte. Diese Abbildung zeigt, dass der Reifungsdefekt bei der Wildtyp-CRNA wiederhergestellt werden kann, da das Verhältnis von Wildtyp zu dominantem negativem EIF-4G-CRNA zunimmt.

Das Gleiche gilt für den Prozentsatz der Zyten, die wie erwartet reifen. In Abwesenheit von PG-Stimulation und Überexpression von EIF 4G wird keine endogene Moosexpression nachgewiesen, wobei ein dominantes Negativ in Übereinstimmung mit früheren Ergebnissen nur geringe Auswirkungen auf endogenes Moos hat. Darüber hinaus zeigt Aurora AEEG two, das der Moosinduktion vorgeschaltet ist, keine Hinweise auf eine Deregulation des Proteins oder auf eine phosphorylierte Form, die nach PG-Stimulation induziert wird.

Umgekehrt wird die Phosphorylierung, die durch Moos induziert wird, in Gegenwart der dominanten negativen EIF-4G-Phosphorylierung gehemmt. Sobald Sie diese Technik beherrschen, kann sie in fünf Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, 120 Nanoliter CNA mit einer Konzentration unter bestimmten Nanogramm nicht zu überschreiten.

Obwohl Methoden wie die Polysomen-Profiling-Analyse durchgeführt werden können, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Definition, welche RNA möglicherweise schlecht oder stark translatiert ist.