Summary
Vi beskriver en teknik til mærkning og sporing af stamceller med FDA-godkendt, superparamagnetiske jernoxid (SPIO), ferumoxytol (Feraheme). Denne cellulære imaging teknik, der anvender magnetisk resonans (MR) billeddannelse til visualisering, er let tilgængelige for langsigtet overvågning og diagnosticering af vellykkede eller mislykkede stamcelle engraftments hos patienter.
Abstract
Stem cellebaserede behandlingsformer giver betydelige muligheder for inden for regenerativ medicin. Er dog stadig meget at blive forstået i forbindelse med in vivo-kinetik af transplanterede celler. En ikke-invasiv metode til gentagne gange at overvåge transplanterede stamceller in vivo ville give efterforskerne til direkte at overvåge stamcelle transplantationer og finde frem til vellykkede eller mislykkede engraftment resultater.
En bred vifte af stamceller fortsat undersøges for utallige applikationer. Denne protokol fokuserer på 3 forskellige stamceller populationer: humane embryonale nyre 293 (HEK293) celler, menneskelige mesenchymale stamceller (hMSC) og induceret pluripotente stamceller (iPS-celler). HEK 293 celler fra humane embryonale nyre celler dyrket i kultur med klippet adenovirus 5 DNA. Disse celler er meget udbredt i forskning, fordi de nemt dyrkes, vokser hurtigt og er let transfekteret. hMSCs findes i voksen marv. Disse celler CAn blive gentaget som udifferentierede celler, og samtidig opretholde multipotency eller potentiale til at differentiere sig til et begrænset antal celle skæbner. hMSCs kan differentiere til slægter af mesenchymale væv, herunder osteoblaster, adipocytter, chondrocytter, sener, muskler, og marv stroma. iPS celler er genetisk omprogrammering voksne celler, der er blevet ændret for at udtrykke gener og faktorer, der svarer til at definere egenskaber af embryonale stamceller. Disse celler er pluripotente betyder at de har kapacitet til at differentiere sig til alle celle slægter 1. Både hMSCs og iPS celler har demonstreret væv regenerationsevne in vivo.
Magnetisk resonans (MR) billeddannelse sammen med brugen af superparamagnetiske jernoxid (SPIO) nanopartikel celle etiketter har vist sig effektive til in vivo sporing af stamceller på grund af den nærmeste mikroskopiske anatomiske opløsning, en længere blodets halveringstid, som tillader langsgående billedbehandling og høj sensitivity for celle detektion leveret af MR billeddannelse af SPIO nanopartikler 2-4. Derudover er MR-scanning med brug af SPIOs klinisk oversættes. SPIOs er sammensat af et jernoxid kerne med en dextran, carboxydextran eller stivelse overflade pels, der tjener til at indeholde bioreactive jernkerne fra plasma komponenter. Disse agenter skaber lokale magnetfelt uensartetheder, der fører til en nedsat signal på T2-vægtede MR-billeder 5. Desværre er SPIOs ikke længere produceres. Anden generation, ultrasmå SPIOs (USPIO), dog give et levedygtigt alternativ. Ferumoxytol (FerahemeTM) er en USPIO består af en ikke-støkiometrisk magnetit kerne omgivet af en Polyglukose sorbitol carboxymethylether pels. De kolloide, kornstørrelse ferumoxytol er 17-30 nm, som bestemt ved lysspredning. Den molekylvægt er 750 kDa, og relaksivitet konstant på 2T MR felt er 58,609 mM-1 sec-1 styrke 4. Ferumoxytol blev for nylig FDA-godkendt ets en jern supplement til behandling af jernmangel hos patienter med nyresvigt 6. Vores gruppe har anvendt denne agent på en "off label" brug for celle mærkning applikationer. Vores teknik demonstrerer effektiv mærkning af stamceller med ferumoxytol, der fører til betydelige MR-signalet effekter af mærkede celler på MR-billeder. Denne teknik kan anvendes til ikke-invasiv monitorering af stamceller i præ-kliniske og kliniske omgivelser.
Protocol
1. Dag 1
1) Plate celler
- Plate hMSC i en T75 kolben på en confluency på 80% i mindst 18-24 timer før mærkning. Se Tabel 1 for instruktion for alternative fartøjer.
2. Dag 2
2) Forbered mærkning løsning. Denne forberedelse vil mærke en (1) T75 kolben på 80% confluency med en koncentration på 400 mg Fe / ml. Se Tabel 1 for instruktion for alternative fartøjer.
- Opret en løsning (løsning 1) ved at blande 1 ml serum-frie medier og 93,1 μl af ferumoxytol (lager: 30 mg / ml) i en 15 ml konisk rør.
- Opret en anden løsning (løsning 2) ved at blande 1 ml serum-frie medier og 7 μl af protamin sulfat (lager: 10 mg / ml) i et andet 15 ml koniske rør.
- Lad hver enkelt løsning til hvile i 5 minutter.
- Tilsæt løsninger 1 og 2 sammen. Bland forsigtigt den nye mærkning løsning. Lad opløsningen hvile i 5 minutter for at tage USPIO-protamine sulfat komplekser til at danne.
- Tilsæt 5 ml serum-frie medier til de blandede 2 ml SPIO / protamin sulfat løsning til et endeligt volumen på 7 ml.
3) Forbered celler til mærkning
- Aspirer mediet fra cellerne.
- Vask forsigtigt celler gang med 2-3 ml forvarmet Mg / Ca-fri D-PBS eller serum-frie medier at skylle væk resterende serumproteiner og eller andre medier komponenter, der kan forringe kontraststof optagelse og mærkning effektivitet. Aspirer ud skylles væske.
4) mærkning af celler
- Tilsæt hele 7 ml mærkning løsning celler.
- Placer celler i en inkubator (37 ° C / 5% CO 2) og gøre det muligt for cellerne at udruge i mærkningen løsning til 4 timer.
- Tilsæt 700 μl af FCS om mærkning løsningen af cellerne for at opnå en endelig serum koncentration på 10%. Serum tilføjes at genetablere den berigede miljø, som cellerne er vant til, og hjælpe med minimizing celledød, der kan følge af et pludseligt skift til 24 timers eksponering til en serum-frit miljø.
- Lad cellerne inkuberes med mærkningen løsning for en yderligere 20 timer.
3. Dag 3
5) Forbered mærkede celler
- Aspirer mærkning løsning fra celler.
- Forsigtigt skylles celler med 2-3 ml forvarmet Mg / Ca-fri D-PBS. Aspirer ud PBS. Det er vigtigt at bruge Mg / Ca-fri PBS som Mg og Ca vil forringe effektiviteten af trypsin i næste trin.
- Tilsæt 2 ml forvarmet 0,05% trypsin til cellerne og vippe kolben frem og tilbage for at sikre, at hele overfladen af kolben er dækket med et tyndt lag af trypsin. Placer celler i en inkubator (37 ° C / 5% CO 2) og giver cellerne til at hvile i 5-7 minutter, eller indtil celler begynder at løsnes fra pladen. Det kan være nødvendigt at bekræfte løsrivelse under et mikroskop. Bank forsigtigt på siderne af kolben hvis det er nødvendigt for at facilitate celle-overflade udstationering.
- Tilsæt 4 ml forvarmet fuldstændige medium til kolben for at neutralisere trypsin. Forsigtigt skylle kolben ved pipettering af trypsin / media / celle løsning op og ned flere gange. Saml hele løsningen i en 15 ml konisk rør. Centrifugér cellen løsning ved 400 RCF i 5 minutter.
- Forsigtigt aspirer supernatanten uden at forstyrre cellepelleten. Cellerne i 5 ml medier (serum indeholder eller serum-fri). Centrifugér cellen løsning ved 400 RCF i 5 minutter.
- Gentag celle vask, der er beskrevet i trin 5.5. I alt vil celler skylles tre gange for at fjerne resterende, gratis kontrastmiddel i medier og på overfladen af celler.
- Grev celler på dette punkt for at opnå den mest præcise celletal, som celler vil gå tabt i løbet af de foregående vask. Udfør en levedygtighed test af celler. Cellerne er nu klar til efterfølgende analyse og eller eksperimentel anvendelse. MR-scanning kan udføres med T1-w og T2-w parametre, for selvom ferumoxytol er en T2-w kontrastmiddel, ferumoxytol også udstiller T1 effekter. Repræsentant T2-w MR parametre, der kan bruges til billede ferumoxytol mærkede celler omfatter: FSE eller SE_Multislice sekvenser med en TR på 2000-2500 ms og en TE på 60-80 ms. At erhverve en T1-w image, mindske TE værdi på en FSE eller SE_Multislice sekvens eller bruge en GRE sekvens med en høj TR og lav TE. Figur 4 viser et potentiale in vivo ansøgning for mærkede stamceller billeddannelse.
4. Repræsentative resultater:
Mærkede celler har påvist en betydelig mørkere eller negativ kontrast effekt på T2-vægtede MR-billeder og en lysere eller positiv kontrast effekt på T1-vægtede MR-billeder (Figur 2). Langsgående MR billeddannelse og levedygtighed afprøvninger 5 dage efter mærkning viste ingen signifikant MR-signal, og ingen væsentlig indvirkning på bæredygtighed i forhold til umærket kontrol (data ikke vist).
jove_content "> Labeled stamceller derefter kan differentieres til forskellige celletyper eller intravenøst injiceret for in vivo-undersøgelse.
Figur 1. Skematisk tidsfrist for mærkning af stamceller med jernoxid nanopartikler, ferumoxytol.
Figur 2. MR-billeder af sagittal tværsnit thrrough Eppendorf rør med celler i en pelleteret celle. A) uden etiketter kontroller. B) Mærket celler viser en signifikant T2 eller negativt kontraststof effekt på T2-vægtet FSE eller SE_Multislice billedbehandling og en T1 eller positiv kontraststof effekt på T1-vægtet GRE sekvens.
Figur 3. Sagittal tværsnit af Eppendorf rør med celler i celle PELlader. Så lidt som 10.000 ferumoxytol mærkede celler kan opdages via T2-w MR billeddannelse.
Figur 4. MR visualisering af ferumoxytol-mærket stamceller sprøjtes ind murin cerebrale ventrikler. A) Axial, MR billede af murine Barin uden injektion af USPIO-mærket stamceller. B) Axial, C) koronal, og D) sagittal MR-billeder skildrer T2, negativ kontrast effekt af USPIO-mærket stamceller (hvide pile) indsprøjtes i en murine hjerne.
Tabel 1. Mængde tilpasninger for mærkning af celler i alternative fartøjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forbedring af effektiviteten af stamceller engraftments er afgørende for fremme af regenerativ medicin. En ikke-invasiv visualisering teknik til stamceller in vivo markant forbedrer vores evne til at forstå mekanismer, der fører til vellykket transplantation resultater. Magnetisk mærkning for MR visualisering, som den procedure, vi har vist, giver in vivo sporing af stamceller med MR scanning. Magnetisk mærkede stamceller tidligere er blevet transplanteret ind i målvæv og er blevet visualiseret op til flere uger med MR billeddannelse 7. Langsigtede mærkning og langsgående billedbehandling er muligt på grund af lysosomale af jernoxid nanopartikler i cellerne 8. Udfordringer, dog ikke stemmer overens med langsigtet overvågning af jern mærkede celler. En af udfordringerne forbundet med langsgående billeddannelse af jern mærkede celler er, at så sunde, levedygtige celler formere kontrastmidlet er distribueret til daughter celler. Fordeling af kontrastmidlet til datterceller er ujævn, og resulterer i en markant udvandingseffekt af kontrastmidlet over tid. En anden udfordring i forbindelse med langvarig overvågning af jern mærkede celler differentiere mellem oprindeligt mærket, levedygtige celler fra hjemmehørende fagocytter, såsom makrofager, der kan have fagocyteret frigivet kontraststof fra oprindeligt mærkede, døde celler 4. Vores gruppe har identificeret forskelle i de lange signal kinetik af levedygtige og apoptotiske stamcelle transplantationer, som var blevet mærket med jernoxid nanopartikler, bortset ferumoxytol 9-11. Fremtidige undersøgelser er nødvendige for at afgøre, om disse principper også gælder for ferumoxytol-mærket celle transplantationer.
Mens der i denne undersøgelse de potentielle virkninger ferumoxytol mærkning kunne udstille på differentiering kapacitet af stamceller er ikke undersøgt, har tidligere studier vist en SPIO dosisafhængig effekt på differentiation kapacitet og SPIO doser, der ikke forringer differentiering potentiale, hvilket tyder på, et ferumoxtyol dosis, der ikke forringer differentieringen kapacitet stamceller kan også bestemmes 12, 13.
Stor SPIOs (hydrodynamisk diameter> 50 nm) har været anvendt for celle sporing efter stamcelletransplantation mærkning via forskellige mærkning af teknikker, herunder simple inkubation og transfektion med elektroporation eller transfektion midler som protamin, lipofectin og poly-L-lysin (PLL) 3 , 13-16., Selvom det ikke altid nødvendigt for celle mærkning med SPIOs, transfektion metoder til celle-mærkning har vist sig gavnlig for at lette mærkning og øge mærkning effektivitet 15. SPIOs der har været brugt til celle-mærkning, er dog ikke længere produceres af kommercielle grunde. Ultrasmå SPIO (USPIO, hydrodynamisk diameter <50 nm) såsom ferumoxytol, er på den anden side stadig produceresmen kræver hjælp fra en transfektion agent til at opnå en effektiv cellulære optagelse 8. Protamin sulfat er en klinisk relevant transfektion agent, som danner komplekser med USPIOs at lette fagocyterende optagelse af kontrastmidlet af stamceller 17. Kombinationen af FDA-godkendt protaminsulfat sulfat med FDA-godkendte USPIO, ferumoxytol, giver mulighed for kliniske oversættelse af stamceller teknikker til sporing via off-label brug af denne agent. Det skal bemærkes, har ferumoxytol demonstreret en fremragende sikkerhedsprofil i kliniske forsøg 18. Direkte visualisering af de transplanterede celler ved hjælp af en teknik som den påviste man ville give mulighed for en bedre forståelse af de faktorer, der fremmer eller hæmmer en vellykket stamcelle transplantationer og hjælpe med at identificere de mest lovende teknikker til kliniske anvendelser. Med brugen af klinisk relevant cellemarkører og imaging udstyr, er denne imaging teknik i princippet, lettilgængeligtil patienter, der gennemgår stamcelle transplantationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle bidragydere til denne undersøgelse giver ingen oplysninger.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra National Institute of Arthritis og bevægeapparatet og hudsygdomme: 3R01AR054458-02S2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | Or other base medium for desired stem cell line to be used |
| D-PBS (Ca++, Mg++ free) | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Invitrogen | 25300-120 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
Ferumoxytol (Feraheme) |
AMAG | 59338-0775-01 | |
| Protamine Sulfate | APP Pharmaceuticals | 22930 |
References
- Narsinh, K. H., Plews, J., Wu, J. C. Comparison of human induced pluripotent and embryonic stem cells: fraternal or identical twins? Mol Ther. 19, 635-638 (2011).
- Bulte, J. W. In vivo MRI cell tracking: clinical studies. AJR. Am. J. Roentgenol. 193, 314-325 (2009).
- Henning, T. D., Boddington, S., Daldrup-Link, H. E. Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging. J. Vis. Exp. (13), e685-e685 (2008).
- Tallheden, T., Nannmark, U., Lorentzon, M. In vivo MR imaging of magnetically labeled human embryonic stem cells. Life. Sci. 79, 999-1006 (2006).
- Jung, C. W., Jacobs, P. Physical and chemical properties of superparamagnetic iron oxide MR contrast agents: ferumoxides, ferumoxtran, ferumoxsil. Magn. Reson. Imaging. 13, 661-674 (1995).
- Coyne, D. W. Ferumoxytol for treatment of iron deficiency anemia in patients with chronic kidney disease. Expert. Opin. Pharmacother. 10, 2563-2568 (2009).
- Li, Z., Suzuki, Y., Huang, M. Comparison of reporter gene and iron particle labeling for tracking fate of human embryonic stem cells and differentiated endothelial cells in living subjects. Stem Cells. 26, 864-873 (2008).
- Metz, S., Bonaterra, G., Rudelius, M. Capacity of human monocytes to phagocytose approved iron oxide MR contrast agents in vitro. Eur. Radiol. 14, 1851-1858 (2004).
- Nedopil, A., Klenk, C., Kim, C. MR signal characteristics of viable and apoptotic human mesenchymal stem cells in matrix-associated stem cell implants for treatment of osteoarthritis. Invest. Radiol. 45, 634-640 (2010).
- Kraitchman, D. L., Heldman, A. W., Atalar, E. In vivo magnetic resonance imaging of mesenchymal stem cells in myocardial infarction. Circulation. 107, 2290-2293 (2003).
- Stuckey, D. J., Carr, C. A., Martin-Rendon, E. Iron particles for noninvasive monitoring of bone marrow stromal cell engraftment into, and isolation of viable engrafted donor cells from, the heart. Stem Cells. 24, 1968-1975 (2006).
- Henning, T. D., Sutton, E. J., Kim, A. The influence of ferucarbotran on the chondrogenesis of human mesenchymal stem cells. Contrast. Media. Mol. Imaging. 4, 165-173 (2009).
- Arbab, A. S., Yocum, G. T., Kalish, H. Efficient magnetic cell labeling with protamine sulfate complexed to ferumoxides for cellular MRI. Blood. 104, 1217-1223 (2004).
- Nedopil, A. J., Mandrussow, L. G., Daldrup-Link, H. E. Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects. J. Vis. Exp. (38), e1793-e1793 (2010).
- Arbab, A. S., Yocum, G. T., Wilson, L. B. Comparison of transfection agents in forming complexes with ferumoxides, cell labeling efficiency, and cellular viability. Mol Imaging. 3, 24-32 (2004).
- Babic, M., Horak, D., Trchova, M. Poly(L-lysine)-modified iron oxide nanoparticles for stem cell labeling. Bioconjug Chem. 19, 740-750 (2008).
- Golovko, D. M., T, H. enning, Bauer, J. S. Accelerated stem cell labeling with ferucarbotran and protamine. Eur. Radiol. 20, 640-648 (2010).
- Lu, M., Cohen, M. H., Rieves, D. FDA report: Ferumoxytol for intravenous iron therapy in adult patients with chronic kidney disease. Am. J. Hematol. 85, 315-319 (2010).
