Summary
Fare Enine aort daralma (TAC), kalp hipertrofisi ve kalp yetmezliği gelişme yatan mekanizmaları incelemek için yaygın olarak kullanılan bir deneysel model. Burada, prosedürler, farelerde kalp hipertrofisi tekrarlanabilir bir derece oluşturmak için aort sıkmak için açıklanmaktadır.
Abstract
Fare Enine aort daralma (TAC) basınç aşırı bağlı kalp hipertrofisi ve kalp yetmezliği için yaygın olarak kullanılan bir deneysel model.
Protocol
Bölüm 1: İşletim Alan hazırlanması
- Faaliyet alanı,% 75 izopropil alkol ile dezenfekte edilir.
- Isıtma yastığı ve doğru sıcaklıkta olduğundan emin olun. Önerilen sistem ° C ± 1 ° C 37 tutulur bir tedavi pad bağlı bir Gaymar dolaşan su pompası Kalp hızı hızlı bir düşüş önlemek için ameliyat sırasında normal vücut ısısını korumak için önemlidir.
- Ameliyat öncesi sıcak bir boncuk sterilizatör cerrahi aletler sterilize edilir. Künt makas, elbette kavisli bir forseps X 2, ince 45 ° açılı forseps X 2, açılı yaylı makas, göğüs retraktörü, ve iğne tutucu: Bu işlem için, aşağıdaki cerrahi aletler gerekecektir
- Pamuk aplikatörler yandan kanama durumunda olmalıdır.
Bölüm 2: Hazırlık ve Fare, Entübasyon
- Fare ile indüksiyon odasında anestezi% 2 izofluran 0.5 -1.0 L / dk% 100 O 2 ile karıştırılır.
- Saç kesme makineleri, kürk yaka orta göğüs seviyesine tıraş için kullanılır.
- Fare, vücut ısısını korumak için, bir ısıtma yastığı üzerinde bir yatar pozisyonda yerleştirilir.
- Bir lastik bant boyun uzatmak için hayvan s ön dişlerin üzerine yerleştirilir. Bir yandan kavisli bir forseps kullanma, dil hafifçe yan manipüle. Öte yandan, endotrakeal entübasyon, PE 90 boru kullanılarak yapılır. Endotrakeal tüp daha sonra Harvard 125-150 nefes / dakika hacim döngüsü kemirgen ventilatör bisiklet ve 0.1-0.3ml tidal volüm bağlı. 1.0 L / dk% 100 O 2 - cerrahi işlem sırasında, anestezi 0.5 ile% 1.5-2 izofluran tutulur. Doğru anestezi düzeyi, fare tırnak yatağı (toe-tutam refleks) basınç uygulayarak tarafından doğrulanmadı.
- Cerrahi alanında,% 70 alkol ile takip betadin çözüm ile dezenfekte edilir. Bu işlem üç kez tekrarlanır.
- Operasyon sırasında cerrahi alanın kirlenmesini önlemek için, steril bir drape, sadece faaliyet alanı maruz bırakarak fare üzerine yerleştirilir.
- Steril eldiven, her bir fare için kullanılır.
Bölüm 3: Enine Aort ligasyon
- Ikinci kaburga Kısmi torakotomi cerrahi mikroskop altında yapılan ve sternum göğüs retraktörü kullanarak geri çekilir.
- Güzel ucu 45 ° açılı forseps yavaşça aort kemer timus ve yağ dokusu ayırmak için kullanılır.
- Transvers aort belirlenmesini takiben, 6.0 ipek sütür küçük bir parça innominate ve sol karotis arterler (Şekil 1) arasına yerleştirilir.
- İki gevşek knots transvers aort etrafında bağlı ve küçük bir parça, 27 ½ göstergesi künt iğne transvers aort paralel olarak yerleştirilir. Ilk knot hızla, iğne karşı bağlanmış ardından, ikinci ve iğne çapı 0.4mm bir daralma verim için derhal kaldırılır. Sahte kontrol farelerde, tüm prosedür aort ligasyonu dışında aynıdır.
- Göğüs retraktörü çıkarılır ve akciğerlere yeniden şişirmek için 2 saniye için ventilatör sıkışmak off çıkış.
- Göğüs kafesi, dikişler ile 6.0 prolen dikiş kullanarak kapatılır.
- Cilt sürekli bir dikiş deseni ile 6.0 prolen dikiş kullanılarak kapatılır.
Bölüm 4: Post-operatif Kurtarma
- Post-operatif analjezi için, fare buprenorfin (0.1 mg / kg) intraperitoneal olarak enjekte edilir. Ameliyattan sonra dehidratasyon belirtileri varsa, steril serum fizyolojik intraperitoneal olarak verilir.
- Anestezi kapalı konuma yavaş yavaş indirdi ve spontan solunum belirtileri ortaya çıktığında endotrakeal tüp çıkarılır.
- Fare yüzükoyun pozisyonda taşınır ve ısıtma yastığı kurtarmak için izin verilir.
Bölüm 5: Enine Aort Başarılı ligasyon Onay
- TAC Bir hafta sonra, fare transvers aort ligasyonu ile indüklenen basınç yüklenmesinin derecesini belirlemek için yeniden anestezi. Bakımı, 37 ° 1.0 L / dk% 100 O 2 ve vücut ısısı ° C ± 1 ° C - Yukarıda açıklandığı gibi, anestezi 0.5 ile% 1.5-2 izofluran tutulur
- 20 MHz Doppler probu boynun sağ ve sol tarafta akım hızları tespit etmek için 45 derecelik bir açıyla yerleştirilir. Bir bilgisayar tabanlı Doppler sinyal işlemcisi (İndus Instruments, Houston, Teksas), Doppler sinyalleri görüntüleyebilir ve saklamak için kullanılan 5
- Sadece sağ karotis (RC) / sol karotis (LC), belirli bir aralık içinde akış oranı ile farelerde deneysel protokol için gerekli basınç yüklenmesinin derecesine bağlı olarak, daha fazla analiz için dahildir. Şiddetli basınç yüklenmesi sonucu sıkı bir daralma t açar Örneğin, basınç aşırı bir derecede, 5-8 'lik bir oran ise yol açar8-10 oa oranı (Şekil 5.3A). Sahte hayvan (işletilen ancak bağlandı değil), ancak, ~ 1 (Şekil 5.3B) bir oran olması beklenir.
6: Temsilcilik Sonuçları
Wild-tip farelerde TAC aşağıdaki tipik bir cerrahi sağkalım% 80-90. Transvers aort Başarılı cerrahi ligasyon 5-10 sağ ve sol karotis arter arasında bir Doppler akış hızı oranı (RC / LC) (Şekil 1) yol açacaktır. Sahte çalışan fareler (Şekil 2A) ile karşılaştırıldığında, basınç yükü olan fareler, daralma gerginlik (Şekil 2B) bağlı olarak, 6-8 hafta sonra 1-2 hafta ve kardiyak dilatasyon içinde kalp hipertrofisi geliştirmek bekleniyor. TAC sonraki ilk ay boyunca mortalite, genetiği değiştirilmiş farelerde farklı sağkalım oranları gösterebilir rağmen, wild-tip farelerde genellikle düşük (<% 20). 6,7
Şekil 1. Doppler Hız Ölçüm kullanarak Enine Aort ligasyon teyidi. Hakkının Temsilcisi Doppler hız sinyalleri (RC) ve sol karotis (LC) arterler 6 gün post-TAC. Bu kayıtlar ~ 6.8 RC / LC akış oranı ile başarılı bir ligasyonu göstermektedir. Lütfen Şekil 1'de bir büyük halini görmek için buraya tıklayınız .
Şekil 2. TAC ardından Temsilcisi Tüm Kalp görüntüler. A Şam çalışan vahşi tip fare kalp B. Vahşi tip fare kalp 16 hafta post-TAC. Her satır = 1mm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Insan aort stenozu taklit TAC, farelerde kalp hipertrofisi ve kalp yetmezliği ikna etmek için yaygın bir yöntem. Aort daralma için alternatif siteler artan ve abdominal aorta içerir. Artan aort daralma, aşırı sol ventrikül (LV) ve daha hızlı aşırı sağlar. Buna karşılık, abdominal aort daralma olası tazminat aracı olarak dolaşıma bozulmamış büyük bir kısmını bırakır. Soruşturma için daha uygun bir zamana bağımlı biçimde yeterli AG aşırı sağlar Bu nedenle 8, TAC sıklıkla tercih edilen bir model . Bu yordamı uygulama ile, teknik olarak zor olmasına rağmen, vahşi tip farelerin hayatta kalma oranı% 80-90 bir elde var.
Transvers aort daralma gerginlik derecesi ve kalp yetmezliği ve dilatasyonu geliştiği zaman çerçevesi hipertrofisi gelişimi belirler. Ayrıca, farelerin yaş iyileşme oranı ve kalp yetmezliği gelişme kinetiği etkiler. Yaşlı fareler (yaş> 12 ay) TAC karotid arterlerin adaptif bir yanıt geliştirmek için daha uzun sürebilir ve dilate kardiyomiyopati genç farelerde (yaş 3-4 ay) daha hızlı geliştirme olasılığı vardır. 5
Non-invazif entübasyon farelerin pratik yapmayı gerektirir. Alternatif bir yöntem aşağıdaki gibi:
- Trakea trakea göstermek için kavisli bir forseps kullanarak etrafında ayrılmış künt makas ve doku, küçük orta hat servikal kesi yapılır.
- Bir parça dikiş ön dişlerin etrafındaki yerleştirilir ve hafifçe boyun uzatmak için hayvanın vücudunu uzak çekti.
- Bir yandan kavisli bir forseps kullanma, dil hafifçe yan manipüle.
- Öte yandan, endotrakeal entübasyon giriş kolaylığı için kenarı eğimli PE 90 boru kullanılarak yapılır.
Endotrakeal tüp daha sonra Harvard 125-150 nefes / dakika hacim döngüsü kemirgen ventilatör bisiklet ve 0.1-0.3ml tidal volüm bağlı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
XHTW WM Keck Tıp Araştırma Vakfı Seçkin Genç Bilim İnsanı, ve aynı zamanda NIH / NHLBI hibe R01-HL089598 ve R01-R01HL091947 ve Müsküler Distrofi Birliği hibe # 69.238 tarafından desteklenmektedir. RJvO Fizyolojik Genomik 2008-2010 Amerikan Fizyoloji Derneği'nin Doktora Sonrası Araştırma Bursu almıştır. Bu çalışma aynı zamanda CaMKII Kalp Sinyal Vakfı Leducq Alliance tarafından kısmen destekleniyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gaymar T/pump | Harvard Apparatus | Model TP-500 | Circulating water pump |
| Temp. therapy pads | Harvard Apparatus | 60-3414 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Blunt scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5980 | |
| Angled spring scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5668 | |
| Chest retractor | Fine Science Tools | 17002-02 | |
| Course curved forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5138 | |
| Dumont fine 45° angled forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Electric shaver | GE Healthcare | For shaving mouse fur | |
| PE 90 tubing | BD Biosciences | 427420 | For intubation |
| MiniVent (ventilator) | Harvard Apparatus | Type 845 | |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-027132 | May be purchased at medical supply store |
| Sterile gloves | Mckesson | 20-1565 | |
| Stereo microscope | Unico | ZM186 | |
| 6-0 silk suture | Fine Science Tools | 18020-60 | |
| 27 ½ gauge needle | BD Biosciences | 305109 | |
| 6-0 prolene suture | Mckesson | 3286 | |
| Buprenorphine | Institutional Animal Facility |
References
- Rockman, H. A., Ross, R. S., Harris, A. N., Knowlton, K. U., Steinhelper, M. E., Field, L. J., Ross, J. Jr, Chein, K. R. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 8277-8281 (1991).
- Heineke, J., Molkentin, J. D. Regulation of cardiac hypertrophy by intracellular signaling pathways. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 7, 589-600 (2006).
- Hartley, C. J., Reddy, A. K., Madala, S., Michael, L. H., Entman, M. L., Taffett, G. E. Doppler estimation of reduced coronary flow reserve in mice with pressure overload cardiac hypertrophy. Ultrasound Med. Biol. 34, 892-901 (2008).
- Reddy, A. K., Taffett, G. E., Li, Y. -H., Lim, S. -W., Pham, T. T., Pocius, J. S., Entman, M. L., Michael, L. H., Hartley, C. J. Doppler signal processing for use in mice: applications. IEEE Trans. Biomed. Eng. 52, 1771-1783 (2005).
- Li, Y. -H., Reddy, A. K., Ochoa, L. N., Pham, T. T., Hartley, C. J., Micheal, L. H., Entman, M. L., Taffett, G. E. Effect of age on peripheral vascular response to transverse aortic banding in mice. J. Gerontol. 58A, 895-899 (2003).
- Bourajjaj, M., Armand, A. S., Martins, daC. osta, Weijts, P. A., Nagel, B. V. ander, Heeneman, R., Wehrens, S., Windt, X. H. D. e, J, L. NFATc2 is a necessary mediator of calcineurin-dependent cardiac hypertrophy and heart failure. J. Biol. Chem. 28, 22295-22303 (2008).
- Oort, R. J. van, Respress, J. L., Li, N., Reynolds, C., Almeida, A. C. D. e, Skapura, D. G., Windt, L. J. D. e, Wehrens, X. H. Accelerated development of pressure overload induced cardiac hypertrophy and dysfunction in an RyR2-R176Q knockin mouse model. Hypertension. 55, (2010).
- Tarnavski, O., McMullen, J. R., Schinke, M., Nie, Q., Kong, S., Izumo, S. Mouse cardiac surgery: comprehensive techniques for the generation of mouse models of human diseases and their application for genomic studies. Physiol Genomics. 16, 349-360 (2004).
