Summary
마우스의 가로 대동맥 수축 (TAC)은 심장 비대 및 심장 마비 개발을 기본 메커니즘을 연구하기 위해 일반적으로 사용되는 실험적인 모델입니다. 여기, 우리는 절차가 생쥐에서 심장 비대의 재현성 학위를 만들 수있는 대동맥을 수축에 대해 설명합니다.
Abstract
마우스의 가로 대동맥 수축 (TAC)은 압력 과부하 유발 심장 비대 및 심장 마비에 대해 일반적으로 사용되는 실험적인 모델입니다.
Protocol
1 부 : 운영 필드의 작성
- 운영 필드 75% 이소 프로필 알코올로 소독합니다.
- 가열 패드와 적당한 온도에 있는지 확인하십시오. 권장 시스템 ° C ± 1 ° C. 37 유지 치료 패드에 연결된 Gaymar 순환 펌프입니다 심장 박동의 급속한 감소를 피하기 위해 그것은 수술 동안 정상 체온을 유지하는 것이 중요합니다.
- 수술 도구는 수술 전에 뜨거운 구슬 살균기로 소독을하고 있습니다. 무딘 가위, 물론 곡선 집게 X 2, 벌금 45 ° 직각 집게 X 2, 직각 봄 가위, 가슴 견인기, 그리고 바늘 홀더 :.이 절차 들어, 다음과 같은 수술 도구가 필요합니다
- 커튼 applicators은 출혈의 경우를 대비해해야합니다.
2 부 : 준비 및 마우스의 삽관법
- 마우스로 유도 챔버에 anesthetized 아르 2퍼센트 isoflurane 0.5 -1.0 L / 분 백퍼센트 O 2 혼합.
- 헤어 가위는 neckline 중순 가슴 수준으로 모피를 면도하는 데 사용됩니다.
- 마우스는 체온을 유지하기 위해 가열 패드 위에 부정사 위치에 배치됩니다.
- 고무 밴드는 목에을 연장하기 위해 동물의 앞니 위에 배치됩니다. 한 손으로 곡선 집게를 사용하여 혀가 부드럽게 측면으로 조작할 수 있습니다. 다른 한편으로, endotracheal 삽관법은 PE 90 튜브를 사용하여 수행됩니다. endotracheal 튜브 그런 다음 숨을 125-150 / 분에서 하버드 볼륨 순환될 쥐 환풍기 사이클링 0.1 - 0.3ml의 갯벌 볼륨에 연결되어 있습니다. 1.0 L / 분 백퍼센트 O 2 - 수술 도중 마취가 0.5와 isoflurane 1.5-2 %에서 관리하고 있습니다. 마취의 올바른 수준 마우스 손톱 침대 (발가락 - 핀치 반사)에 압력을 적용하여 확인됩니다.
- 외과 분야는 70 % 알콜 다음 betadine 솔루션으로 소독합니다. 이 절차는 세 번 반복됩니다.
- 작업하는 동안 수술 부위의 오염을 방지하기 위해 무균 드레이프는 작업 필드 노출 떠나는 마우스 배치됩니다.
- 멸균 장갑 세트 각 마우스에 사용됩니다.
파트 3 : 트랜스 대동맥의 결합
- 두 번째 늑골을 부분 thoracotomy은 수술 현미경을 수행하고 흉골은 가슴 견인기를 사용하여 철회 있습니다.
- 좋은 팁 45 ° 직각 포셉가 부드럽게 대동맥 아치에서 thymus과 지방 조직을 분리하는 데 사용됩니다.
- 가로 대동맥의 신분에 따라, 6.0 실크 봉합사의 작은 조각은 innominate과 왼쪽 경동맥 동맥 (그림 1) 사이에 배치됩니다.
- 두 느슨한 노트는 가로 대동맥 주위에 연결되어 있으며, 27의 작은 조각은 ½ 게이지 뭉툭한 주사 바늘을 가로 대동맥에 평행하게 배치됩니다. 첫 번째 매듭은 빠르게, 바늘에 대해 연결된 두 번째로 다음과 바늘 즉시 직경 0.4mm의 수축을 항복하기 위해 제거됩니다. 가짜 제어 마우스에서 전체 과정은 대동맥의 결합을 제외하고 동일합니다.
- 가슴 견인기을 제거하고 다시 부풀려 폐 2 초 동안 환풍기 모근에서의 유출이다.
- 갈빗대는 중지 봉합 패턴 6.0 prolene의 봉합사를 사용하여 닫힙니다.
- 피부는 지속적인 치료 패턴 6.0 prolene의 봉합사를 사용하여 닫힙니다.
4 부 : 포스트 수술 복구
- 이후 수술 진통제 들어, 마우스가 buprenorphine (0.1 밀리그램 / kg) intraperitoneally로 주입됩니다. 수술 후 탈수의 징후가있다면, 멸균 생리가 intraperitoneally 주어집니다.
- 마취는 점차 해제 위치로 낮춘 및 자발적인 호흡의 징후가 발생할 때 endotracheal 튜브가 제거됩니다.
- 마우스가 발생하기 쉬운 위치로 이동하고 손난로에서 복구하는 허용됩니다.
5 부 : 트랜스 대동맥의 성공적인 결합의 확인
- TAC 후 일주일은 마우스가 가로 대동맥의 결합에 의해 유도된 압력 과부하에 노출된 정도를 확인하기 위해 다시 anesthetized입니다. 37 유지 1.0 L / 분 백퍼센트 O 2, 체온 ° C ± 1 ° C. - 위에서 설명한 바와 같이, 마취는 0.5과 isoflurane 1.5-2 %로 유지
- 20 MHz의 도플러 프로브 흐름 판매율을 탐지하기 위해 45 ° 각도로 목의 왼쪽과 오른쪽 측면에 배치됩니다. 컴퓨터 기반의 도플러 신호 프로세서 (인더스 인 스트 루먼트, 휴스턴, TX) 도플러 신호를 표시하고 저장하는 데 사용되었다. 5
- 실험 프로토콜에 필요한 압력 과부하의 정도에 따라 오른쪽 경동맥 (RC) / 좌측 경동맥 (LC) 특정 범위 내에서 유동 비율만을 생쥐는 추가 분석을 위해 포함됩니다. 심각한 압력 과부하의 결과 어깨를 수축이 T를 리드 반면에 예를 들어, 압력 과부하의 중간 정도, 5-8의 비율로 연결80-10의 OA 비율 (그림 5.3A). 가짜 동물은 (운영하지만, 출혈도 잡았하지 않음) 그러나, ~ 1 (그림 5.3B)의 비율을 것으로 예상된다.
6 : 대표 결과
야생 형 생쥐의 전술에 따라 일반 외과 생존은 80-90 % 정도입니다. 가로 대동맥의 성공적인 수술 내고 5-10의 오른쪽과 왼쪽 경동맥 사이의 도플러 유속 비율 (RC / LC) (그림 1)으로 이어질 것입니다. 가짜 운항 마우스 (그림 2A)에 비해 압력 과부하와 생쥐는 수축 (그림 2B)의 죄어져 있음에 따라, 6-8 주에 1~2주 및 심장 팽창 이내에 심장 비대를 개발 예정이다. 유전자 - 수정된 생쥐가 다른 생존 속도를 전시 수도 있지만 TAC 후 첫 달 동안 사망률은 야생 형 생쥐에 (<20 %) 일반적으로 낮습니다. 6,7
그림 1. 도플러 속도 측정을 사용하여 트랜스 대동맥의 결합의 확인. 오른쪽 대표 도플러 속도 신호 (RC)과 왼쪽 경동맥 (LC) 동맥 육일 포스트 TAC. 이 음반은 ~ 6.8의 RC / LC 유동 비율과 함께 성공적인 결합을 보여줍니다. 하시기 바랍니다 여기를 클릭 그림 1의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
그림 2. TAC 다음 대표 전심 이미지. . 섐 - 운영 야생 타입 마우스 심장. B. 와일드 타입 마우스 심장 16주 포스트 TAC. 각 라인 = 1mm.
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Discussion
인간의 대동맥 협착증을 모방한 것이었 전술은 생쥐에서 심장 비대 및 심장 마비를 유발하는 일반적인 방법입니다. 대동맥 수축에 대한 대체 사이트는 오름차순 및 복부 대동맥을 포함합니다. 대동맥 수축 오름차순하면 좌심실 (LV)에 극도 더 빠른 과부하를 제공합니다. 반면, 복부 대동맥 수축 가능한 보상하는 수단으로 순환 그대로 큰 부분을 떠납니다.이 조사를 더받을 수있는 시간 종속 방식으로 적절한 LV의 과부하에 제공하는 등 따라서 8, TAC는 종종 선호하는 모델입니다. 이 절차는 연습, 기술적 도전 수 있지만, 우리는 야생 타입 마우스에 80-90%의 생존 비율을 달성했습니다.
가로 대동맥 수축의 죄어져 있음은 비대 개발의 정도와 심장 마비 및 팽창은 개발하는 기간을 결정합니다. 또한, 생쥐의 시대는 복구 속도와 심장 마비로 개발 속도론에 영향을 미칩니다. 이전 생쥐 (세> 12 개월) TAC에 경동맥 동맥의 적응 반응을 개발하기 위해 오랜 시간이 걸릴하고, 빠른 어린 생쥐 (나이 3-4개월)보다 확장성 심근증을 개발 가능성이 높습니다 5.
생쥐의 비침습 삽관법은 연습 걸립니다. 다음과 같이 다른 방법은 다음과 같습니다 :
- 작은 정중선 자궁 절개는 기관을 폭로하기 위해 곡선 집게를 사용하여 기관 주변의 분리 무딘 가위와 조직으로 만든 것입니다.
- 봉합사의 조각은 앞니 주위 배치하고 부드럽게 목을 연장 거리에 동물의 시체에서 가져온 것입니다.
- 한 손으로 곡선 집게를 사용하여 혀가 부드럽게 측면으로 조작할 수 있습니다.
- 다른 한편으로, endotracheal 삽관법이 항목의 용이성을 위해 가장자리에 beveled PE 90 튜브를 사용하여 수행됩니다.
endotracheal 튜브 그런 다음 숨을 125-150 / 분에서 하버드 볼륨 순환될 쥐 환풍기 사이클링 0.1 - 0.3ml의 갯벌 볼륨에 연결되어 있습니다.
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Acknowledgments
XHTW 의료 연구에 WM 켁 재단 고유 영 학자이며, 또한 NIH / NHLBI 보조금 R01 - R01 - HL089598 및 R01HL091947, 그리고 근육질 영양 장애 협회 부여 # 69238에 의해 지원됩니다. RJvO는 생리 게놈의 2008-2010 미국 생리 학회 박사 과정 이수 해안에서받는 것입니다. 이 작품은 또한 CaMKII가 마음에 신호를위한 Fondation Leducq 동맹에 의해 부분적으로 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gaymar T/pump | Harvard Apparatus | Model TP-500 | Circulating water pump |
| Temp. therapy pads | Harvard Apparatus | 60-3414 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Blunt scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5980 | |
| Angled spring scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5668 | |
| Chest retractor | Fine Science Tools | 17002-02 | |
| Course curved forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5138 | |
| Dumont fine 45° angled forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Electric shaver | GE Healthcare | For shaving mouse fur | |
| PE 90 tubing | BD Biosciences | 427420 | For intubation |
| MiniVent (ventilator) | Harvard Apparatus | Type 845 | |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-027132 | May be purchased at medical supply store |
| Sterile gloves | Mckesson | 20-1565 | |
| Stereo microscope | Unico | ZM186 | |
| 6-0 silk suture | Fine Science Tools | 18020-60 | |
| 27 ½ gauge needle | BD Biosciences | 305109 | |
| 6-0 prolene suture | Mckesson | 3286 | |
| Buprenorphine | Institutional Animal Facility |
References
- Rockman, H. A., Ross, R. S., Harris, A. N., Knowlton, K. U., Steinhelper, M. E., Field, L. J., Ross, J. Jr, Chein, K. R. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 8277-8281 (1991).
- Heineke, J., Molkentin, J. D. Regulation of cardiac hypertrophy by intracellular signaling pathways. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 7, 589-600 (2006).
- Hartley, C. J., Reddy, A. K., Madala, S., Michael, L. H., Entman, M. L., Taffett, G. E. Doppler estimation of reduced coronary flow reserve in mice with pressure overload cardiac hypertrophy. Ultrasound Med. Biol. 34, 892-901 (2008).
- Reddy, A. K., Taffett, G. E., Li, Y. -H., Lim, S. -W., Pham, T. T., Pocius, J. S., Entman, M. L., Michael, L. H., Hartley, C. J. Doppler signal processing for use in mice: applications. IEEE Trans. Biomed. Eng. 52, 1771-1783 (2005).
- Li, Y. -H., Reddy, A. K., Ochoa, L. N., Pham, T. T., Hartley, C. J., Micheal, L. H., Entman, M. L., Taffett, G. E. Effect of age on peripheral vascular response to transverse aortic banding in mice. J. Gerontol. 58A, 895-899 (2003).
- Bourajjaj, M., Armand, A. S., Martins, daC. osta, Weijts, P. A., Nagel, B. V. ander, Heeneman, R., Wehrens, S., Windt, X. H. D. e, J, L. NFATc2 is a necessary mediator of calcineurin-dependent cardiac hypertrophy and heart failure. J. Biol. Chem. 28, 22295-22303 (2008).
- Oort, R. J. van, Respress, J. L., Li, N., Reynolds, C., Almeida, A. C. D. e, Skapura, D. G., Windt, L. J. D. e, Wehrens, X. H. Accelerated development of pressure overload induced cardiac hypertrophy and dysfunction in an RyR2-R176Q knockin mouse model. Hypertension. 55, (2010).
- Tarnavski, O., McMullen, J. R., Schinke, M., Nie, Q., Kong, S., Izumo, S. Mouse cardiac surgery: comprehensive techniques for the generation of mouse models of human diseases and their application for genomic studies. Physiol Genomics. 16, 349-360 (2004).
