Summary
Мы описываем технику для маркировки и отслеживания стволовых клеток с FDA, одобрено, суперпарамагнитных оксида железа (Спио), ferumoxytol (Feraheme). Этот клеточный метод визуализации, который использует магнитного резонанса (МР) изображений для визуализации, легко доступных для долгосрочного мониторинга и диагностики успешной или неудачной стволовых клеток engraftments у пациентов.
Protocol
1. День 1
1) клетки пластины
- Пластина hMSC в колбе T75 на слияния 80% по крайней мере 18-24 часов до маркировки. См. Таблицу 1 для обучения в альтернативных судов.
2. День 2
2) Подготовить маркировки решение. Этот препарат будет этикетке одного (1) T75 колбу на 80% слияния с концентрацией 400 мкг Fe / мл. См. Таблицу 1 для обучения в альтернативных судов.
- Создать решение (решение 1) путем смешивания 1 мл сыворотки среде и 93,1 мкл ferumoxytol (складе: 30 мг / мл) в 15 мл коническую трубку.
- Создайте второе решение (решение 2) путем смешивания 1 мл сыворотки среде и 7 мкл протамина сульфат (складе: 10 мг / мл) в 15 мл второй конической трубе.
- Разрешить каждого решения, чтобы отдохнуть в течение 5 минут.
- Добавить решения 1 и 2 вместе. Аккуратно перемешайте новое решение этикеток. Разрешить решение, чтобы отдохнуть в течение 5 минут, чтобы позволить USPIO-проtamine комплексов сульфата форме.
- Добавьте 5 мл сыворотки среде в смешанном 2 мл Спио / протамин сульфат раствор для окончательного объемом 7 мл.
3) подготовить клеток для маркировки
- Аспирируйте средств массовой информации из клеток.
- Осторожно промыть клетки сразу с 2-3 мл подогретого Mg / Ca без D-PBS или сыворотки среде, чтобы ополоснуть от остаточной сывороточных белков и других компонентов, или средства массовой информации, которые могут ухудшить отличие поглощение агента и маркировка эффективности. Аспирацию из промыть жидкостью.
4) клетки этикетки
- Добавить полная 7 мл маркировки решение клеток.
- Место клеток в инкубаторе (37 ° C / 5% СО 2) и позволяют клеткам для инкубации в маркировке решение в течение 4 часов.
- Добавить 700 мкл FCS для маркировки решение клетки для достижения окончательного концентрацию в крови на 10%. Сыворотка добавляется для восстановления обогащенного среде которой клетки привыкли, и для оказания помощи в миnimizing гибели клеток, которые могут возникнуть в результате резкого перехода к 24-часовой экспозиции в бессывороточной среде.
- Разрешить клетки инкубировать с маркировки решение для дополнительных 20 часов.
3. День 3
5) Подготовка меченых клеток
- Аспирируйте маркировки решение из клеток.
- Аккуратно промойте клетки с 2-3 мл подогретого Mg / Ca без D-PBS. Аспирацию из PBS. Важно использовать Mg / Ca без PBS, как Mg и Са будет снизить эффективность трипсина в следующем шаге.
- Добавить 2 мл подогретого 0,05% трипсина в клетки и наклона фляжку, чтобы обеспечить всю поверхность колбы покрыта тонким слоем трипсина. Место клеток в инкубаторе (37 ° C / 5% СО 2) и позволяют клеткам, чтобы отдохнуть в течение 5-7 минут или пока клетки начинают отделяться от пластины. Это может быть необходимо для подтверждения отряд под микроскопом. Аккуратно нажмите стороны колбы, если необходимо фаcilitate клеточной поверхности отряда.
- Добавить 4 мл подогретого полный СМИ в колбу для нейтрализации трипсина. Аккуратно промойте колбу с помощью пипетки Трипсин / СМИ / элемент решение вверх и вниз несколько раз. Соберите весь раствор в 15 мл коническую трубку. Центрифуга клетка решение при 400 RCF течение 5 минут.
- Тщательно аспирата супернатант, не нарушая клеточный осадок. Ресуспендируют клеток в 5 мл среды (сыворотки, содержащей или не содержащей сыворотки). Центрифуга клетка решение при 400 RCF течение 5 минут.
- Повторите ячейки мыть, описанных в пункте 5.5. В общей сложности, клетки будут промыть три раза, чтобы удалить остатки, свободного агента контраста в средствах массовой информации и на поверхности клеток.
- Граф клетки в этот момент для достижения наиболее точного подсчета клеток, а клетки будут потеряны во время предыдущей стирки. Выполните проверку жизнеспособности клеток. Клетки готовы для последующего анализа и или пробное нанесение. МРТ может быть выполнена с T1-ю и T2-ю параметрами, потому что, хотя ferumoxytol является Т2-ю контрастное вещество, ferumoxytol также экспонаты T1 эффектов. Представитель T2-ю МРТ параметров, которые могут быть использованы для изображения ferumoxytol меченых клеток включают: FSE или SE_Multislice последовательностей с TR в 2000-2500 мс и TE на 60-80 мс. Для приобретения T1-белого изображения, уменьшение значения TE на FSE или SE_Multislice последовательности или использовать последовательность GRE с высоким и низким TR TE. Рисунок 4 демонстрирует потенциал в естественных условиях применение для помеченных изображений стволовых клеток.
4. Представитель Результаты:
Маркированный клетки демонстрируют значительное потемнение или отрицательный эффект контраста на Т2-взвешенной МРТ и яркости или положительный эффект контраста на T1-взвешенных МРТ (рис. 2). Продольные МРТ и жизнеспособность испытаний, проведенных 5 дней после маркировки не было выявлено значительных сигнала МР и не оказывает значительного влияния на жизнеспособность по сравнению с немеченого управления (данные не представлены).
jove_content "> Маркированный стволовые клетки могут впоследствии быть дифференцированы в различные типы клеток или внутривенно вводят для прижизненного исследования.
Рисунок 1. Схема сроки для маркировки стволовые клетки с наночастицами оксида железа, ferumoxytol.
Рисунок 2. MR изображения сагиттальном сечениях трубы thrrough Эппендорф с ячейками в осадок клеток. ) Немеченого управления. B) Маркированный клетки демонстрируют значительное T2 или отрицательный эффект контрастного вещества на T2-взвешенных FSE или SE_Multislice изображений и T1 или положительный эффект контрастного вещества на Т1-взвешенных последовательностей GRE.
Рисунок 3. Сагиттальный сечения трубы Эппендорф с ячейками в ячейке PELпозволяет. Как ни мало 10000 ferumoxytol меченые клетки могут быть обнаружены с помощью T2-ю МРТ.
Рисунок 4. MR визуализации ferumoxytol меченных стволовые клетки вводили в мышиные желудочков головного мозга. ) Осевой, М. Р. Образ мышиной барин без каких-либо инъекции USPIO меченых стволовых клеток. Б) Осевой, С) корональных и D) сагиттальной МР изображений изображающих T2, негативный эффект контраста USPIO меченных стволовые клетки (белые стрелки) вводили в мышиные мозга.
Таблица 1. Количество адаптация для маркировки клеток в альтернативных судов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Улучшение эффективности engraftments стволовых клеток имеет решающее значение для продвижения регенеративной медицины. Неинвазивной визуализации технику получения стволовых клеток в естественных условиях значительно усиливает нашу способность понимать механизмы, которые приводят к успешным результатам приживления. Магнитные маркировки МР визуализации, такие как процедуры мы продемонстрировали, позволяет в естественных условиях отслеживания стволовых клеток с МРТ. Магнитное меченых стволовых клеток ранее были пересажены в тканях-мишенях и были визуализированы до недели с МРТ 7. Долгосрочные маркировки и продольных изображений стало возможным благодаря лизосомальных хранения наночастиц оксида железа в клетках 8. Проблемы, однако, не соответствуют долгосрочного мониторинга железа меченых клеток. Одна из проблем, связанных с продольными изображений железа меченых клеток является то, что, как здоровых, жизнеспособных клеток размножаться контрастное вещество распределяется daughteГ клеток. Распределение контрастное вещество, чтобы дочерние клетки неравномерно, что приводит к заметное влияние разведения контрастного вещества с течением времени. Вторая проблема связана с долгосрочного мониторинга железа меченых клеток является различие между изначально помечены, жизнеспособных клеток от резидента фагоцитов, таких как макрофаги, которые могут быть выпущены фагоцитированы контрастного вещества из изначально помечены, мертвые клетки 4. Наша группа выявила различия в долгосрочной сигнал кинетики жизнеспособных и апоптозу трансплантации стволовых клеток, которые были помечены наночастиц оксида железа, кроме ferumoxytol 9-11. Будущие исследования необходимы, чтобы определить, являются ли эти принципы применяются также к ferumoxytol меченных трансплантации клеток.
Хотя в данном исследовании потенциальных ferumoxytol эффекты маркировки может выставлять на дифференциации способность стволовых клеток не была рассмотрена, предыдущие исследования показали, доза Спио зависимые влияния на дифференциальныхемкость tiation и Спио дозах, которые не влияют на дифференциацию потенциал, предложив, ferumoxtyol дозы, которые не снижают способность дифференциации стволовых клеток может определяться также 12, 13.
Большой SPIOs (гидродинамический диаметр> 50 нм), которые были применены ранее для целей отслеживания следующую ячейку стволовых клеток маркировки с помощью различных методов маркировки, включая простые инкубации и трансфекции электропорации или трансфекции агентов, таких как протамин, липофектина и поли-L-лизин (PLL) 3 , 13-16., хотя и не всегда необходимо для сотовых маркировки с SPIOs, трансфекции методы для сотовых маркировки оказались полезными для облегчения маркировки и повышения эффективности маркировки 15. SPIOs, которые были использованы для сотовых маркировки, однако, больше не производится в коммерческих целях. Сверхмалых Спио (USPIO, гидродинамический диаметр <50 нм), такие как ferumoxytol, с другой стороны, все еще производятсяно требуют помощи трансфекции агента для достижения эффективного клеточного поглощения 8. Протамина сульфат клинически применимым трансфекции агент, который образует комплексы с USPIOs для облегчения фагоцитарной поглощение контрастного вещества стволовыми клетками 17. Сочетание FDA утвержденных протаминсульфат с FDA, утвержденных USPIO, ferumoxytol, обеспечивает потенциал для клинического перевод стволовых клетка методы отслеживания с помощью не по прямому назначению использование этого агента. Следует отметить, что ferumoxytol продемонстрировал отличные характеристики безопасности в клинических испытаниях 18. Прямая визуализация пересаженных клеток с помощью техники, такие как один показали позволит лучше понять факторы, которые способствуют или препятствуют успешной трансплантации стволовых клеток и помогают определить наиболее перспективные методы для клинического применения. С использованием клинически применимым клеточных маркеров и съемочной аппаратуры, этот метод визуализации, в принципе, легко доступныдля пациентов, перенесших трансплантацию стволовых клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все участники этого исследования не дают раскрытия информации.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом Национального института артрита и костно-мышечной и кожных заболеваний: 3R01AR054458-02S2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | Or other base medium for desired stem cell line to be used |
| D-PBS (Ca++, Mg++ free) | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Invitrogen | 25300-120 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
Ferumoxytol (Feraheme) |
AMAG | 59338-0775-01 | |
| Protamine Sulfate | APP Pharmaceuticals | 22930 |
References
- Narsinh, K. H., Plews, J., Wu, J. C. Comparison of human induced pluripotent and embryonic stem cells: fraternal or identical twins? Mol Ther. 19, 635-638 (2011).
- Bulte, J. W. In vivo MRI cell tracking: clinical studies. AJR. Am. J. Roentgenol. 193, 314-325 (2009).
- Henning, T. D., Boddington, S., Daldrup-Link, H. E. Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging. J. Vis. Exp. (13), e685-e685 (2008).
- Tallheden, T., Nannmark, U., Lorentzon, M. In vivo MR imaging of magnetically labeled human embryonic stem cells. Life. Sci. 79, 999-1006 (2006).
- Jung, C. W., Jacobs, P. Physical and chemical properties of superparamagnetic iron oxide MR contrast agents: ferumoxides, ferumoxtran, ferumoxsil. Magn. Reson. Imaging. 13, 661-674 (1995).
- Coyne, D. W. Ferumoxytol for treatment of iron deficiency anemia in patients with chronic kidney disease. Expert. Opin. Pharmacother. 10, 2563-2568 (2009).
- Li, Z., Suzuki, Y., Huang, M. Comparison of reporter gene and iron particle labeling for tracking fate of human embryonic stem cells and differentiated endothelial cells in living subjects. Stem Cells. 26, 864-873 (2008).
- Metz, S., Bonaterra, G., Rudelius, M. Capacity of human monocytes to phagocytose approved iron oxide MR contrast agents in vitro. Eur. Radiol. 14, 1851-1858 (2004).
- Nedopil, A., Klenk, C., Kim, C. MR signal characteristics of viable and apoptotic human mesenchymal stem cells in matrix-associated stem cell implants for treatment of osteoarthritis. Invest. Radiol. 45, 634-640 (2010).
- Kraitchman, D. L., Heldman, A. W., Atalar, E. In vivo magnetic resonance imaging of mesenchymal stem cells in myocardial infarction. Circulation. 107, 2290-2293 (2003).
- Stuckey, D. J., Carr, C. A., Martin-Rendon, E. Iron particles for noninvasive monitoring of bone marrow stromal cell engraftment into, and isolation of viable engrafted donor cells from, the heart. Stem Cells. 24, 1968-1975 (2006).
- Henning, T. D., Sutton, E. J., Kim, A. The influence of ferucarbotran on the chondrogenesis of human mesenchymal stem cells. Contrast. Media. Mol. Imaging. 4, 165-173 (2009).
- Arbab, A. S., Yocum, G. T., Kalish, H. Efficient magnetic cell labeling with protamine sulfate complexed to ferumoxides for cellular MRI. Blood. 104, 1217-1223 (2004).
- Nedopil, A. J., Mandrussow, L. G., Daldrup-Link, H. E. Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects. J. Vis. Exp. (38), e1793-e1793 (2010).
- Arbab, A. S., Yocum, G. T., Wilson, L. B. Comparison of transfection agents in forming complexes with ferumoxides, cell labeling efficiency, and cellular viability. Mol Imaging. 3, 24-32 (2004).
- Babic, M., Horak, D., Trchova, M. Poly(L-lysine)-modified iron oxide nanoparticles for stem cell labeling. Bioconjug Chem. 19, 740-750 (2008).
- Golovko, D. M., T, H. enning, Bauer, J. S. Accelerated stem cell labeling with ferucarbotran and protamine. Eur. Radiol. 20, 640-648 (2010).
- Lu, M., Cohen, M. H., Rieves, D. FDA report: Ferumoxytol for intravenous iron therapy in adult patients with chronic kidney disease. Am. J. Hematol. 85, 315-319 (2010).
