In-vitro-Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus (mES) Zellen unter Verwendung des Hanging-Drop-Methode

Stammzellen haben das bemerkenswerte Potenzial, sich zu vielen verschiedenen Zelltypen im Körper zu entwickeln. Dient als eine Art Reparatursystem für den Körper. Sie können sich theoretisch unbegrenzt teilen, um andere Zellen wieder aufzufüllen.

Wenn sich eine Stammzelle teilt, hat jede neue Zelle das Potenzial, entweder eine Stammzelle zu bleiben oder zu einem anderen Zelltyp mit einer spezialisierteren Funktion zu werden. Dieses vielversprechende Wissenschaftsgebiet führt Wissenschaftler dazu, die Möglichkeit zellbasierter Therapien zur Behandlung von Krankheiten in vitro zu untersuchen. Die Differenzierung embryonaler Stammzellen erfolgt, wenn die Zellen in Suspensionskulturen aggregieren dürfen.

In Ermangelung von Mausembryonen, Fibroblasten-Feedern und Leukämie-Hemmfaktor werden diese Zellaggregate als Embryokörper bezeichnet. Die Hanging Drop-Methode ist ein wirksames Verfahren zur Differenzierung von Stammzellen in Embryokörper in vitro. Hallo, ich bin Sha Juan von der linken Seite in der Abteilung für Herz-Kreislauf-Medizin an der Stanford University.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur individuellen Differenzierung von embryonalen Stammzellen zur Einfärbung des Körpers mit der Handtropfenmethode. Wir verwenden diese Methode in der Regel, um embryonale Stammzellen in Kardiomyozyten zu differenzieren. Dieses Verfahren, einschließlich der folgenden Schritte, umfasst die Herstellung einer Einzelzellsuspension embryonaler Stammzellen, die Erzeugung von Handtropfenkulturen, das Übertragen von Handtropfenkulturen auf Platten mit extrem niedrigem Anhaftungsgrad und das Plattieren von Stickkörpern auf jutbeschichtete Platten.

Okay, fangen wir an. Der erste Schritt des Verfahrens besteht darin, eine Einzelzellsuspension aus embryonalen Stammzellen herzustellen. Da wir unsere undifferenzierten embryonalen Stammzellen kultivieren, indem wir sie auf embryonalen Fibroblasten der Maus züchten, müssen wir die Zellen abtrennen und sie von den Fibroblasten trennen.

Dazu versuchen wir, die Zellen mit Standardverfahren zu anisieren. Sobald der Versuch und die Behandlung abgeschlossen sind, fügen Sie embryonales Stammzellmedium der Maus hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren. Übertragen Sie anschließend die Zellsuspension in ein konisches 15-mil-Röhrchen.

Brechen Sie dann die Zellkolonien auf, indem Sie gegen den Boden des Röhrchens auf und ab pipettieren, bis Sie eine feine Suspension der Zellen ohne sichtbare Klumpen erhalten. Drehen Sie nun die Zellen fünf Minuten lang mit tausend Umdrehungen pro Minute. Nach dem Schleudern aspirieren die Zellen das Supernat und resuspendieren die Zellen mit 10 mil ES-Zelle der Maus. Mittel.

Die Zellsuspension wird in einen mit 0,1 % Gelatine vorcodierten Kolben T 75 überführt und eine Stunde lang bei 37 Grad mit 5 % CO2 inkubiert. Nach einer Stunde haben sich die Fibroblasten an die Platte anheftet, aber die Stammzellen bleiben im Medium. Pipettieren Sie das Medium hoch, um die Stammzellen zu sammeln.

Drehen Sie die Zellen fünf Minuten lang mit tausend Umdrehungen pro Minute und saugen Sie das Medium ab. Fügen Sie dann weitere 10 mil Differenzierungsmedium hinzu und resuspendieren Sie die Zellen durch wiederholtes Pipettieren, bis eine feine Suspension der Zellen vorhanden zu sein scheint. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.

Jetzt sind wir bereit, die Zellsuspension mit der Hanging Drop-Methode zu kultivieren. Um mit der hängenden Tropfenkultur zu beginnen, verwenden Sie den Differenzierungsmedian, um die Stammzellsuspension auf eine Konzentration von 500 Zellen pro 20 Mikroliter zu verdünnen. Als nächstes drehen Sie eine 150 Millimeter dicke Abdeckung einer Gewebekulturplatte um.

Pipettieren Sie dann 20 Mikroliter der Zellsuspension auf die Innenfläche der Plattenabdeckung. Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 10 mil PBS auf die Platte. Drehen Sie die Plattenabdeckung schnell um und legen Sie sie vorsichtig auf die Platte, um die hängenden Tropfen zu bilden.

Sobald die Plattenabdeckung angebracht ist, übertragen Sie die Platte vorsichtig in die Inkubatorkultur. Die Zellen blieben zwei Tage lang ungestört. Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, werden wir mit der Übertragung der hängenden Tropfenkultur auf ultraniedrige Befestigungsplatten fortfahren.

Drehen Sie nach zwei Tagen vorsichtig die Plattenabdeckung um, aspirieren Sie 180 Mikroliter frisches Differenzierungsmedium und geben Sie einige Tropfen in eine 96-Well-Platte mit extrem niedrigem Aufsatz. Nehmen Sie dann die Tropfen mit einer Pipette auf und geben Sie sie nacheinander auf die 96-Well-Platte. Legen Sie die Platten drei Tage lang ungestört in den Inkubator.

Die Embryokörper wachsen weiter zu einer Kugel heran. Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, werden wir bereit sein, die Embryonen zu bepflanzen. Um den Embryonen zu helfen, sich weiter zu differenzieren.

Wir übertragen sie auf eine mit Gelatine beschichtete 48-Well-Platte. Dazu bestreichen wir zunächst jede Vertiefung der Platte mit 300 Mikrolitern 0,1%iger Gelatine. Nachdem Sie die Gelatine hinzugefügt haben, inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius.

Aspirieren Sie am nächsten Tag die Gelatine aus der 48-Well-Platte. Geben Sie dann jeweils 300 Mikroliter Differenzierungsmedium hinzu. Nun, jetzt übertragen Sie nacheinander die Embryokörper von der 96-Well-Well-Platte auf die mit Gelatine überzogenen 48-Well-Platten.

Normalerweise wechseln wir das Medium am nächsten Tag und dann jeden zweiten Tag, um die Zellen zu erhalten. Wir verwenden diese Methode, um nach besseren Protokollen für die Differenzierung embryonaler Stammzellen zu suchen. In den Kardiomyozyten haben wir Ihnen gerade gezeigt, wie Sie die In-vitro-Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus mit Hilfe von hängenden Tropfenkulturen durchführen können.

Diese Methode ist effektiv, da der runde Boden des hängenden Tropfens die Aggregation embryonaler Stammzellen ermöglicht und somit eine gute Umgebung für die Bildung von Embry-Körpern bietet. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Anzahl der embryonalen Stammzellen, die in einem hängenden Tropfen aggregiert sind, durch Variation der Anzahl der Zellen in der anfänglichen Zellsuspension gesteuert werden kann. Das wars.

Danke fürs Zuschauen. Viel Glück bei Ihrem Experiment.