Summary
横向主动脉缩窄（TAC）的鼠标是一种常用的实验模型研究的内在机制，心肌肥厚和心力衰竭的发展。在这里，我们描述程序，创建一个小鼠心肌肥厚的重复性程度的主动脉。
Abstract
横向主动脉缩窄（交咨会）在小鼠压力超负荷引起的心肌肥厚和心力衰竭是一种常用的的实验模型。
Protocol
第1部分：操作现场的制备
- 操作现场消毒用75％异丙醇。
- 确保加热垫，并在合适的温度是。一个推荐系统是一个Gaymar循环水泵连接到一个治疗垫，保持在37 ° C ± 1 ° C。重要的是要在手术过程中保持正常体温，以避免在心率迅速下降。
- 在炎热珠手术前灭菌消毒外科手术工具。对于此过程，您将需要手术器械：钝剪刀，当然弯钳× 2，罚款45 ° × 2，角度弹簧剪刀，胸部拉钩和持针器，直角钳。
- 棉花施药应在出血的情况下的手。
第2部分：对小鼠的制备和插管
- 小鼠是麻醉诱导室与2％异氟醚0.5 -1.0升/分钟100％O 2的混合。
- 卷发器是用来刮胡子的皮草，从领口到中期胸部水平。
- 鼠标被放置在一个加热垫上面的仰卧姿势，以保持体温。
- 橡皮筋的是放置在动物的前牙颈部延长。一方面在使用弯钳，舌头轻轻地操纵到了一边。另一方面，进行气管插管，使用了PE 90管。气管内管，然后连接到一个哈佛量循环灭鼠呼吸机在125-150次/分钟骑自行车和潮气量的0.1 -0.3毫升。在手术过程中，麻醉维持在1.5-2％异氟醚为0.5 - 1.0 L / min的100％O 2 。麻醉正确的验证鼠标钉床（趾捏反射）施加压力。
- 与70％的酒精优碘溶液消毒手术野。此过程重复三次。
- 为了防止在操作过程中手术野的污染，无菌的悬垂放置在鼠标离开只有手术视野暴露。
- 无菌手套是用来为每个单独的鼠标。
第3部分：横向主动脉结扎
- 部分开胸手术显微镜下进行第二肋骨和胸骨缩回使用胸部拉钩。
- 精尖45 °直角钳轻轻分开从主动脉弓的胸腺和脂肪组织。
- 鉴定横向主动脉，6.0丝线缝合的小片放在之间的无名和左侧颈总动脉（图1） 。
- 两个松散的绳结绑在横向主动脉和小片的一个27 ½计钝针平行放置的横向主动脉。迅速并列第一结对针，第二针及时摘除，以产生一个直径0.4毫米收缩。在深水对照组小鼠，整个过程是相同的主动脉结扎除外。
- 胸部拉钩将被删除，2秒重新膨胀肺的呼吸机捏过的流出。
- 肋骨被关闭使用6.0普理灵缝线间断缝合模式。
- 皮肤是封闭使用一个6.0普理灵缝合与连续缝合模式。
第4部分：手术后恢复
- 手术后的镇痛，丁丙诺啡（0.1毫克/公斤）腹腔注射小鼠。如果有手术后的脱水的迹象，无菌生理盐水腹腔注射。
- 麻醉逐渐降低至关闭位置，气管插管，自主呼吸的迹象出现时，将删除。
- 鼠标移动到俯卧位，并允许恢复加热垫。
第5部分：确认成功的横向主动脉结扎
- 一个星期后，交咨会，鼠标重新麻醉，以确定横向主动脉结扎引起的压力超负荷的程度。如上所述，麻醉维持在1.5-2％异氟醚为0.5 - 1.0 L / min的100％O 2和体温保持在37 ° C ± 1 ° C。
- 一个20 MHz多普勒探头被放置在一个45度角检测流速对颈部的左，右两侧。一个基于计算机的多普勒信号处理器（梧桐仪器，休斯敦，得克萨斯州）5使用多普勒信号显示和存储。
- 根据实验的协议所需的压力超负荷的程度，与右颈（RC）/左侧颈（立法会）在一定范围内流动比率只小鼠作进一步分析。例如，一个中等程度的压力超负荷导致的比例为5-8，而更严格的收缩resultin克在严重压力超负荷导致了8-10的比例（图5.3A）。深水动物（操作，但不结扎），然而，预计有〜1（图5.3B）的比例。
6：代表结果
以下交咨会在野生型小鼠的生存，是典型的手术约80-90％。成功的横向主动脉手术结扎会导致左，右颈总动脉之间的一个多普勒血流速度比5-10（RC / LC）（图1）。假手术组小鼠（图2A），随压力超负荷的小鼠相比，预计开发在1-2周，心脏扩张，心肌肥厚，6至8星期之后，根据缢（图2B）的松紧程度在野生型小鼠在第一个月后，交咨会的死亡率通常较低（<20％），虽然转基因小鼠可能会表现出不同的的存活率。6,7
图1。使用横向主动脉结扎多普勒速度测量确认。代表权的多普勒速度信号（RC）和左侧颈（立法会）动脉后TAC 6天。这些录音表现出一个成功的结扎〜6.8的RC / LC流动比率。
图2。以下交咨会的代表整个心脏图像 。 一个假手术野生型小鼠心脏。B。野生型小鼠心脏16周后，交咨会。每行= 1毫米。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
交咨会，它模仿人类的主动脉瓣狭窄，是一种常见的方法诱导小鼠心肌肥厚和心脏衰竭。主动脉缩窄的其他地点包括升序和腹主动脉。升主动脉缩窄提供了一个极端，更迅速地的超负荷左心室（LV）的。相比之下，腹主动脉缩窄叶完整的作为一个可能的补偿手段的流通的较大部分。因此，交咨会往往是首选模式，因为它提供了足够的低压过载时间依赖性的方式更适合调查。虽然此程序可以在技术上具有挑战性与实践，我们已经取得了野生型小鼠的80％-90％的成活率。
横向主动脉缩窄的松紧程度决定了肥大的发展程度和时限，心脏衰竭和扩张发展。此外，小鼠的年龄影响回收率和心脏衰竭的发展动力。年纪较大的老鼠（> 12月龄）需要更长的时间开发一种适应性反应，交咨会的颈动脉，并有可能发展扩张型心肌病的速度比年轻的老鼠（3-4个月的年龄）5 。
小鼠的非侵入性插管需要一些练习。另一种方法是如下：
- 一个小的中线颈椎切口是钝的剪刀和组织，用弯钳，以揭露气管气管周围隔开。
- 一块缝合周围放置的门牙，轻轻拉远离动物的尸体，以延长颈部。
- 一方面在使用弯钳，舌头轻轻地操纵到了一边。
- 另一方面，进行气管插管使用PE 90管为便于入境的边缘斜面。
气管内管，然后连接到一个哈佛量循环灭鼠呼吸机在125-150次/分钟骑自行车和潮气量的0.1 -0.3毫升。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
XHTW是WM凯克基金会杰出青年学者在医学研究中，也是由NHLBI /美国国立卫生研究院拨款HL089598 R01 - R01 - R01HL091947，和肌肉萎缩症协会授予＃69238支持。 RJvO是2008-2010年美国生理学学会在生理基因组学博士后奖学金收件人。这项工作是支持部分由Leducq基金会CaMKII在心脏信号的联盟。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gaymar T/pump | Harvard Apparatus | Model TP-500 | Circulating water pump |
| Temp. therapy pads | Harvard Apparatus | 60-3414 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Blunt scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5980 | |
| Angled spring scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5668 | |
| Chest retractor | Fine Science Tools | 17002-02 | |
| Course curved forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5138 | |
| Dumont fine 45° angled forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Electric shaver | GE Healthcare | For shaving mouse fur | |
| PE 90 tubing | BD Biosciences | 427420 | For intubation |
| MiniVent (ventilator) | Harvard Apparatus | Type 845 | |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-027132 | May be purchased at medical supply store |
| Sterile gloves | Mckesson | 20-1565 | |
| Stereo microscope | Unico | ZM186 | |
| 6-0 silk suture | Fine Science Tools | 18020-60 | |
| 27 ½ gauge needle | BD Biosciences | 305109 | |
| 6-0 prolene suture | Mckesson | 3286 | |
| Buprenorphine | Institutional Animal Facility |
References
- Rockman, H. A., Ross, R. S., Harris, A. N., Knowlton, K. U., Steinhelper, M. E., Field, L. J., Ross, J. Jr, Chein, K. R. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 8277-8281 (1991).
- Heineke, J., Molkentin, J. D. Regulation of cardiac hypertrophy by intracellular signaling pathways. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 7, 589-600 (2006).
- Hartley, C. J., Reddy, A. K., Madala, S., Michael, L. H., Entman, M. L., Taffett, G. E. Doppler estimation of reduced coronary flow reserve in mice with pressure overload cardiac hypertrophy. Ultrasound Med. Biol. 34, 892-901 (2008).
- Reddy, A. K., Taffett, G. E., Li, Y. -H., Lim, S. -W., Pham, T. T., Pocius, J. S., Entman, M. L., Michael, L. H., Hartley, C. J. Doppler signal processing for use in mice: applications. IEEE Trans. Biomed. Eng. 52, 1771-1783 (2005).
- Li, Y. -H., Reddy, A. K., Ochoa, L. N., Pham, T. T., Hartley, C. J., Micheal, L. H., Entman, M. L., Taffett, G. E. Effect of age on peripheral vascular response to transverse aortic banding in mice. J. Gerontol. 58A, 895-899 (2003).
- Bourajjaj, M., Armand, A. S., Martins, daC. osta, Weijts, P. A., Nagel, B. V. ander, Heeneman, R., Wehrens, S., Windt, X. H. D. e, J, L. NFATc2 is a necessary mediator of calcineurin-dependent cardiac hypertrophy and heart failure. J. Biol. Chem. 28, 22295-22303 (2008).
- Oort, R. J. van, Respress, J. L., Li, N., Reynolds, C., Almeida, A. C. D. e, Skapura, D. G., Windt, L. J. D. e, Wehrens, X. H. Accelerated development of pressure overload induced cardiac hypertrophy and dysfunction in an RyR2-R176Q knockin mouse model. Hypertension. 55, (2010).
- Tarnavski, O., McMullen, J. R., Schinke, M., Nie, Q., Kong, S., Izumo, S. Mouse cardiac surgery: comprehensive techniques for the generation of mouse models of human diseases and their application for genomic studies. Physiol Genomics. 16, 349-360 (2004).
