Planung und Bau von künstlichen extrazellulären Matrix (aECM) Proteine ​​aus

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Schritte bei der Herstellung und Produktion künstlicher ECM-Proteine oder A ECM mit elastinähnlichen Wiederholungen zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst rekombinante Gene konstruiert werden, die die A ECM-Proteine kodieren. Anschließend werden die rekombinanten Gene in bakterielle Wirtszellen eingefügt.

An diesem Punkt werden die rekombinanten Proteine in den bakteriellen Wirtszellen exprimiert und anschließend nach der Proteingewinnung durch Zelllyse isoliert. Der letzte Schritt besteht darin, die Proteine mittels inverser Phasentransitionszyklen oder ITC (ITC: inverse transition cycling) zu reinigen, wobei die einzigartige Phasentransitionseigenschaft von Elastin, ähnlich wie bei Polypeptiden, ausgenutzt wird.

Zentrifugationszyklen werden bei vier Grad Celsius und 37 Grad Celsius durchgeführt. Abschließend werden Gelelektrophorese und Western-Blot-Techniken verwendet, um die rekombinanten Proteine nachzuweisen und ihre Reinheiten zu bestimmen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Affinitätssäulen besteht darin, dass wir große Mengen an Proteinen vergleichsweise kostengünstig gewinnen können.

Beginnen Sie dieses Verfahren mit allen im Textprotokoll beschriebenen Ligament-Designs. Sobald die Oligomere erhalten wurden, annealen Sie die DNA-Oligomere, um die gewünschte Gensequenz zu erhalten. Lösen Sie zunächst DNA-Oligonukleotide in DNA-Oligo-Puffer auf, um eine Endkonzentration von einem Mikrogramm pro Mikroliter zu erreichen.

Geben Sie vier Mikroliter jeder Ligandenlösung zu 32 Mikrolitern DNA und Annealing-Puffer, um ein Gesamtvolumen von 40 Mikrolitern zu erhalten. Erhitzen Sie anschließend ein Becherglas Wasser mit einem Heizblock zum Kochen und tauchen Sie die Mischung fünf Minuten lang ein. Entfernen Sie das Becherglas bei 95 Grad Celsius und kühlen Sie die gesamte Anordnung über Nacht allmählich in einer Styroporschachtel ab. Die Oligomere wurden nun annealed und sind bereit für die Verdauung.

Fügen Sie die entsprechenden Restriktionsenzyme hinzu, um die al-Oligomere und die Wirtvektoren getrennt gemäß dem im Text beschriebenen Protokoll „Digest“ für drei bis vier Stunden bei 37 Grad Celsius zu verdauen. Nachdem Sie die Verdauungsprodukte auf einem Agarosegel laufen ließen und die DNA gereinigt haben, kombinieren Sie das Gen der Interesse schrittweise, indem Sie das verdauete DNA-Insert mit T4-Ligase in den Plasmidvektor ligieren. Inkubieren Sie das Ligationsgemisch gemäß dem Rezept im Textprotokoll zwei Stunden bei Raumtemperatur.

Als Nächstes transformieren Sie die Zellen mithilfe eines Hitzeschocks nach Ali. Geben Sie 50 µL kompetente Zellen in saubere, vorab gekühlte Mikrozentrifugenröhrchen. Pipettieren Sie fünf µL der Ligationsmischung in die Zellen und mischen Sie vorsichtig durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren.

Lassen Sie die Mischung 20 Minuten lang auf Eis. Tauchen Sie dann das Mikrozentrifugenröhrchen, das die Zellmischung enthält, für zwei Minuten in ein Wasserbad bei 42 Grad Celsius und stellen Sie es anschließend für zwei Minuten wieder auf Eis. Geben Sie 500 µL SOC-Medium in das Mikrozentrifugenröhrchen und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius unter Schütteln.

Nach der Inkubation 50 bis 500 Mikroliter der Zellligationsmischung auf eine zweifach-YT-Agarplatte mit Ampicillin auftragen, die zuvor auf Raumtemperatur vorgewärmt wurde. Die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius invertiert inkubieren. Am nächsten Tag DNA-Kolonien von der Agarplatte mit sauberen Pipettenspitzen entnehmen.

Züchten Sie die Kolonien in fünf Milliliter zweifach konzentriertem YT-Medium mit Ampicillin über Nacht bei 37 Grad Celsius unter Schütteln. Extrahieren Sie am folgenden Tag mithilfe eines Plasmidisolationskits gemäß Herstellerprotokoll die DNA-Plasmide jeder Kolonie.

Eluieren Sie die DNA mit 50 Mikrolitern Wasser, nachdem das rekombinante Plasmid wie im Textprotokoll beschrieben in den bakteriellen Expressionswirt transformiert wurde. Wählen Sie eine Kolonie von der transformierten Agarplatte mit einer Pipettenspitze aus und impfen Sie 10 Milliliter steriles, hervorragendes Brühe- oder TB-Medium, das sowohl Ampicillin- als auch Chloramphenicol-Antibiotika enthält, in einem Reagenzglas an.

Inkubieren Sie diese Startkultur über Nacht bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 225 U/min. Anschließend überführen Sie 10 Milliliter der Startkultur in einen Liter frisches und steriles TB-Medium, ergänzt mit den gleichen Antibiotika, in einem Dreiliter-Erlenmeyerkolben.

Inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius unter Schütteln bei 225 RRP M für zwei bis drei Stunden. Überprüfen Sie die optische Dichte der Kultur bei 600 Nanometern oder OD 600, um zu bestätigen, dass sie 0,6 bis 0,8 erreicht hat, indem Sie ein Milliliter Kultur in ein leeres Q-vet zur Messung pipettieren. Anschließend induzieren Sie die Kultur mit IPTG auf eine Endkonzentration von einem Millimolar und inkubieren sie weitere vier Stunden bei 37 Grad Celsius unter Schütteln bei 225 RPM.

Die Zellen durch Überführen der Kultur in Ein-Liter-Zentrifugenflaschen sammeln und 30 Minuten bei 12.000 G bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Nach dem Entsorgen des Überstandes die Zellpellets wiegen und in 10 Puffer bei 0,5 Gramm pro Milliliter resuspendieren. Die resuspendierten Zellen über Nacht bei minus 80 Grad Celsius einfrieren.

Am nächsten Tag die gefrorene Zellkultur in einem Wasserbad bei Raumtemperatur oder auf Eis auftauen. Zu L der Zellen Deoxyribonuclease, Ribonuclease A und Phenylmethylsulfonylfluorid hinzufügen. Während des Auftauens die Lösung unter langsamer Rühration homogenisieren.

Nachdem alle resuspendierten Zellen aufgetaut sind, stellen Sie den pH-Wert der Lösung unter sehr vorsichtiger Zugabe von sechsnormaler Natriumhydroxidlösung tropfenweise unter Rühren auf Eis vorsichtig auf 9,0 ein, um die Proteinsolubilität in Wasser zu erhöhen. Anschließend lysieren Sie die Zellen durch Ultraschallbehandlung für 20 Minuten auf Eis unter Verwendung einer flachen Spitze mit zwei Millimeter Durchmesser und eines fünfsekündigen Pulses.

Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 12.000 G für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Überführen Sie das Überstand in eine saubere, leere Flasche und lagern Sie es bei vier Grad Celsius zur späteren Reinigung. In der Zwischenzeit resuspendieren Sie das Zellpellet erneut in 10 Puffer und heben Sie 20 Mikroliter des Zelllysats auf.

Für die SDS-Page-Charakterisierung den resuspendierten Zellpellet bei minus 80 Grad Celsius erneut einfrieren, um die vollständige Zelllyse zu erreichen. Den Gefrier-Tau- und Sonikationsprozess bis zu dreimal wiederholen. Das Zelllysat aus früheren Schritten vereinigen und mit der Reinigung der A-ECM-Proteine mittels ITC fortfahren, bei dem Zentrifugationszyklen unter Hochsalzbedingungen bei unterschiedlichen Temperaturen durchgeführt werden.

Teilen Sie das Zelllysat auf 50-Milliliter-Zentrifugenfläschchen auf und zentrifugieren Sie zwei Stunden bei 40.000 G und vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren, um eine saubere Trennung vom Pellet zu erzielen. Sammeln Sie den Überstand in sauberen Zentrifugenfläschchen und geben Sie Natriumchlorid bis zu einer Endkonzentration von einem Molaren hinzu.

Erwärmen Sie die Lösung unter Schütteln mit 225 U/min für zwei Stunden auf 37 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie anschließend. Das Überstand bei 40.000 Gs für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius.

Nach dem Dekantieren das Pellet mit einem Metallspatel zerdrücken und die Pelletbruchstücke in Eis resuspendieren. Kaltes, destilliertes Wasser autoklavieren und über Nacht bei vier Grad Celsius unter starker Rühration mit einem magnetischen Rührstab und Rührplatte so lange rühren, bis das Pellet vollständig gelöst ist. Diese Zyklen wiederholen, bis das Pellet bei 37 Grad Celsius weiß ist, woraufhin es über Nacht in Wasser gelöst und zentrifugiert werden kann.

Um die Proteiniösung zu erhalten, entsalzen Sie die Proteiniösung durch Dialyse gegen destilliertes Wasser bei vier Grad Celsius, wobei das Wasser alle vier oder acht Stunden über Nacht für zwei bis drei Tage gewechselt wird, nachdem 20 Mikroliter des gereinigten Proteins für SDS-Page beiseitegestellt wurden. Lyophilisieren Sie den Rest des gereinigten Proteins, wie hier gezeigt. Ein intensives Proteinband befindet sich bei der vorhergesagten molaren Masse in der induzierten Probe. Dargestellt ist außerdem ein SDS-Page-Gel mit einer gereinigten Proteinprobe mit einem Molekulargewicht von 22 Kilodalton, das der Laminin-fünf-A-ECM entspricht.

Die geschätzte Reinheit der A-ECM-Proteine liegt bei etwa 90 bis 95 %. Dieser Wert wurde durch den Vergleich der Bandenintensitätsverhältnisse des Zielproteins und der anderen auf dem SDS-Gel vorhandenen Proteinbanden ermittelt. Schließlich wurde zur Bestätigung, dass es sich beim gereinigten Protein tatsächlich um die A-ECM-Proteine handelt, eine Westernblot-Analyse durchgeführt. Die Proteinreinheit der drei A-ECM-Proteine wird anhand eines SDS-Page-Gels dargestellt und mit dem Bild der Nitrocellulosemembran für den Westernblot verglichen.

Die Analyse zeigt das Vorhandensein der Zielproteine Kollagen vier A ECM und Laminin fünf A ECM, die mit anti-hexa-Histidin-Tag-Antikörpern markiert wurden, die mit Meerrettichperoxidase konjugiert sind. Die endgültigen Ausbeuten der A-ECM-Proteine lagen zwischen 60 Milligramm pro Liter und 120 Milligramm pro Liter. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Proteine, die Elastin-ähnliche Domänen enthalten, für Ihre spezifische Anwendung herstellt und reinigt.