Planung und Bau von künstlichen extrazellulären Matrix (aECM) Proteine ​​aus Escherichia coli Zum Haut Tissue Engineering

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Schritte bei der Konstruktion und Herstellung von künstlichen EZM-Proteinen oder einer elastinhaltigen EZM-ähnlichen Wiederholungen zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst rekombinante Gene konstruiert werden, die für die A-ECM-Proteine kodieren. Als nächstes werden die rekombinanten Gene in bakterielle Wirte eingefügt.

Zu diesem Zeitpunkt werden die rekombinanten Proteine in den bakteriellen Wirten exprimiert und dann nach Proteinextraktion durch Zelllyse geerntet. Der letzte Schritt besteht darin, die Proteine mittels Inverse Transition Cycling (ITC) zu reinigen, wobei das einzigartige Phasenübergangsverhalten von Elastin ausgenutzt wird. Wie Polypeptide.

Die Zentrifugationszyklen werden bei vier Grad Celsius und 37 Grad Celsius durchgeführt. Letztendlich werden Gelelektrophorese und Western-Blot-Techniken verwendet, um die rekombinanten Proteine zu identifizieren und ihre Reinheit zu bestimmen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Affinitätssäulen besteht darin, dass wir relativ kostengünstig große Mengen an Proteinen extrahieren können.

Beginnen Sie diese Prozedur mit allen Banddesigns, wie im Textprotokoll beschrieben. Sobald die Oligomere erhalten wurden, werden die DNA-Oligomere anil, um die gewünschte Gensequenz zu erhalten. Zuerst werden DNA-Oligonukleotide in einem DNA-Oligopuffer auf eine Endkonzentration von einem Mikrogramm pro Mikroliter aufgelöst.

Fügen Sie jeweils vier Mikroliter des gesamten Bandes zu 32 Mikrolitern DNA und Kniepuffer hinzu, um eine Gesamtmischung von 40 Mikrolitern zu erhalten. Kochen Sie dann ein Becherglas mit Wasser mit einer heißen Platte und tauchen Sie die Mischung fünf Minuten lang ein. Bei 95 Grad Celsius das Becherglas herausnehmen und das gesamte Setup über Nacht in einer Styroporbox nach und nach abkühlen lassen, die Oligomere sind nun in die Knie gegangen und bereit für die Verdauung.

Fügen Sie die entsprechenden Restriktionsenzyme hinzu, um die al-Oligomere und Wirtsvektoren getrennt voneinander zu verdauen, wie im Text Protocol Digest für drei bis vier Stunden bei 37 Grad Celsius beschrieben. Nachdem die Verdauungsprodukte auf einem Agarosegel laufen gelassen und die DNA gereinigt wurden, kombinieren Sie das interessierende Gen nacheinander, indem Sie das verdaute DNA-Insert in den Plasmidvektor mit T-4-Ligase ligieren. Inkubieren Sie die Ligationsmischung nach dem Rezept im Textprotokoll zwei Stunden lang bei Raumtemperatur.

Als nächstes transformierst du die Zellen mit Hilfe des Hitzeschocks von Ali. Zitieren Sie 50 Mikroliter kompetenter Zellen in saubere, vorgekühlte Mikrozentrifugenröhrchen. Pipettieren Sie fünf Mikroliter der Ligationsmischung in die Zellen und pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um sie zu mischen.

Lassen Sie die Mischung 20 Minuten auf Eis. Tauchen Sie dann das Mikrozentrifugenröhrchen mit der Zellmischung für zwei Minuten in ein 42 Grad Celsius heißes Wasserbad und kehren Sie für zwei Minuten zum Eis zurück. Geben Sie 500 Mikroliter SOC-Medium in das Mikrozentrifugenröhrchen und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius unter Schütteln.

Nach der Inkubation verteilen Sie 50 bis 500 Mikroliter der Zellligationsmischung auf eine zweifache YT-Schneckenplatte, die Ampicillin enthält und auf Raumtemperatur vorgewärmt wurde. Inkubieren Sie die Platten über Nacht kopfüber bei 37 Grad Celsius. Entnehmen Sie am nächsten Tag DNA-Kolonien mit sauberen Pipettenspitzen aus der Schneckenplatte.

Züchten Sie die Kolonien in fünf Millilitern von zweimal. YT-Medien, die Ampicillin enthalten, über Nacht bei 37 Grad Celsius mit Schütteln am folgenden Tag. Verwenden Sie ein Plasmid-Isolationskit gemäß dem Protokoll des Herstellers, um die DNA-Plasmide für jede Kolonie zu extrahieren.

Gepickt eluiert, die DNA mit 50 Mikrolitern Wasser nach Umwandlung des rekombinanten Plasmids in den bakteriellen Expressionswirt, wie im Textprotokoll beschrieben. Entnehmen Sie eine Kolonie aus der umgewandelten Schneckenplatte mit einer Pipettenspitze, um sie zu impfen. 10 Milliliter sterile, hervorragende Brühe oder TB-Medien, die sowohl Ampicillin- als auch Chloramphenicol-Antibiotika enthalten, in einem Reagenzglas.

Inkubieren Sie diese Starterkultur über Nacht bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie sie bei 225 U/min. Übertragen Sie dann 10 Milliliter der Starterkultur in einen Liter frisches und steriles TB-Medium. Ergänzt mit den gleichen Antibiotika in einem drei Liter Erlin Meyer Kolben.

Inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie sie bei 225 UVP M für zwei bis drei Stunden. Beobachten Sie die optische Dichte der Kultur bei 600 Nanometern oder OD 600, um zu bestätigen, dass sie 0,6 bis 0,8 erreicht hat, indem Sie einen Milliliter der Kultur zur Messung in einen leeren Q-Tierarzt pipettieren. Als nächstes wird die Kultur mit IPTG auf eine Endkonzentration von einem Millimolar induziert und bei 37 Grad Celsius unter Schütteln bei 225 U/min für weitere vier Stunden inkubiert.

Ernten Sie die Zellen, indem Sie die Kultur in eine Ein-Liter-Zentrifuge und Flaschen überführen und 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 12.000 g zentrifugieren. Nach dem Verwerfen des Überstands werden die Zellpellets gewogen und in 10 Puffer bei 0,5 Gramm pro Milliliter resuspendiert. Frieren Sie die resuspendierte Zellkultur über Nacht bei minus 80 Grad Celsius ein.

Am nächsten Tag tauen Sie die gefrorene Zellkultur in einem Wasserbad bei Raumtemperatur oder auf Eis auf. Zu L fügen die Zellen Desoxy-Ribonuklease, eine Ribonuklease a und Phenylmethyl-Suenfluorid hinzu. Während Sie die Lösung auftauen, homogenisieren Sie die Lösung unter langsamem Rühren.

Nachdem alle resuspendierten Zellen aufgetaut sind, stellen Sie die Lösung auf pH 9,0 ein, um die Löslichkeit des Proteins in Wasser sehr vorsichtig zu erhöhen. Zugabe von sechs N Natriumhydroxid tropfenweise unter Rühren auf Eis, um eine homogene Konsistenz zu erreichen. Dann läuse die Zellen durch Ultraschallaufbruch für 20 Minuten auf Eis, mit einer flachen Spitze mit zwei Millimetern Durchmesser und einem Fünf-Sekunden-Impuls.

Zentrifugieren Sie die Zelllösung bei 12.000 g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Füllen Sie das Supernat in eine saubere, leere Flasche um und lagern Sie es bei vier Grad Celsius für die spätere Reinigung. In der Zwischenzeit resuspendieren Sie das Zellpellet erneut mit 10 Puffer und sparen Sie 20 Mikroliter des Zelllysats.

Für die Charakterisierung der SDS-Seite frieren Sie das resuspendierte Zellpellet bei minus 80 Grad Celsius wieder ein, um die Zelllyse abzuschließen. Wiederholen Sie den Gefrier-, Auftau- und Ultraschallvorgang bis zu dreimal. Kollizieren Sie das Zelllysat von früher und fahren Sie mit der Aufreinigung der A-EZM-Proteine mit ITC fort, bei der Zentrifugationszyklen bei unterschiedlichen Temperaturen und unter Bedingungen mit hohem Salzgehalt durchgeführt werden.

Teilen Sie das Zelllysat in eine 50-Milliliter-Zentrifuge, Flaschen und zentrifugieren Sie es zwei Stunden lang bei 40.000 g bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren, um eine saubere Trennung vom Pellet zu erhalten. Der Überstand wird in sauberen Zentrifugenflaschen aufgefangen und Natriumchlorid bis zu einer Endkonzentration von einem molaren zugegeben.

Erwärmen Sie die Lösung zwei Stunden lang auf 37 Grad Celsius und schütteln Sie sie bei 225 U/min. Nächste Zentrifuge. Der Überstand bei 40.000 G für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius.

Nach dem Dekantieren zerkleinert der Überstand das Pellet mit einem Metallspatel und suspendiert die Pelletstücke wieder in Eis. Destilliertes Wasser unter kräftigem Rühren über Nacht bei vier Grad Celsius mit einem magnetischen Rührstab und einer Platte kalt im Autoklaven erhitzen, bis sich das Pellet vollständig aufgelöst hat. Wiederholen Sie diese Zyklen, bis das Pellet bei 37 Grad Celsius weiß ist, dann kann es über Nacht in Wasser aufgelöst und zentrifugiert werden.

Um die Proteinlösung zu erhalten, entsalzen Sie die Proteinlösung, indem Sie sie gegen destilliertes Wasser bei vier Grad Celsius dialysieren, das Wasser alle vier Stunden oder acht Stunden über Nacht für zwei bis drei Tage wechseln, nachdem Sie 20 Mikroliter des gereinigten Proteins für SDS aufbewahrt haben. Seite Lyophilisieren Sie den Rest des gereinigten Proteins, wie hier gezeigt. Eine intensive Proteinbande befindet sich bei dem vorhergesagten Molekulargewicht in der induzierten Probe. Ebenfalls dargestellt ist das SDS-Page-Gel, das eine gereinigte Proteinprobe mit einem Molekulargewicht von 22 Kilodalton enthält, das dem Laminin fünf A ECM entspricht.

Die geschätzte Reinheit der A-ECM-Proteine beträgt etwa 90 bis 95 %Dieser Wert wurde durch den Vergleich der Bandenintensitäten des Zielproteins und anderer auf dem SDS-Gel vorhandener Proteinbanden abgeleitet. Um schließlich festzustellen, ob es sich bei dem gereinigten Protein tatsächlich um die A-ECM-Proteine handelte, wurde hier Western Blotting durchgeführt. Die Proteinreinheit der drei A-ECM-Proteine wird mit einem SDS-Page-Gel dargestellt und mit einem Bild der Nitrocellulosemembran für das Western Blotting verglichen.

Die Analyse zeigt das Vorhandensein der Zielproteine Kollagen, vier A ECM und Laminat fünf A ECM, die mit Anti-Hexa-Histidin-Tag-Antikörpern markiert sind, die mit Meerrettichperoxidase konjugiert sind. Die endgültigen Ausbeuten der A-ECM-Proteine lagen zwischen 60 Milligramm pro Liter und 120 Milligramm pro Liter. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Proteine, die Elastin-Lichtdomänen enthalten, für Ihre spezifische Anwendung kontrahieren und aufreinigen können.