Machen Patch-Pipetten und Sharp Elektroden mit einem programmierbaren Puller

Glaskapillarpipetten sind in Laboratorien für eine Vielzahl von Techniken allgegenwärtig geworden, wie z. B. Einzelzell-Elektroporation, DNA-Mikroinjektion und Patch-Clamp-Elektrophysiologie Zur Vorbereitung von Glaskapillar-Patch-Clamp-Elektroden für Aufzeichnungen oder Silikatglas wird auf einen programmierbaren Pol gezogen. Die Elektrodenspitzen werden mit Wachs beschichtet, und dann werden die Spitzen feuerpoliert und für die zukünftige Verwendung aufbewahrt. Hallo, ich bin Miriam Goodman vom Department of Molecular and Cellular Physiology an der Stanford University.

In diesem Video zeige ich, wie man Patch-Clamp-Pipetten und scharfe Elektroden für die Elektrophysiologie herstellt. Mikroelektroden aus Glas, auch Pipetten genannt, sind seit Jahrzehnten ein Arbeitspferd der Elektrophysiologie. Heute werden diese Pipetten aus Glaskapillaren mit einem programmierbaren Zug hergestellt.

Also lasst uns loslegen. Zur Herstellung von Patch-Clamp-Pipetten verwenden wir Sutter-Wildschweinseide an Kapillaren, die sauber und staubfrei sind, und wir verwenden den Sutter P nine seven flaming ground Mikroelektrodenabzieher. Sutter's Pipette Cookbook ist eine hervorragende Referenz für die Entwicklung geeigneter Zugprogramme.

Heben Sie zunächst die Staubschutzabdeckung am Abzieher an. Nehmen Sie dann ein Glaskapillarrohr aus der Schachtel. Achten Sie darauf, den Deckel wieder aufzusetzen, um die Staubansammlung zu minimieren.

Schieben Sie dann mit einer Hand die Kapillare in die Rille auf einer Seite des Filaments und ziehen Sie die Klemme leicht fest. Zu diesem Zeitpunkt sollte die Klemme fest genug sein, um ein Herunterfallen des Rohrs zu verhindern, aber locker genug, dass Sie es in die Nut schieben können. Lassen Sie nun den Federmetallanschlag auf der gleichen Seite los.

Fassen Sie dann mit Daumen und Zeigefinger die Metalllaschen, die an der Unterseite beider Träger angebracht sind. Lassen Sie den anderen Federanschlag los. Ziehen Sie die Träger bis zum Anschlag zusammen und halten Sie sie mit einer Hand fest.

Schieben Sie dann den Schlauch durch das Filamentgehäuse in die Nut des Trägers auf der anderen Seite. Vermeiden Sie es, das Glas in den Heizfaden zu drücken. Ziehen Sie die Klemmen auf beiden Seiten fest.

Sie sollten fest genug sein, um die Träger an Ort und Stelle zu halten, aber nicht so fest, dass das Glas zerquetscht wird. Schließen Sie nun die Staubschutzhülle und drücken Sie die grüne Taste. Markierte Polpipetten für Patch-Clamp-Aufzeichnungen werden mit einem fünfstufigen Polling-Programm mit absteigender Hitze und Geschwindigkeit bei jedem Schritt und einem kleinen Pol bei jedem Schritt gebildet.

Dieses Programm nutzt Hitze und Schwerkraft. Das Verfahren zur Herstellung scharfer Elektroden ist sehr ähnlich, aber in diesem Fall verwenden wir die dünne Glaskapillare von Warner Instruments, die einen Außendurchmesser von einem Millimeter und einen Innendurchmesser von 0,78 Millimetern hat. Wir wenden auch ein Zugprogramm an, das zusätzlich zu Hitze und Schwerkraft einen Motor verwendet, wenn die Zugprogramme beendet sind.

Heben Sie die Staubschutzhülle an, lösen Sie beide Klemmen und entfernen Sie die fertige Pipette. Legen Sie dann die Pipetten in eine Arbeitsbox. Die Schachtel kann hergestellt werden, indem ein Schaumstoffstreifen auf das Gestell einer Pipettenspitzendose aus Kunststoff geklebt und dann sechs bis acht Schlitze in den Schaumstoff geschnitten werden.

Führen Sie die Pipetten in die Schlitze ein. Sobald die Box mit gezogenen Pipetten gefüllt ist, fahren Sie mit dem Feuerpoliturschritt fort, um die Pipetten zu feuerpolieren. Richten Sie ein Mikroschmiede-Rig mit einem Platin-Heizfaden ein, das über ein Fußpedal gesteuert wird, bevor Sie mit dem Feuerpolieren beginnen.

Beschichten Sie die Pipette zuerst mit Zahnwachs, um die Kapazität zu verringern und die Geräuscheigenschaften zu verbessern. Bewahren Sie dazu einen kleinen Vorrat an geschmolzenem Wachs in der Nähe auf. Üben Sie Luftdruck auf die Rückseite der Pipette aus, um zu verhindern, dass Wachs in die Spitze gelangt.

Tauchen Sie dann die Spitze kurz in das flüssige Wachs. Und jetzt entfernen. Setzen Sie die Pipette in das Poliergerät ein und bringen Sie die Spitze etwa 50 Mikrometer vom Filament entfernt.

Denke daran, dass sich das Filament beim Erhitzen ausdehnt. Wenden Sie einen kurzen Wärmeimpuls von ein bis zwei Sekunden an, um das Wachs von der Spitze der Pipette zu entfernen und das Glas zu glätten. Untersuchen Sie die Pipettenspitzen unter einem Mikroskop, um den Öffnungsdurchmesser und die Glätte zu bestimmen.

Bei Aufnahmen mit Standard-Patch-Klemmen sollten die Spitzenöffnungen einen Durchmesser von ein bis drei Mikrometern haben, verworfen, rau, ungleichmäßig oder unregelmäßig sein. Legen Sie die fertige Pipette in eine Arbeitsbox und achten Sie darauf, den Deckel zu schließen, um die Pipetten vor Staub zu schützen. Wiederholen Sie dies für 10 erfolgreiche Pipetten. Ich habe Ihnen gerade gezeigt, wie man Patch-Clamp-Pipetten und scharfe Elektro mit einem programmierbaren Abzieher herstellt.

Das gleiche Verfahren kann zur Herstellung einer Vielzahl von Glaswerkzeugen verwendet werden, einschließlich Injektionsnadeln für optimale Patch-Clamp-Ergebnisse. Es ist wichtig, daran zu denken, am selben Tag des Experiments neue staubfreie Pipetten zu ziehen und sie innerhalb einer Stunde nach dem Experiment zu polieren. Überprüfen Sie auch durch Inspektion, ob die Pipetten glatt und poliert sind.

Schauen Sie sich unbedingt unser anderes Video an, das zeigt, wie Sie Ionenkanäle, die in Opus-Eizellen exprimiert werden, mit einer Patch-Clamp-Aufzeichnung durchführen. Okay, das war's. Jetzt sind Sie ein Pipettenexperte und viel Glück bei Ihren Experimenten.