Entschlüsselung der hochauflösenden 3D-Chromatinorganisation über Capture Hi-C

Capture Hi-C ermöglicht die Entschlüsselung der 3D-Chromatinorganisation der Genomregion von Megabasengröße mit hoher Auflösung. Mit Capture Hi-C werden eine höhere Auflösung und Allelspezifität erreicht, während gleichzeitig die Zeiteffektivität und Erschwinglichkeit der Technik verbessert wird. Die Anwendung von Capture IC auf verschiedene Modellsysteme, Zelltypen und entwicklungsregulierte Chromatinlandschaften unter gesundheitlichen und pathologischen Bedingungen wird wahrscheinlich unser Verständnis des Zusammenspiels zwischen Genomtopologie und Genregulation erleichtern.

Tryphtonisieren und zählen Sie zunächst die Zellen von der speziell für die Zellzählung vorbereiteten Kontrollplatte mit einem automatisierten Zellzähler. Fügen Sie eine Viabilitätsfärbung hinzu, um den Prozentsatz der lebensfähigen Zellen zu bestimmen. Schätzen Sie anhand dieser Zellzahl die Gesamtzahl der Zellen in der Platte, die für die Vernetzung vorbereitet ist.

Entfernen Sie das Nährmedium von den für die Vernetzung vorbereiteten Platten und ersetzen Sie es durch die Fixierlösung. 10 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Mischen auf einem Shaker fixieren. Beenden Sie die fixierte Reaktion, indem Sie 2,5 molare Glycin-PBS zu einer Endkonzentration von 0,125 Molaren hinzufügen.

530 Mikroliter 2,5 molaren Glycin-PBS auf 10 Milliliter in eine 10-Zentimeter-Platte geben. Fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, dabei vorsichtig auf einem Shaker mischen. Legen Sie die Platten auf Eis und inkubieren Sie sie weitere 15 Minuten auf Eis, während Sie sie vorsichtig auf einem Shaker mischen.

Entfernen Sie die Fixierlösung aus den Zellen, indem Sie sie in ein Becherglas gießen, um eine schnelle Handhabung zu gewährleisten. Spülen Sie die 10-Zentimeter-Platte zweimal schnell mit fünf Millilitern kaltem 0,125 molaren Glycin-PBS ab, um die Ablagerungen und abgestorbenen Zellen abzuwaschen. Entfernen Sie die Flüssigkeit aus dem Teller, indem Sie sie in ein Becherglas gießen, um eine schnelle Handhabung zu gewährleisten.

Geben Sie fünf Milliliter kaltes 0,125 molares Glycin PBS auf die 10-Zentimeter-Platte. Und kratzen Sie die Zellen schnell mit einem Kunststoffzellenschaber von der Platte ab. Die Zellsuspension wird mit einer serologischen Pipette in ein vorgekühltes konisches 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt.

Spülen Sie die Platte zweimal mit fünf Millilitern kaltem 0,125 molaren Glycin PBS ab und geben Sie die Zellsuspension in das konische Zentrifugenröhrchen. Bei 480 G 10 Minuten bei vier Grad Celsius herunterschleudern. Entfernen Sie den Überstand, indem Sie mit einem Tischabsaugsystem absaugen.

Resuspendieren Sie die Zellen und aliquotieren Sie 500 Mikroliter der Zellsuspension in die berechnete Anzahl von 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Bei 480 mal G 10 Minuten bei vier Grad Celsius herunterschleudern und die Trockenzellpellets bei 80 Grad Celsius lagern. Für die Zelllyse tauen Sie die gefrorenen Pellets auf Eis auf.

Bereiten Sie 1,5 Milliliter Lysepuffer in Wasser vor. 600 Mikroliter des Kaltlysepuffers zugeben und auf Eis gut resuspendieren. Drehen Sie bei 2.655 G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius herunter und entfernen Sie den Überstand mit einem Tischabsaugsystem.

Resuspendieren Sie in 100 Mikrolitern 0,5 % SDS. Nach der Inkubation bei 62 Grad Celsius und 10 Minuten lang bei 1400 U / min 290 Mikroliter Wasser plus 50 Mikroliter 10% Triton X 100 hinzufügen und gut mischen, um Luftblasen zu vermeiden. Inkubieren Sie 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit Schwenken bei 1400 U/min, bevor Sie 50 Mikroliter 10 x DPN-Röhrchenpuffer hinzufügen und das Röhrchen zum Mischen umdrehen.

Nehmen Sie 50 Mikroliter unverdaute DNA zur Qualitätskontrolle in ein separates Röhrchen. Vergessen Sie nicht, die unverdaute Kontrollprobe zu entnehmen. Für den DPN2-Aufschluss fügen Sie 10 Mikroliter DPN2 in hoher Konzentration hinzu und mischen Sie durch Invertieren.

Inkubieren Sie die Proben und die unverdaute Kontrolle in einem thermischen Mischer bei 37 Grad Celsius, wobei Sie mehr als vier Stunden lang mit 1400 Umdrehungen pro Minute verwirbeln. Für die Ligation und Umkehrung der Vernetzung werden 50 Mikroliter der ligierten verdauten DNA zur Qualitätskontrolle in einem separaten Röhrchen entnommen. Lagern Sie die unverdauten und ungebundenen Kontrollen bei 20 Grad Celsius.

Fügen Sie 800 Mikroliter Ligationscocktail hinzu. Inkubieren Sie bei 16 Grad Celsius und schwenken Sie über Nacht mit 1000 Umdrehungen pro Minute. Für die DNA-Aufreinigung werden die Proben auf Eis in konische 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt und zwei Milliliter Wasser, 10,5 Milliliter eiskaltes Ethanol und 583 Mikroliter dreimolares Natriumacetat hinzugefügt.

Fügen Sie 200 Mikroliter eiskaltes Ethanol, 10,8 Mikroliter Natriumacetat und einen Mikroliter des Rückgewinnungsmittels zu den unverdauten und ligierten Qualitätskontrollen hinzu. Bei minus 80 Grad Celsius mindestens vier Stunden bis über Nacht inkubieren. Schleudern Sie die 15-Milliliter-Röhrchen bei 2200 G bei vier Grad Celsius 45 Minuten lang.

Entfernen Sie vorsichtig das Ethanol und trocknen Sie die Proben und Kontrollen 10 bis 15 Minuten lang bei Raumtemperatur an der Luft. Nicht zu stark trocknen. Resuspendieren Sie die Proben und Kontrollen in 100 Mikroliter bzw. 20 Mikroliter Wasser.

Für die Qualitätskontrolle der 3C-Template-Präparation werden 100 bis 200 Nanogramm jeder Probe und jeder Kontrolle auf ein 1%agros 1XTBE-Gel geladen. Um dann eine Target-Anreicherung für die Pared-End-Multiplex-Sequenzierung durchzuführen, nehmen Sie vier Mikrogramm 3C-Template und resuspendieren Sie es für jede Fängerreaktion in 130 Mikrolitern Wasser. Beschallen Sie die Probe und setzen Sie die Präparation mit drei Mikrogramm der gescherten DNA fort.

Um die vorbereiteten DNA-Proben mit den zielspezifischen RNA-Sonden zu hybridisieren, werden 750 Nanogramm DNA-Proben in einem Endvolumen von 3,4 Mikrolitern verwendet, was zu einer Anfangskonzentration von 221 Nanogramm pro Mikroliter führt. Verwenden Sie bei Bedarf eine Schnellvakuumkonzentration, um das Endvolumen von 3,4 Mikrolitern zu erreichen. Für Proben, die in 10 Mikrolitern resuspendiert werden, sind 15 bis 20 Minuten Konzentration ausreichend.

Inkubieren Sie die Hybridisierungsmischung 16 bis 18 Stunden lang bei 65 Grad Celsius mit einem erhitzten Deckel bei 105 Grad Celsius gemäß den Anweisungen des Herstellers. Um die angestrebten Ligationsfragmente einzufangen, fügen Sie Streptivid in gekoppelten Beads zur sondenhybridisierten Probe hinzu. Um die Proben für die Multiplex-Sequenzierung vorzubereiten, wird das Protokoll gemäß dem in dieser Studie verwendeten Zielanreicherungssystem für die Paar- und Multiplexsequenzierung fortgesetzt.

Die Auflösung der Capture Hi-C Interaktionskarte erlaubt die Identifizierung von zwei kleineren Domänen im Tsix-tad, der den Promotor des Tsix-Locus enthält. Dies wurde bisher mit 5C nicht erreicht. Darüber hinaus sind andere Sub-Tad-Strukturen, wie z. B. Kontaktschleifen, aus den Capture Hi-C-Daten deutlich sichtbar, wie z. B. die Schleife zwischen Xist und FTX, die zuvor mit Capture C identifiziert wurde, und die Schleife zwischen Xist und Xert, die kürzlich mit einem ähnlichen Protokoll für Capture Hi-C identifiziert wurde.

Durch die erhöhte Auflösung der Capture Hi-C-Profile können auch andere Kontakte genauer abgebildet werden, wie z.B. diejenigen, die die bekannten Kontakt-Hotspots innerhalb des Tsix-tad zwischen den Loci Linx, Chic1 und Xite bilden. Im Vergleich zu den gezeigten Hi-C-Daten ermöglichte Capture Hi-C eine vierfache Erhöhung der Auflösung, benötigte aber nur ein Viertel der Sequenziertiefe. Es ist sehr wichtig, nicht zu vergessen, 50 Mikroliter unverdaute und ungebundene DNA-Proben als Qualitätskontrolle für die 3C-Template-Präparation zu entnehmen.