Effiziente Reinigung von elastinähnlichen Polypeptiden (ELPs) aus E. coli mittels einer organisch-lösungsmittelbasierten Extraktions- und Ausfällungsmethode

Der Umfang dieser Forschung stellt die Frage, ob die Lösungsmittelextraktionsfällung ELP-Fusionsproteine schnell reinigen kann, während die Funktion der Fusionsaktivität erhalten bleibt. Jüngste Entwicklungen umfassen eine schnelle lösungsmittelbasierte ELP-Reinigung mit verbesserter Endotoxinkontrolle, die aktive selbstassemblierende Nanopartikel für gezielte Nukleinsäureabgabe ermöglicht. Zunächst wiegen Sie ein Gramm des E.coli-Zellpellets ab.

Fügen Sie vier Milliliter frisch vorbereiteten Lysepuffer hinzu, um das Zellpellet wieder zu suspendieren. Vortexen vorsichtig, bis das Pellet vollständig verteilt und mit dem Puffer vermischt ist. Gib etwa fünf Milligramm Lysozym zu den resuspendierten Zellen, um die Zellwandverdauung zu unterstützen.

Dann legen Sie das Rohr auf Eis und bebrüten Sie es eine Stunde lang. Nach der Inkubation sonikieren Sie die Probe mit einem Mikrospitzensonikater in fünfsekündigen Abständen. Lassen Sie die Probe auf Eis und setzen Sie die Sonikation fort, bis ein gleichmäßiges Lysat frei von sichtbaren Partikeln erreicht ist, typischerweise für fünf bis acht Minuten.

Zentrifugieren Sie das Sonikatlysat bei 10.000 G für 10 Minuten bei 20 Grad Celsius, um es zu klären. Anschließend trennen Sie vorsichtig das Überlagermittel mit der löslichen Fraktion vom Pellet mit der unlöslichen Fraktion. Pipettieren Sie 10 bis 20 Mikroliter des Supernatanten und suspendieren Sie eine entsprechende Masse des Pellets im Lysispuffer wieder.

Mische beide Fraktionen mit 4x Laemmli-Puffer auf eine endgültige 1x-Konzentration. Dann wird die Suspension fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius erhitzt. Wenn das ELP überwiegend löslich ist, wird eine organische Lösungsmittelextraktion mit dem geklärten Supernatant durchgeführt.

Zur Lösungsmittelextraktion geben Sie vier Milliliter organisches Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch dem luftgetrockneten Pellet oder Supernatant zu. Für binäre Lösungsmittelmischungen verwenden Sie exakte volumetrische Verhältnisse, zum Beispiel zwei Milliliter von jedem für eine Eins-zu-eins-Kombination. Wirbeln Sie die Suspension eine Minute lang kräftig vor, um eine ordnungsgemäße Lösungsmitteldurchdringung in das Pellet zu gewährleisten.

Inkubieren Sie nun die Mischung bei 20 Grad Celsius für fünf Minuten, um die Aggregation extrazellulärer Proteine und die Löslichkeit von ELP in der organischen Phase zu ermöglichen. Zentrifugieren Sie die Probe bei 13.000 G für 10 Minuten bei 20 Grad Celsius, um lösliche Proteine von unlöslichen Ablagerungen zu trennen. Sammeln Sie das Supernatant vorsichtig auf, ohne das Pellet zu stören, da es das lösliche ELP enthält.

Missen Sie das Volumen des gesammelten Supernatanten genau, um auf Niederschlag vorzubereiten. Als Nächstes fügen Sie dem Supernatant Aceton oder Acetonitril mit 2,33-fachem Volumen zur Proteinausfällung hinzu. Inkubieren Sie die Mischung bei 20 Grad Celsius fünf bis sieben Minuten.

Zentrifugiere die Probe bei 10.000 G für 10 Minuten bei 20 Grad Celsius. Anschließend entsorgen Sie das Überdachungsmittel und lassen Sie das Pellet entweder unter einem sanften Stickstoffgasstrahl für 10 bis 15 Minuten oder indem Sie die unbedeckten Zentrifugenröhren auf fusselfreien Tüchern für eine Stunde bei 20 Grad Celsius auf fusselfreien Tüchern in eine Dampfhaube legen. Das getrocknete Proteinpellet in 50 Mikrolitern PBS neu suspendieren.

Dann pipette sie vorsichtig auf und ab, um eine vollständige Auflösung sicherzustellen. Lagere das resuspendierte Protein bei minus 20 Grad Celsius für kurzfristige bis mittelfristige Anwendungen. Um die Validierung mit SDS-PAGE durchzuführen, mischen Sie das gereinigte Protein zunächst mit einem 4-fachen SDS-PAGE-Ladepuffer.

Vortex die Lösung kurz für Homogenität. Lade die Probe auf ein 10%-SDS-PAGE-Gel für ELP und TEEN, die mit Chorismat-Mutase fusioniert sind. Lasse das Gel bei 100 bis 120 Volt laufen, bis der Tracking Dive den Boden erreicht.

Färben Sie das Gel nun mit InstantBlue Coomassie oder einer geeigneten Alternative für zwei Stunden bei 20 Grad Celsius. Spülen Sie mit deionisiertem Wasser, bis ein klarer Hintergrund erreicht ist. Ein markantes ELP- und TEEN-Band, das mit dem Chorismat-Mutaseband fusioniert ist, erschien bei 100 Kilodalton nach einem Lyseschritt vor der organischen Extraktion.

Verschiedene organische Lösungsmittelkombinationen führten zu unterschiedlichen Extraktionseffizienzen und Reinheiten von ELP und TEEN, die zur Chorismatmutase fusioniert wurden. Die Eins-zu-eins-Mischungen aus AG und BG erzielten die höchste Proteingewinnung. Das AG-Lösungsmittel, das ELP und TEEN mit Chorismat-Mutase fusionierten, behielt etwa 80 % seiner enzymatischen Aktivität im Vergleich zum ITC-gereinigten Protein, während BG etwa 50 % Aktivität behielt, und die V40-Kontrolle zeigte fast keine Aktivität.

Bedeutende Erkenntnisse umfassen den Nachweis, dass die organische Lösungsmittel-Extraktionsausfällung ELP-Fusionen mit niedrigem Endotoxin schnell reinigt und gleichzeitig die Fusionsproteinaktivität bewahrt. Dieses Protokoll adressiert das Fehlen schneller, detergentfreier Methoden zur Reinigung von ELP-Fusionen aus E.Coli mit oder ohne Einschlusskörper ohne mehrstufiges ITC. Dieses Protokoll bietet eine einstufige schnelle Reinigung direkt aus E.coli-Pellets, was zu hochreinen, endotoxinarmen ELP-Fusionen führt und gleichzeitig die Funktion des Fusionsproteins erhalten bleibt.