Name: Machen Patch-Pipetten und Sharp Elektroden mit einem programmierbaren Puller (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Lernen Sie die Herstellung von Patch-Pipetten und scharfen Elektroden für die Elektrophysiologie mit einem programmierbaren Puller. Diese Methode ermöglicht präzise Glaswerkzeuge für Patch-Clamp-Aufzeichnungen.

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Wir danken folgenden Förderorganisationen und Stiftungen für die Unterstützung: National Institutes of Health, National Science Foundation, der American Heart Association, Gesellschaft für Muskeldystrophie, die Donald B. und Delia E. Baxter-Stiftung, die Klingenstein Fonds und der McKnight Endowment for Neuroscience.

Pulling Pipetten Mit einer Mikroelektrode puller wie Sutter P-97 Flaming / Brown, ziehen eine Reihe von etwa 10-20 Pipetten. <ol><li> Wählen Sie Ihre Kapillare aus Glas. Wir verwenden Borosilikat Kapillaren (Sutter BF150-110 bis 10 mm, 1,5 mm Außendurchmesser, 1,1 mm Innendurchmesser, 10 cm lang). Bewahren Sie das Glas vorsichtig damit es sauber und staubfrei bleibt. </li><li> Entwerfen Sie ein Ziehen Programm. Wir verwenden einen 5-Schritte-Programm, mit absteigender Hitze und Geschwindigkeit bei jedem Schritt, und ein kleiner Zug auf den letzten Schritt. Sutter ist Pipette Kochbuch ist eine hervorragende Referenz für die Entwicklung geeigneter Programme. </li><li> Untersuchen Sie die Pipettenspitzen unter dem Mikroskop auf Öffnungsdurchmesser und Glätte zu bestimmen. Discard rau, uneben oder unregelmäßig Tipps. Ein guter Zug-Protokoll sollten dafür sorgen, diese sind selten. Für Standard-Patch-Clamp-Aufzeichnung, sollte Bahnöffnungen 1-3 Mikrometer im Durchmesser sein. Ein Steilkegel (stumpfe Spitze) führt zu Widerstand für den gleichen Öffnungsdurchmesser geringer. Form und Größe können durch Druck Polieren modifiziert werden. </li></ol> Feuerpolieren Pipetten <ol><li> Richten Sie ein Polieren rig (microforge) mit einem Platin-Heizdraht durch ein Fußpedal gesteuert. Ein nützliches Kit ist ab ALA Scientific (CPM-2) oder eine ähnliche Vorrichtung kann stückweise zusammengesetzt werden. </li><li> Optional: Bestreichen Sie die Pipette mit einem Isolator, um die Kapazität zu verringern und verbessern das Geräuschverhalten. Wir verwenden Dentalwachs. Sylgard 184 ™ (Poly-dimethyl Siloxanelastomer auch als PDMS) ist auch eine Option. </li><li> Bei der Verwendung von Wachs, halten einen kleinen geschmolzenen Versorgung in der Nähe. Mit Luftdruck auf der Rückseite der Pipette auf Wachs von der Eingabe der Pipette zu halten, tauchen die Spitze kurz in das flüssige Wachs und zu entfernen. Mit Sylgard, speichern vorbereitet Elastomer in gefrorenen Aliquots und malen Sie die Pipettenspitze unter dem Mikroskop. Wärme an das Elastomer zu heilen. </li><li> Platzieren Sie die Pipette (beschichtet oder nicht) in der Poliervorrichtung und bringen die Spitze ~ 50 Mikron aus dem Filament. Denken Sie daran, dass der Faden dehnt sich bei Erwärmung. </li><li> Empfohlen: Folgen Sie der separaten Protokoll für &quot;pressure polishing&quot;, um die Form der Pipette für optimale Festigkeit und Spitzendurchmesser ändern. </li><li> Eine kurze Hitze-Impuls (1-2 Sekunden) ist ausreichend, um Wachs, das aus der Spitze der Pipette abnehmen und glatte Glas. </li><li> Legen Sie die fertigen Pipette in einem geschlossenen Kasten, um vor Staub zu schützen, wiederholen Sie für 10 erfolgreiche Pipetten. </li></ol>

<ol><li>Sutter Instrument, P-97 Pipette Cookbook. , Sutter Instrument. 
 
 <a target="_blank" href="http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf">http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf</a> (2008).</li>
</ol>

Das Protokoll dargestellt ist hier im täglichen Einsatz in der Elektrophysiologie Labor und wird auch zur Injektionsnadeln für Zellen und Tieren zu machen. Mit einer programmierbaren Abzieher, ist es leicht, Pipetten für eine Vielzahl von Anwendungen zu machen. Mit Aufmerksamkeit und Pflege, wird das Filament auf Ihren Abzieher für ein Jahr oder länger dauern. Viel Glück mit Ihrer Experimente.

<table><tbody><tr><td>Mikropipetten-Ziehgerät</td><td>Instrument</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>Oder ähnliches Instrument (z. B. Sutter P-87 oder P-2000)</td></tr><tr><td>Glas-Kapillaren</td><td>Reagenz</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF150-86-10</td><td>Alternativ: ähnliche Kapillargläser. Um das Befüllen der Pipette zu erleichtern, verwenden Sie eine Kapillare mit Glasfilament.</td></tr></tbody></table>

machen patch-pipetten und sharp elektroden mit einem programmierbaren puller

Making Patch-pipettes and Sharp Electrodes with a Programmable Puller

Glas-Mikroelektroden (auch als Pipetten) haben ein Arbeitspferd der Elektrophysiologie seit Jahrzehnten. Heute sind solche Pipetten von Glaskapillaren erfolgt über eine programmierbare Abzieher. Solche Instrumente Wärme der Kapillare entweder mit einem Metallfaden oder einem Laser und zeichnen sich aus dem Glas mit der Schwerkraft, einen Motor oder beides. Pipetten für Patch-Clamp-Aufzeichnung werden unter Verwendung nur Hitze und Schwerkraft, während scharfe Elektroden für die intrazelluläre Aufnahme verwenden eine Kombination von Wärme, Schwerkraft und einem Motor. Das Verfahren zur intrazellulären Aufnahme Pipetten machen, ist ähnlich, die zur Injektionsnadeln für eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich cRNA Injektion in Xenopus Oozyten zu machen. Im Allgemeinen, Kapillar-Glas &lt;1,2 mm im Durchmesser wird verwendet, um Pipetten für Patch-Clamp-Aufnahme zu machen, während engeren Glas für die intrazelluläre Aufnahme (Außendurchmesser = 1,0 mm) verwendet wird. Für jedes Werkzeug ist der Abzieher programmiert etwas anders. Dieses Video zeigt, wie man beide Arten von Aufnahmen Pipetten mit vorher festgelegten puller Programme machen.

Dieses Video zeigt, wie eine programmierbare Abzieher verwenden, um Patch-Pipetten und scharfen Elektroden für die Elektrophysiologie zu machen. Das gleiche Verfahren kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Glas-Tools, einschließlich Injektionsnadeln zu machen.

Machen Patch-Pipetten und Sharp Elektroden mit einem programmierbaren Puller

Glaskapillarelektroden (auch als Pipetten bezeichnet) sind seit Jahrzehnten ein grundlegendes Instrument der Elektrophysiologie. Heutzutage werden solche Pipetten aus Glaskapillaren hergestellt ...

Glaskapillarpipetten haben sich in Laboren für eine Vielzahl von Techniken durchgesetzt, wie beispielsweise Einzelzell-Elektroporation, DNA-Mikroinjektion und Patch-Clamp-Elektrophysiologie. Um Glaskapillar-Patch-Clamp-Elektroden für Ableitungen vorzubereiten, wird Silikatglas auf einem programmierbaren Puller gezogen. Die Elektrodenspitzen werden mit Wachs beschichtet, anschließend werden die Spitzen abgeflammt und zur späteren Verwendung gelagert. Hallo, ich bin Miriam Goodman vom Department für Molekulare und Zelluläre Physiologie der Stanford University.In diesem Video zeige ich Ihnen, wie man Patch-Clamp-Pipetten und scharfe Elektroden für die Elektrophysiologie herstellt. Glasmikroelektroden, auch Pipetten genannt, sind seit Jahrzehnten eine Schlüsseltechnologie in der Elektrophysiologie. Heute werden diese Pipetten aus Glas-Kapillaren mithilfe eines programmierbaren Ziehgeräts hergestellt.Beginnen wir. Um Patch-Clamp-Pipetten herzustellen, verwenden wir saubere und staubfreie Kapillaren aus Sutter Bor-Silikatglas und den Sutter P-97 Flammenschleif-Mikroelektrodenzieher. Das Pipetten-Kochbuch von Sutter ist eine hervorragende Referenz zur Entwicklung geeigneter Ziehprogramme.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dies ist eine Anleitung zum Ändern der Form von Glas-Mikropipetten. Insbesondere durch Anwendung von Wärme und Luftdruck der Verjüngung ist ohne Erhöhung des Bahnöffnung verbreitert, was zu niedrigeren Pipette Widerstand. Dies ist entscheidend für rauscharme Aufnahmen von kleinen Zellen zu erhalten, sondern ist in vielen Anwendungen.

Pressure-Polieren Pipetten für verbesserte Patch-Clamp Recording

Planar Lipid-Doppelschichten, die auch als künstliche Lipid-Doppelschichten, können Sie studieren ionenleitenden Kanälen in einem genau definierten Umgebung. Hier zeigen wir die einzelnen Schritte nötig, um die Doppelschicht Kammer vorzubereiten, die Elektroden und wie man testen, ob der Doppelschicht für Einkanal-Messungen ist.

Herstellung künstlicher Doppelschichten für Elektrophysiologie Experimente

Optimierte Transfektion Strategie für Expression und elektrophysiologische Ableitung von rekombinantem Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T-Zellen

Hier beschreiben wir eine schnelle und einfache Methode, um Zellen Steifigkeit zu messen. Das allgemeine Prinzip dieser Methode besteht darin, Membranverformung in Reaktion auf wohldefinierte negativen Druck durch eine Mikropipette an die Zelloberfläche aufgebracht messen. Diese Methode bietet ein leistungsfähiges Werkzeug zur biomechanischen Eigenschaften von Substrat-anhaftenden Zellen zu studieren.

Mikropipette Aspiration von Substrat-attached Cells zu schätzen Zelle Stiffness

Iontophorese von neuronalen Agonisten und Antagonisten während der...

Herstellung und Verwendung von Piggy-Back mehrgehäusigen Elektroden für<em&gt; In vivo</em&gt; Pharmakologische Manipulationen Neural Antworten

Multi-Elektroden-Patch-Clamp-Aufnahmen bilden eine komplexe Aufgabe. Hier zeigen wir, wie durch die Automatisierung vieler Versuchsschritten ist es möglich, den Prozess zur qualitativen Verbesserung der Leistung und der Anzahl der Aufnahmen zu beschleunigen.

Eine EDV-gestützte Multi-Elektroden-Patch-Clamp-System

Bakterielle mechanosensitive Kanäle können als mechanoelektrische Wandler in biomolekularen Geräten verwendet werden. Tropfenschnittstelle Doppelschichten (DIBs), Zell-inspirierten Bausteine ​​für solche Geräte, stellen neue Plattformen zu integrieren und zu stimulieren mechanosensitive Kanäle. Hier zeigen wir, einen neuen Mikropipette Verfahren zur Bildung DIB, die die Untersuchung mechanosensitiver Kanäle unter mechanischer Stimulation.

Multifunktionale, Mikropipette-basierte Methode für den Einbau und Stimulation der bakteriellen mechanosensitiven Ionenkanäle in Droplet Schnittstelle Bilayers

Wir stellen Methoden zur Konstruktion von Elektroden vor, um gleichzeitig extrazelluläre neuronale Aktivität aufzuzeichnen und mehrere neuroaktive Substanzen in der Nähe der Aufzeichnungsstellen bei wachen Mäusen freizusetzen. Diese Technik ermöglicht die detaillierte Analyse mutmaßlicher lokaler synaptischer Eingaben an das interessierende Neuron.

Die extrazelluläre Aufnahme neuronaler Aktivität in Kombination mit Microiontophoretic Anwendung von neuroaktiven Substanzen in Awake Mäuse

Dieses Protokoll beschreibt die Durchführung von automatischen bildgeführten Patch-Clamp-Experimenten mit einem System, das kürzlich für Standard- In-vitro- Elektrophysiologie-Geräte entwickelt wurde.

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Lernen Sie die Herstellung von Patch-Pipetten und scharfen Elektroden für die Elektrophysiologie mit einem programmierbaren Puller. Diese Methode ermöglicht präzise Glaswerkzeuge für Patch-Clamp-Aufzeichnungen.

Machen Patch-Pipetten und Sharp Elektroden mit einem programmierbaren Puller

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