Name: In-vitro-Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus (mES) Zellen unter Verwendung des Hanging-Drop-Methode (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-23T22:33:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Lernen Sie die Hanging-Drop-Methode zur In-vitro-Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus. Diese Technik ermöglicht die kontrollierte Bildung von Embryoidkörpern für die Stammzellbiologie.

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<ol><li> Verkleistern T75 Kolben unter Verwendung einer 0,1% igen Gelatinelösung und inkubieren Platte in einem 37 ° C, 5% CO 2 Gewebekultur-Inkubator über Nacht einen Tag vor. </li><li> Nehmen Sie die MES-Zellen aus inkubieren, absaugen des Mediums, spülen Sie die ES Zellkultur mit PBS, fügen 0,05% Trypsin-Lösung zur Beschichtung der Boden der Schale (2 ml/100mm Platte). </li><li> Bei 37 ° C für ca. 1 Minute, bis die Zellen Häutung sind von der Platte. </li><li> Vorsichtig verreiben (Pipette nach oben und unten) die trypsiniert Zellen vier Minuten vor sechs Mal die ES-Zellen mit einem eingesteckt Pasteurpipette zu dispergieren,. Übertragen Sie die verstreut ES-Zellen in einer 15-ml konische Zentrifugenröhrchen mit vorgewärmten (37 ° C) mES Medium. </li><li> Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Den Überstand aspirieren, 10 ml MES-Medium und Pipette auf und ab zu einer einzigen Zelle Suspension bilden. </li><li> Übertragen Sie die Zellsuspension in eine T75-Kolben vorbeschichtet mit 0,1% Gelatine und bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 1 Stunde * Nach einer Stunde wurden die Fibroblasten auf der Platte befestigt, aber die Stammzellen bleiben in dem Medium. Pipette das Medium, um die Stammzellen zu sammeln. </li><li> Spin die Zellen bei 1000 rpm für 5 min und absaugen der MES-Medium. Dann fügen Sie weitere 10 ml MES-Differenzierungsmedium und Zellen durch repetitive Pipettieren, bis es erscheint zu einer feinen Suspension von Zellen sein. </li><li> Zählen von Zellen mit einer Zählkammer verwenden Differenzierung Medium, um die Stammzell-Suspension auf eine Konzentration von 400 bis 500 Zellen pro 20 ul (20ul/drop) in einem sterilen Becken zu verdünnen. </li><li> Deckel abheben, vorsichtig umdrehen und platzieren Sie sie auf der Oberseite der Schale mit 10 ml PBS. Mit einer Mehrkanal-Pipette, um Reihen von 20 ul Tropfen auf dem up-turned innere Oberfläche des Deckels des Gewebes Kulturschale. </li><li> Vorsichtig die Schale in den Brutschrank für 2 Tage. Nach zwei Tagen, sorgfältig über die Platte abdecken wiederum absaugen 180 ul frisch Differenzierungsmedium und setzte einige Tropfen in die Vertiefung einer 96-well ultratiefen Befestigungsplatte. Dann Pickup der Tropfen mit der Pipette und übertragen Tropfen, one-by-one, die 96-Well-Platte. Legen Sie die Platten in den Inkubator ungestört für 3 Tage. </li><li> Coat jede Vertiefung einer 48-well Zellkultur-Platte mit 300ul von 0,1% Gelatine. Nach Zugabe der Gelatine, inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 ° C einen Tag im Voraus vor der Übertragung der Ebs. </li><li> Am nächsten Tag absaugen die Gelatine aus den 48-Well-Platte. Dann fügen Sie 300 ul der Differenzierung Medium in jede Vertiefung. Übertragen Sie die EBs aus den 96-Well-Platten, die 48 gut Gelatine-beschichteten Platten one-by-one. Ändern Sie das Medium am nächsten Tag und ändern Sie dann das Medium jeden zweiten Tag zu den Zellen aufrecht zu erhalten. </li><li> Spontane cardiaomyocyte Kontraktionen sollte innerhalb von 7 Tagen evident. </li></ol>

<ol><li>Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+mouse+embryonic+stem+cells+are+able+to+differentiate+into+cardiomyocytes+expressing+chronotropic+responses+to+adrenergic+and+cholinergic+agents+and+Ca2%2B+channel+blockers%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers.</a> Differentiation. 48, 173-182 (1991).</li>
<li>Metzger, J. M., Lin, W. I., Samuelson, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+in+cardiac+contractile+sensitivity+to+calcium+during+the+in+vitro+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transition in cardiac contractile sensitivity to calcium during the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> J Cell Biol. 126, (1994).</li>
</ol>

Die Nachteile der hängenden Tropfen-Methode sind wie folgt: das flüssige Volumen eines Tropfens auf weniger als 50ul begrenzt durch die Aufrechterhaltung hängende Tropfen auf dem Deckel durch die Oberflächenspannung, und es ist unmöglich, das Medium für hängende Tropfen zu ändern. Die Beobachtung der Bildung von EBs in Tropfen direkt mit der Mikroskopie ist auch sehr schwierig während der Kultivierung. Weiter mehr, der hängende Tropfen-Methode aus zwei Schritten besteht, kann daher eine Reihe von Schritt des hängenden Tropfen Methode lästig...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Reagenz</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Non-essentielle Aminosäuren</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin / Streptomycin</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11360-70</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-Mercapto&amp;#8211;ethanol</td><td>Reagenz</td><td>Chemicon International</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>Leukämie-hemmender Faktor (LIF)</td><td>Reagenz</td><td>Chemicon International</td><td>LIF2005</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Ultralow-Attachment-Platte</td><td>Werkzeug</td><td>Corning</td><td>3474</td><td></td></tr></tbody></table>

in-vitro-differenzierung von embryonalen stammzellen der maus (mes) zellen unter verwendung des hanging-drop-methode

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method

Stammzellen haben die bemerkenswerte Potenzial, sich in viele verschiedene Zelltypen zu entwickeln. Wenn eine Stammzelle teilt, jede neue Zelle die Möglichkeit, entweder eine Stammzelle bleiben oder zu werden eine andere Art von Zelle mit einer spezialisierten Funktion hat, ist dieser viel versprechenden wissenschaftlichen führenden Wissenschaftler auf die Möglichkeit der zell-basierte Therapien zur Behandlung von Krankheiten zu untersuchen. Wenn Kultur in Suspension ohne antidifferentiation Faktoren, embryonalen Stammzellen spontan zu differenzieren und bilden dreidimensionale vielzelligen Aggregaten. Diese Zellaggregate heißen Embryoidkörpern (EB). Hanging drop Kultur ist ein weit verbreitetes EB Bildung Induktion Methode. Die abgerundeten unteren hängenden Tropfen ermöglicht die Aggregation von ES-Zellen, die bieten mES Zellen können ein gutes Umfeld für die Bildung EBs. Die Zahl der ES-Zellen in einem hängenden Tropfen aggregatied kann durch Variation der Anzahl der Zellen in der ersten Zellsuspension als ein Tropfen aus dem Deckel der Petrischale aufgehängt werden gesteuert werden. Mit dieser Methode können wir reproduzierbar Form homogener EBs aus einer vorgegebenen Anzahl von ES-Zellen.

Dieses Video zeigt, wie in vitro-Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus, um Embryoidkörpern mit dem hängenden Tropfen-Methode durchzuführen.

In-vitro-Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus (mES) Zellen unter Verwendung des Hanging-Drop-Methode

Stammzellen besitzen das bemerkenswerte Potenzial, sich in viele verschiedene Zelltypen zu entwickeln. Wenn sich eine Stammzelle teilt, hat jede neue Zelle das Potenzial, entweder ...

Stammzellen besitzen das bemerkenswerte Potenzial, sich in viele verschiedene Zelltypen des Körpers zu entwickeln. Sie dienen gewissermaßen als Reparatursystem für den Körper. Theoretisch können sie sich unbegrenzt teilen, um andere Zellen nachzubilden.Wenn sich eine Stammzelle teilt, hat jede neue Zelle das Potenzial, entweder eine Stammzelle zu bleiben oder sich in einen anderen Zelltyp mit einer spezialisierteren Funktion zu verwandeln. Dieser aussichtsreiche Bereich der Wissenschaft führt dazu, dass Wissenschaftler die Möglichkeit zellbasierter Therapien zur Behandlung von Krankheiten in vitro untersuchen. Die Differenzierung embryonaler Stammzellen erfolgt, wenn die Zellen in einer Suspensionkultur aggregieren dürfen.Bei Abwesenheit von embryonalen Mausfibroblasten-Fütterungszellen und Leukämie-Inhibitionsfaktor werden diese Zellaggregate Embryoidkörper genannt. Die Hänge-Tropfen-Methode ist ein wirksames Verfahren zur Differenzierung von Stammzellen in Embryoidkörper in vitro. Hallo, ich bin Sha Juan aus der Abteilung für Kardiovaskuläre Medizin an der Stanford University.Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur individuellen Differenzierung von embryonalen Stammzellen zu Embryoidkörpern mithilfe der Hanging-Drop-Methode. Diese Methode verwenden wir typischerweise, um embryonale Stammzellen in Kardiomyozyten zu differenzieren. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte: Herstellung einer Einzelzell-Suspension aus embryonalen Stammzellen, Erzeugung von Hanging-Drop-Kulturen, Überführung der Hanging-Drop-Kulturen in Ultra-Low-Attachment-Platten und das Ausplattieren der Embryoidkörper auf Gelatine-beschichteten Platten.Okay, beginnen wir. Der erste Schritt des Verfahrens besteht darin, eine Einzelzell-Suspension von embryonalen Stammzellen herzustellen. Da wir unsere undifferenzierten embryonalen Stammzellen kultivieren, indem wir sie auf embryonalen Mausfibroblasten wachsen lassen, müssen wir die Zellen ablösen und von den Fibroblasten trennen.Dazu versetzen wir die Zellen mithilfe von Standardverfahren mit Trypsin. Sobald die Trypsinbehandlung abgeschlossen ist, geben wir Maus-Embryonalstammzell-Medium hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren. Anschließend überführen wir die Zellsuspension in ein 15 ml konisches Reaktionsgefäß.Zerstören Sie dann die Zellkolonien, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren, wobei Sie die Pipettenspitze gegen den Boden des Röhrchens drücken, bis eine feine Zellsuspension ohne sichtbare Zellklumpen entsteht. Zentrifugieren Sie die Zellen anschließend bei eintausend U/min für fünf Minuten. Nach der Zentrifugation entfernen Sie den Überstand per Aspiration und resuspendieren die Zellen in 10 ml Mouse ES Cell Medium.Überführen Sie die Zellsuspension in einen mit 0,1 % Gelatine vorbeschichteten T-75-Flasche und inkubieren Sie eine Stunde bei 37 Grad mit 5 % CO2. Nach einer Stunde haben sich die Fibroblasten an der Platte angeheftet, während die Stammzellen im Medium verbleiben. Pipettieren Sie das Medium auf, um die Stammzellen zu sammeln.Zentrifugieren Sie die Zellen bei tausend U/min für fünf Minuten und aspirieren Sie das Medium ab. Geben Sie anschließend weitere 10 ml Differenzierungsmedium hinzu und resuspendieren Sie die Zellen durch mehrfaches Pipettieren, bis eine feine Zellsuspension vorliegt. Zählen Sie die Zellen mithilfe eines Hämozytometers.Nun können wir die Zellsuspension mit der Hängetropfen-Methode kultivieren. Um die Hängetropfen-Kultur zu beginnen, verdünnen Sie die Stammzellsuspension mit Differenzierungsmedium auf eine Konzentration von 500 Zellen pro 20 Mikroliter. Danach kehren Sie den Deckel einer 150-Millimeter-Zellkulturplatte um.Anschießend pipettieren Sie 20 Mikroliter der Zellsuspension auf die innere Oberfläche des Plattendeckels. Geben Sie mithilfe eines Mehrkanalpipettiersystems 10 ml PBS auf die Platte. Drehen Sie den Plattenboden schnell um und setzen Sie ihn vorsichtig auf den Deckel, um Hänge-Tröpfchen zu bilden.Wenn der Plattenverschluss angebracht ist, überführen Sie die Platte vorsichtig in die Inkubationskultur. Die Zellen bleiben zwei Tage lang ungestört. Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, überführen wir die Hängentropfenkultur in Platten mit ultra niedriger Anhaftung.Nach zwei Tagen die Plattenabdeckung vorsichtig umdrehen, anschließend 180 Mikroliter frisches Differenzierungsmedium abpipettieren und mehrere Tropfen in eine 96-Well-Ultra-Low-Attachment-Platte geben. Danach die Tropfen mit einer Pipette aufnehmen und einzeln in die 96-Well-Platte überführen. Die Platten für drei Tage ungestört in den Inkubator stellen.Die Embryoidkörper wachsen weiter zu einer kugelförmigen Struktur heran. Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, können die Embryoidkörper ausgeplattet werden, um ihre weitere Differenzierung zu unterstützen.Wir überführen sie in eine 48-Well-Platte, die mit Gelatine beschichtet ist. Dazu beschichten wir zunächst jedes Well der Platte mit 300 µL 0,1 %iger Gelatine. Nach dem Zugabe der Gelatine inkubieren wir die Platte über Nacht bei 37 °C.Am nächsten Tag wird das Gelatine aus der 48-Loch-Platte abgesaugt. Anschließend werden 300 Mikroliter Differenzierungsmedium in jedes Loch gegeben. Nun werden die Embryoidkörper einzeln von der 96-Loch-Platte auf die mit Gelatine beschichteten 48-Loch-Platten übertragen.Normalerweise wechseln wir am nächsten Tag das Medium und danach jeden zweiten Tag, um die Zellen zu erhalten. Mit dieser Methode suchen wir nach besseren Protokollen zur Differenzierung embryonaler Stammzellen. In den Kardiomyozyten haben wir Ihnen soeben gezeigt, wie man die in-vitro-Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus mittels Hängender-Tropfen-Kulturen durchführt.Diese Methode ist wirksam, weil der runde Boden des hängenden Tropfens die Aggregation von embryonalen Stammzellen ermöglicht und somit ein günstiges Umfeld für die Bildung von Embryoidkörpern bietet. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass die Anzahl der in einem hängenden Tropfen aggregierten embryonalen Stammzellen durch die Variation der Zellzahl in der anfänglichen Zellsuspension gesteuert werden kann. Das war's.Vielen Dank fürs Zuschauen. Viel Erfolg bei Ihrem Experiment.

in-vitro-differentiation-mouse-embryonic-stem-mes-cells-using-hanging

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Protokoll beschreibt die Herleitung der transplantierbaren hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus (ESC) und deren anschließende Injektion in letal bestrahlten Mäusen Empfänger. Kurz gesagt, ESC als Embryoidkörpern, die dann mit retroviralen HOXB4 und co-kultiviert mit OP9 Stromazellen und hämatopoetischen Zytokinen infiziert sind differenziert.

Ableitung von hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus

Wir zeigen eine einfache und schnelle Methode, um vordefinierte Anzahl von Zellen in mikrofabrizierten Brunnen laden und halten sie für Embryoidkörper Entwicklung.

Shrinky-Dink hängende Tropfen: Ein einfacher Weg zu Form und Kultur Embryoid Bodies

Wir beschreiben die Verwendung einer Maus ES-Zell-basierte Assays, um kritische Zeitfenster für Wnt / β-Catenin und BMP-Signal Aktivierung während kardiogenen Induktion zu identifizieren. Die Methode bietet eine standardisierte Plattform, die zuverlässig quantifiziert kardiogenen Effizienz, und es ist für das Studium der anderen Zelllinien.

Geändert Maus embryonalen Stammzellen basierte Assay zur Quantifizierung von Kardiogener Induction Efficiency

Wir entwickelten ein neues Protokoll, um die Effizienz der in vitro Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Motoneuronen zu verbessern. Die differenzierten ES-Zellen erworbenen motorischen Neuronen verfügt wie durch die Expression von neuronalen und motorischen Neurons Marker mit Hilfe von immunhistochemischen Techniken nachgewiesen.

Effiziente Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Motoneuronen

Das Video zeigt die Differenzierung von embryonalen Stammzellen (mESCs) der Maus zu Embryoidkörpern (EBs) durch die Hanging Drop-Methode. Nach dem Suspendieren der mES-Zellen in hängenden Tropfen und der Inkubation aggregieren die Zellen zu EBs, die unter Verwendung eines mit Retinsäure (RA) ergänzten Differenzierungsmediums weiter zu neuronalen Vorläuferzellen (NPCs) differenziert werden.

Generierung neuronaler Vorläuferzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus mit der Hanging Drop-Methode

Dieses Video demonstriert eine Methode zur in vitro Erzeugung von neuralen Vorläuferzellen (NPCs) aus embryonalen Stammzellen (mESCs) der Maus. Die mES-Zellen werden in Suspension kultiviert, um Embryoidkörper (EBs) zu bilden, die dann durch Retinsäurebehandlung in einer adhärenten Kultur zur Differenzierung in NPCs geführt werden.

Eine Technik zur Erzeugung neuraler Vorläuferzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus

Dieses Protokoll beschreibt detailliert die Methode zur Erzeugung von neuralen Vorläuferzellen aus embryonalen Stammzellen unter Verwendung einer serumfreien Monolayer-Methode. Diese Vorläuferzellen können verwendet werden, um reife neuronale Zelltypen abzuleiten oder den Prozess der neuronalen Spezifikation zu untersuchen, und sind für die Skalierung im Multiwell-Format für das Screening von Verbindungen zugänglich.

Neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Serum-freiem Monolayer-Kultur

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erzeugung von kortikalen Interneuron Stammväter und Post-mitotische Interneuron Vorstufen aus embryonalen Stammzellen der Maus mit einer veränderten Embryoid Körper-Monolayer-Methode. Diese Vorfahren/Vorstufen können werden verwendet in-vitro- Eindringmittel sortiert und in Neugeborenen Neokortex für das Studium Schicksal Bestimmung verpflanzt oder in therapeutischen Anwendungen eingesetzt.

Differenzierung der embryonalen Stammzellen der Maus in kortikalen Interneuron Vorstufen

Hier haben wir eine kostengünstige und einfach zu bedienende Methode etabliert, die eine schnelle und effiziente Differenzierung von embryonalen Stammzellen in Neuronen leitet. Diese Methode eignet sich für die Popularisierung unter Laboratorien und kann ein nützliches Werkzeug für die neurologische Forschung sein.

Neuronale Differenzierung von Maus embryonalen Stammzellen In vitro

Wir beschreiben das Verfahren zur In-vitro-Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in neuronale Zellen mit der Hanging-Drop-Methode. Darüber hinaus führen wir eine umfassende phänotypische Analyse durch RT-qPCR, Immunfluoreszenz, RNA-seq und Durchflusszytometrie durch.

Differenzierung und Charakterisierung neuronaler Vorläufer und Neuronen aus embryonalen Stammzellen der Maus

Lernen Sie die Hanging-Drop-Methode zur In-vitro-Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus. Diese Technik ermöglicht die kontrollierte Bildung von Embryoidkörpern für die Stammzellbiologie.

In-vitro-Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus (mES) Zellen unter Verwendung des Hanging-Drop-Methode

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