Summary
我々は、FDAに承認された、超常磁性酸化鉄（SPIO）、ferumoxytol（Feraheme）で幹細胞を標識して追跡するためのテクニックを説明します。可視化のために磁気共鳴（MR）イメージングを利用したこの細胞のイメージング技術は、患者の成功または失敗した幹細胞のengraftmentsの長期的な監視と診断のための容易にアクセス可能です。
Abstract
幹細胞ベースの治療は再生医療の分野のための大きな潜在的可能性を提供します。しかし、多くの移植細胞の生体内動態に関する理解されていない。繰り返しin vivoで移植された幹細胞を監視する非侵襲的方法は、研究者が直接幹細胞移植を監視し、成功または失敗した移植の成果を識別できるようになります。
幹細胞の広い範囲は、無数のアプリケーションのために検討され続けている。ヒト胚性腎臓293（HEK293）細胞、ヒト間葉系幹細胞（hMSCの）と人工多能性幹（iPS）細胞：このプロトコルは、3種類の幹細胞集団に焦点を当てています。 HEK 293細胞は、剪断されたアデノウイルス5 DNAとの文化の中で増殖したヒト胚性腎細胞から派生しています。それらが容易に培養されているため、これらの細胞が広く研究に使用されている、急速に増大し、容易にトランスフェクトされています。 hMSCsは、成人の骨髄に見出される。これらの細胞は約多能または細胞の運命の限られた数に分化する能力を維持しながら、n個の未分化細胞として複製される。 hMSCsは、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨、腱、筋肉、及び骨髄間質を含む間葉系組織、の系統に分化することができる。 iPS細胞は、遺伝的遺伝子と胚性幹細胞の定義するプロパティと同様の因子を発現するように変更されている成人の細胞を再プログラムしている。これらの細胞は、彼らがすべての細胞系譜1に分化する能力を持つ多能性の意味です。 hMSCsとiPS細胞の両方は、生体内で組織再生能力を実証している。
一緒に超常磁性酸化鉄（SPIO）ナノ粒子の細胞のラベルの使用による磁気共鳴（MR）イメージングが近くに微細な解剖学的に解決し、幹細胞の生体内追跡のために効果的な証明されている、それより長い血中半減期は、長手方向のイメージングおよび許可する高sensitivitSPIOのMRイメージングで提供される細胞の検出のためのyは2-4ナノ粒子。さらに、SPIOsの使用とMRイメージングは臨床的に変換可能です。 SPIOsはデキストラン、carboxydextranまたは血漿成分からbioreactive鉄のコアを含むように機能する澱粉の表面コートと酸化鉄のコアで構成されています。これらのエージェントは、T2強調MR画像5上の減少信号につながる局所磁場の不均一性を作成します。残念ながら、SPIOsはもはや製造されています。第二世代、超小型SPIOs（USPIO）が、しかし、実行可能な代案を提供します。 Ferumoxytol（FerahemeTM）はポリグルコース、ソルビトールcarboxymethyletherコートに囲まれた非化学量論的マグネタイトのコアからなる1 USPIOです。光散乱によって決定されるferumoxytolのコロイド、粒子サイズは17〜30 nmである。分子量は750 kDaのであり、そして2T MRI分野で一定の緩和度は58.609 MM - 1秒-1強度4です。 Ferumoxytolは最近FDA -承認された腎不全6患者における鉄欠乏の治療のためのsは、鉄のサプリメント。当社グループは、細胞標識のアプリケーションのための"オフラベル"使用されてこのエージェントを適用しています。私たちの技術は、MR画像上で標識された細胞の重要なMR信号の効果につながるferumoxytol持つ幹細胞の効率的なラベリングを示しています。この手法は、前臨床および臨床設定における幹細胞療法の非侵襲的なモニタリングに適用されることがあります。
Protocol
1。日1
1）細胞をプレート
- 少なくとも18-24時間前にラベリング〜80％のコンフルエントでT75フラスコでプレートのhMSCを。代替船のための命令については、表1を参照してください。
2。日2
2）標識溶液を準備します。この準備は、400μgの鉄/ mlの濃度で80％コンフルエントに一つ（1）T75フラスコにラベルを付けます。代替船のための命令については、表1を参照してください。
- 15 mlコニカルチューブに：無血清培地1ml及びferumoxytolの93.1μL（30 mg / mlストック）を混合して溶液（溶液1）を作成します。
- 第二15 mlコニカルチューブに：無血清培地1ml及び硫酸プロタミンの7μlの（10 mg / mlストック）を混合することにより、第二の溶液（溶液2）を作成します。
- 各ソリューションは、5分間休憩することができます。
- 一緒に解決策1と2を追加。ゆっくりと新しい標識溶液を混ぜる。ソリューションは、USPIO - PROを許可するために5分間休息することができますtamine硫酸複合体が形成する。
- SPIO / 7 mlの最終ボリュームのプロタミン硫酸塩溶液との混合2mlに無血清培地5 mlを加える。
3）標識のための細胞を準備する
- 細胞から培地を吸引除去する。
- 静かに造影剤の取り込みと標識効率を損なう可能性の残余血清タンパク質およびまたはその他のメディアコンポーネントを洗うために予め温めておいたのMg / CaのフリーD - PBSまたは無血清培地の2〜3 mlの細胞を1回洗浄する。リンス液を吸引除去する。
4）ラベルの細胞
- 細胞へのソリューションをラベリングの完全な7ミリリットルを追加。
- 場所は、インキュベーターにセル（37℃/ 5％CO 2）と細胞は4時間のラベリング溶液中でインキュベートすることができます。
- 10％の最終的な血清濃度を達成するために細胞のラベリングソリューションにFCS 700μlを添加する。血清は、細胞が慣れているから豊かな環境を再確立するために、そしてマイルを支援するために追加されます。無血清環境に24時間曝露に急激な変化から生じる可能性が細胞死をnimizing。
- 細胞はさらに20時間のラベリングソリューションをインキュベートすることができます。
3。日3
5）標識細胞を準備します。
- 細胞からの標識溶液を吸引除去する。
- 静かに予め温めておいたのMg / CaのフリーD - PBSの2-3 mlの細胞をすすいでください。 PBSを吸引除去する。それは、MgおよびCaは、次の手順でトリプシンの効率が低下する傾向があるとしてMg / CaのフリーPBSを使用することが重要です。
- 細胞に予め温めておいた0.05％トリプシン液2 mlを追加し、フラスコの表面全体を確実にするために前後にフラスコを傾けはトリプシンの薄層で覆われている。インキュベーター（37℃/ 5％CO 2）内のセルを配置し、細胞がプレートからデタッチし始めるまで細胞が5-7分間、または休息することができます。それは、顕微鏡下で剥離を確認する必要があるかもしれません。 FAに必要に応じてゆっくりとフラスコの側面をタップ細胞表面の剥離をcilitate。
- トリプシンを中和するためにフラスコに予め温めておいた完全培地4mlを追加します。ゆっくりと上下に数回をトリプシン/メディア/電池ソリューションをピペッティングすることによりフラスコを洗う。 15 mlコニカルチューブ中で、ソリューション全体を収集する。 5分間で400 RCFにおける細胞溶液を遠心してください。
- 細胞ペレットを乱すことなく上清を注意深く吸引除去する。メディア5mlの（を含む血清または無血清）で細胞を再懸濁します。 5分間で400 RCFにおける細胞溶液を遠心してください。
- ステップ5.5で説明したセルの洗浄を繰り返します。合計では、細胞を培地にし、細胞の表面上に残留、無料の造影剤を除去するために3回リンスする。
- 細胞は、前洗浄中に失われるので、最も正確な細胞数を達成するために、この時点で細胞を数える。細胞の生存率のテストを実行します。セルは、その後の分析とや実験的なアプリケーションのための準備が整いました。 MRイメージングは、T1 - wで実行することができますし、 T2 - wのパラメータは、ferumoxytolはT2 - W造影剤であるがため、ferumoxytolはまた、T1効果を発揮する。画像ferumoxytol標識された細胞に使用できる代表的なT2 - W MRIパラメータが含まれています：FSEまたは2000から2500ミリ秒60〜80ミリ秒のTEのTRとSE_Multisliceシーケンスを。 T1 - Wの画像を取得するには、FSEまたはSE_MultisliceシーケンスのTEの値を下げるか、または高いTRと低TEでのGREシーケンスを使用してください。図4は、標識幹細胞イメージングのためのin vivoでのアプリケーションの可能性を示しています。
4。代表的な結果：
標識された細胞は、T2強調画像で暗くなる重要なまたは負コントラストの効果とT1強調MR画像（図2）上で明るくまたは正のコントラスト効果を示しています。縦MRイメージングと実行可能性のテストは5日間実行されるポストラベリングは、有意なMR信号と未標識コントロール（データは示さず）に比べて生存率に有意な影響は示されなかった。
jove_content">標識幹細胞は、その後、種々の細胞型に分化させるまたは静脈内in vivoでの調査でのために注入することができます。
図1酸化鉄ナノ粒子、ferumoxytolで幹細胞を標識するための回路図のタイムライン。
図2。細胞ペレット中の細胞と矢状断面thrroughエッペンドルフチューブのMR画像。 A）非標識のコントロールが。 B）標識された細胞は、T2強調FSEまたはSE_MultisliceイメージングとT1強調GREシーケンスのT1または正の造影剤の効果に重大なT2または負の造影剤の効果を発揮。
図3。細胞のPELの細胞とのエッペンドルフチューブの矢状断面ことができます。わずか1万人のferumoxytol標識された細胞は、T2 - W MRイメージングを介して検出することができます。
図4。ネズミの脳室に注入ferumoxytol標識幹細胞のMRの可視化。 A）軸、USPIO標識幹細胞の注入なしでマウスバリンのMR画像。 B）冠状軸、C）、およびD）矢状MR画像は、マウス脳内に注入されたUSPIOで標識された幹細胞（白矢印）のT2、否定的なコントラストの効果を描いた。
別の容器に細胞を標識する表1。数量adaptions。
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Discussion
幹細胞のengraftmentsの有効性を改善することは再生医療の進歩にとって重要です。 in vivoで幹細胞の非侵襲可視化技術は大幅に生着の成功の成果につながるメカニズムを理解する当社の能力を高める。このような我々が実証された手順としてMRの可視化のための磁気標識は、MRイメージングと幹細胞の in vivo追跡にできます。磁気標識された幹細胞は、以前に標的組織に移植されており、MRイメージング7で週間まで可視化されています。長期的なラベリングと長手方向のイメージングは、細胞が8内の酸化鉄ナノ粒子のリソソーム蓄積に起因することが可能です。課題は、しかしながら、鉄標識細胞の長期的なモニタリングに対応していない。鉄標識された細胞の長手方向のイメージングに関連付けられている1つの課題は、健康、生細胞は、造影剤がdaughteに配布されて増殖することです。R細胞。娘細胞への造影剤の分布が不均一であり、時間の経過とともに造影剤の著しい希釈効果の結果。鉄標識された細胞の長期的な監視に関連付けられている第二の課題は、もともと標識された、死細胞から放出された造影剤4貪食している場合がありますマクロファージなどの居住者食細胞からもともとラベルが付いた、生細胞、、区別している。当社グループは、ferumoxytol 9月11日以外の酸化鉄ナノ粒子で標識されていた生存とアポトーシス、幹細胞移植の長期的なシグナルの動態の違いを特定している。今後の研究がこれらの原則はまた、ferumoxytol標識細胞移植に適用されるかどうかを判断する必要があります。
本研究では潜在的な影響ferumoxytolのラベリングは、幹細胞の分化能を示すこともできますが検証されていない、以前の研究ではSPIO投与量の差に依存する効果を実証している、幹細胞の分化能を損なわないferumoxtyol用量を示唆し、分化能を阻害しないtiationの容量とSPIOの用量は、12、13を決定することができます。
大SPIOs（流体力学的直径> 50 nm）のような、プロタミンリポフェクチンおよびポリ- L -リジン（PLL）3などのエレクトロポレーションまたはトランスフェクションエージェントとの簡単なインキュベーションとトランスフェクションを含む様々な標識技術を介して幹細胞のラベリング後の細胞の追跡の目的で以前に適用されている、13-16。、SPIOsによる細胞標識のため必ずしも必要ではないが、細胞標識のためのトランスフェクション法は、標識および増加標識効率15を容易にするための有益証明されている。細胞標識のために使用されているSPIOsは、しかしながら、商業的な理由により生産されなくなります。一方、このようなferumoxytolのような超小型SPIO（USPIO、流体力学的直径<50 nm）は、まだ生産されているしかし、トランスフェクション剤の援助が効率的に細胞内への取り込み8を達成するために必要です。硫酸プロタミンは17幹細胞による造影剤の貪食取り込みを容易にするためにUSPIOsと複合体を形成する臨床的に適用されるトランスフェクション剤です。の組み合わせFDA承認、FDA承認USPIO、ferumoxytolに硫酸プロタミンを幹細胞追跡技術のこの薬剤の適応外使用を介して臨床解釈の可能性を提供します。注目すべきは、ferumoxytolは、臨床試験18に優れた安全性プロファイルを示しました。このような実証一つとして技術を介して移植された細胞の直接可視化が促進または阻害する成功した幹細胞移植を臨床応用するための最も有望な技術を特定するのに役立つ要因のより良い理解のためにできるようになります。臨床的に適用可能な細胞マーカーおよびイメージング機器の使用によって、このイメージング技術は、原理的に容易にアクセス可能です。幹細胞移植を受ける患者へ。
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Disclosures
この研究への全貢献者には開示を提供していません。
Acknowledgments
3R01AR054458 - 02S2：この作品は、関節炎、筋骨格系の国立研究所と皮膚疾患からの助成金によって支えられて。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | Or other base medium for desired stem cell line to be used |
| D-PBS (Ca++, Mg++ free) | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Invitrogen | 25300-120 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
Ferumoxytol (Feraheme) |
AMAG | 59338-0775-01 | |
| Protamine Sulfate | APP Pharmaceuticals | 22930 |
References
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