Summary
Abbiamo descritto una tecnica per l'etichettatura e tracciabilità delle cellule staminali con la FDA ha approvato, superparamagnetiche ossido di ferro (SPIO), ferumoxytol (Feraheme). Questa tecnica di imaging cellulare che utilizza la risonanza magnetica (RM) per la visualizzazione, è facilmente accessibile per monitoraggio a lungo termine e la diagnosi di engraftments staminali successo o insuccesso delle cellule nei pazienti.
Abstract
Terapie basate sulle cellule staminali offrono un potenziale significativo per il settore della medicina rigenerativa. Tuttavia, molto resta ancora da capire per quanto riguarda la cinetica in vivo di cellule trapiantate. Un metodo non invasivo per monitorare ripetutamente le cellule staminali trapiantate in vivo avrebbe permesso agli investigatori di monitorare direttamente i trapianti di cellule staminali e di individuare gli esiti attecchimento di successo o insuccesso.
Una vasta gamma di cellule staminali continua ad essere indagato per innumerevoli applicazioni. Questo protocollo si concentra su tre diverse popolazioni di cellule staminali: embrionali umane del rene 293 (HEK293), le cellule, cellule staminali mesenchimali (hMSC) e staminali pluripotenti indotte (iPS), cellule. HEK 293 cellule derivano da cellule embrionali renali in coltura con tranciati adenovirus 5 del DNA. Queste cellule sono ampiamente utilizzati nella ricerca perché sono facilmente colta, crescono velocemente e sono facilmente transfettate. hMSCs si trovano nel midollo adulti. Queste cellule can essere replicate come cellule indifferenziate, mantenendo multipotenza o la potenzialità di differenziarsi in un numero limitato di destini delle cellule. hMSCs possono differenziare a lignaggi dei tessuti mesenchimali, tra cui gli osteoblasti, adipociti, condrociti, tendini, muscoli e stroma del midollo. le cellule iPS sono geneticamente cellule adulte riprogrammate che sono stati modificati per esprimere geni e fattori simili a definire le proprietà delle cellule staminali embrionali. Queste cellule sono pluripotenti senso che hanno la capacità di differenziarsi in tutte le linee cellulari 1. Sia hMSCs e le cellule iPS hanno dimostrato la capacità di rigenerazione dei tessuti in vivo.
Risonanza magnetica (RM) con l'uso di etichette superparamagnetiche nanoparticelle di ossido di ferro (SPIO) delle cellule si sono dimostrati efficaci per il monitoraggio in vivo di cellule staminali a causa della risoluzione anatomica microscopica vicino, un sangue più lunga emivita che permette l'imaging longitudinale e la alto sensitivity per il rilevamento delle cellule forniti da RM di SPIO nanoparticelle 2-4. Inoltre, la RM con l'uso di SPIOs è clinicamente traducibile. SPIOs sono composti da un nucleo di ossido di ferro con uno strato superficiale destrano, carboxydextran o amido che serve per contenere il nocciolo bioreactive ferro da componenti del plasma. Questi agenti creare disomogeneità locali del campo magnetico che portano ad una diminuzione del segnale in immagini T2-pesate RM 5. Purtroppo, SPIOs non vengono più prodotte. Seconda generazione, ultrasmall SPIOs (USPIO), tuttavia, offrono una valida alternativa. Ferumoxytol (FerahemeTM) è uno USPIO composto da un non-stechiometrico magnetite nucleo circondato da un mantello polyglucose carboxymethylether sorbitolo. Il colloidale, dimensione delle particelle di 17-30 nm ferumoxytol è determinato dal dispersione della luce. Il peso molecolare è di 750 kDa, e il relassività costante a campo 2T MRI è 58,609 MM-1 sec-1 forza 4. Ferumoxytol è stato recentemente dalla FDA ha approvato uns un integratore di ferro per il trattamento della carenza di ferro nei pazienti con insufficienza renale 6. Il nostro gruppo ha applicato questo agente in un "off label" l'uso per applicazioni di etichettatura delle cellule. La nostra tecnica dimostra efficace di etichettatura di cellule staminali con ferumoxytol che porta a significativi effetti segnale RM di cellule etichettate sulle immagini MR. Questa tecnica può essere applicata per monitoraggio non invasivo di terapie con cellule staminali in ambito pre-clinico e clinico.
Protocol
1. Giorno 1
1) Piastra cellule
- HMSC piastra in un pallone T75 ad una confluenza del 80% almeno 18-24 ore prima dell'etichettatura. Fare riferimento alla Tabella 1 per le istruzioni per le navi alternativo.
2. Giorno 2
2) Preparare la soluzione di etichettatura. Questa preparazione si etichetta un (1) T75 fiasco al 80% confluenza con una concentrazione di 400 mg Fe / ml. Fare riferimento alla Tabella 1 per le istruzioni per le navi alternativo.
- Creare una soluzione (soluzione 1) mescolando 1 ml di siero-free media e 93,1 l di ferumoxytol (magazzino: 30 mg / ml) in un tubo da 15 ml.
- Creare una seconda soluzione (soluzione 2) mescolando 1 ml di siero privo di mezzi di comunicazione e 7 ml di solfato di protamina (magazzino: 10 mg / ml) in un secondo tubo di 15 ml.
- Consentire ad ogni soluzione a riposare per 5 minuti.
- Aggiungere le soluzioni 1 e 2 insieme. Mescolare delicatamente la nuova soluzione di etichettatura. Lasciare che la soluzione a riposare per 5 minuti per consentire USPIO-procomplessi solfato di istamina a formare.
- Aggiungere 5 ml di siero-multimediale gratuito al misto 2 ml di SPIO / soluzione di solfato di protamina per un volume finale di 7 ml.
3) Preparare le cellule per l'etichettatura
- Aspirare i media dalle cellule.
- Lavare delicatamente le cellule una volta con 2-3 ml di pre-riscaldato Mg / Ca-free D-PBS o senza siero media per lavare via residuale le proteine del siero e dei media o altri componenti che potrebbero mettere in pericolo agente di assorbimento di contrasto e di efficienza etichettatura. Aspirare il liquido di risciacquo.
4) Etichetta cellule
- Aggiungere il completo 7 ml di soluzione di etichettatura per le cellule.
- Cellule posto in un incubatore (37 ° C / 5% di CO 2) e permettono alle cellule di incubare nella soluzione di etichettatura per 4 ore.
- Aggiungere 700 ml di FCS alla soluzione di etichettatura delle cellule per ottenere una concentrazione finale del siero del 10%. Siero viene aggiunto a ristabilire l'ambiente arricchito di cui sono abituati le cellule, e per assistere in minimizing morte delle cellule che potrebbe derivare da un brusco passaggio a 24 ore di esposizione ad un ambiente privo di siero.
- Permettono alle cellule di incubare con la soluzione di etichettatura per altre 20 ore.
3. 3 ° giorno
5) Preparare le cellule etichettate
- Aspirare la soluzione di etichettatura da parte delle cellule.
- Lavare delicatamente le cellule con 2-3 ml di pre-riscaldato Mg / Ca-free D-PBS. Aspirare il PBS. E 'importante utilizzare Mg / Ca-free PBS come Mg e Ca potrebbe compromettere l'efficienza della tripsina nella fase successiva.
- Aggiungere 2 ml di pre-riscaldato tripsina 0,05% per le cellule e inclinare il pallone avanti e indietro per garantire l'intera superficie del pallone è ricoperta da un sottile strato di tripsina. Mettere le cellule in un incubatore (37 ° C / 5% di CO 2) e permettono alle cellule di riposare per 5-7 minuti o fino a quando le cellule iniziano a staccarsi dal piatto. Potrebbe essere necessario per confermare il distacco al microscopio. Battere delicatamente i lati del pallone, se necessario, per facilitate superficie cellulare distacco.
- Aggiungere 4 ml di supporti completi pre-riscaldato al pallone per neutralizzare la tripsina. Lavare delicatamente il pallone pipettando la tripsina / media / soluzione cellulari su e giù diverse volte. Raccogliere l'intera soluzione in un tubo da 15 ml. Centrifugare la soluzione delle cellule a 400 RCF per 5 minuti.
- Attentamente aspirare il surnatante senza disturbare il pellet. Risospendere le cellule in 5 ml di mezzi di comunicazione (contenente siero o siero-free). Centrifugare la soluzione delle cellule a 400 RCF per 5 minuti.
- Ripetere il lavaggio delle cellule descritto al punto 5.5. In totale, le cellule saranno lavata tre volte per rimuovere residui, free agent di contrasto nei media e sulla superficie delle cellule.
- Contare le celle a questo punto per raggiungere la conta delle cellule più accurate, come le cellule verranno persi durante il lavaggio precedente. Eseguire un test di vitalità delle cellule. Le cellule sono ora pronte per la successiva analisi e di sperimentazione o applicazione. RM può essere eseguita con T1-w e T2-w parametri, perché anche se ferumoxytol è un T2-w mezzo di contrasto, ferumoxytol espone anche effetti T1. Rappresentante T2-w parametri RMN che possono essere utilizzati per l'immagine cellule ferumoxytol etichettati comprendono: le sequenze FSE o SE_Multislice con un TR di 2000-2500 ms e un TE di 60-80 ms. Per acquisire un T1-w immagine, diminuire il valore TE su un FSE o sequenza SE_Multislice o utilizzare una sequenza GRE con un alto e basso TR TE. Figura 4 mostra un potenziale di applicazioni per l'imaging in vivo di cellule staminali etichettati.
4. Rappresentante dei risultati:
Cellule marcate dimostrare un effetto di contrasto significativo oscuramento o negativo su immagini T2-pesate MR e un effetto di luminosità o contrasto positivo sul T1 pesate MR (Figura 2). Longitudinale RM e test di vitalità eseguite 5 giorni dopo l'etichettatura dimostrato alcun segnale significativo MR e nessun impatto significativo sulla viabilità rispetto ai controlli senza etichetta (dati non riportati).
jove_content "> cellule staminali con etichetta possono essere successivamente differenziate in vari tipi di cellule o iniettata per via endovenosa per un esame più vivo.
Figura 1. Schematica linea del tempo per l'etichettatura di cellule staminali con nanoparticelle di ossido di ferro, ferumoxytol.
Figura 2. Immagini RM di sezioni sagittali thrrough tubi eppendorf con le cellule in una pallina di cellule. A) senza etichetta controlli. B) le cellule etichetta dimostrando un significativo T2 o negativo effetto di contrasto pesata in T2 FSE o SE_Multislice imaging e un T1 o positivo effetto di contrasto sulla sequenza T1 GRE.
Figura 3. Sagittale sezioni dei tubi eppendorf con le cellule in cellule PELlascia. Un minimo di 10.000 cellule ferumoxytol etichettati possono essere rilevati tramite T2-w RM.
Figura 4. Visualizzazione MR di ferumoxytol marcato le cellule staminali iniettate nei ventricoli cerebrali murine. A) assiale, l'immagine di MR barin murini senza iniezione di USPIO marcato le cellule staminali. B) assiale, C) coronale, e D) sagittale immagini RM raffigurante il T2, effetto negativo di contrasto di USPIO marcata con cellule staminali (frecce bianche) iniettato in un cervello murino.
Tabella 1. Adattamenti Quantità per l'etichettatura delle cellule nei vasi alternativo.
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Discussion
Migliorare l'efficacia di engraftments cellule staminali è fondamentale per il progresso della medicina rigenerativa. Una tecnica non invasiva di visualizzazione per le cellule staminali in vivo migliora in modo significativo la nostra capacità di comprendere i meccanismi che portano a risultati attecchimento di successo. Etichettatura magnetica per la visualizzazione MR, come la procedura abbiamo dimostrato, permette il monitoraggio in vivo di cellule staminali con la RM. Le cellule staminali magneticamente etichettati precedentemente state trapiantate in tessuti bersaglio e sono state visualizzate per settimane con la RM 7. A lungo termine di etichettatura e di imaging longitudinale è possibile grazie alla accumulo lisosomiale di nanoparticelle di ossido di ferro all'interno delle cellule 8. Le sfide, però, si accordano con monitoraggio a lungo termine di ferro cellule marcate. Una sfida associati con l'imaging longitudinale di ferro è che le cellule etichettate come sano, cellule vitali proliferare il mezzo di contrasto viene distribuita ai daughter cellule. Distribuzione del mezzo di contrasto alle cellule figlie è irregolare e si traduce in un effetto di diluizione marcato del mezzo di contrasto nel tempo. Una seconda sfida associati a monitoraggio a lungo termine di ferro cellule marcate è distinzione tra originariamente etichettati, cellule vitali da fagociti residenti, come i macrofagi, che possono essere fagocitati rilasciato da mezzo di contrasto in origine etichettati, le cellule morte 4. Il nostro gruppo ha identificato differenze a lungo termine cinetica segnale di trapianti di staminali vitali e apoptotica delle cellule, che era stato etichettato con nanoparticelle di ossido di ferro diverso ferumoxytol 9-11. Studi futuri sono necessari per determinare se questi principi si applicano anche ai ferumoxytol marcato trapianti di cellule.
Mentre in questo studio il potenziale ferumoxytol effetti etichettatura potrebbe presentare sulla capacità di differenziazione delle cellule staminali non è stato esaminato, studi precedenti hanno dimostrato un effetto dose-dipendente SPIO il differenzialeziazione capacità e le dosi SPIO che non alterino potenziale di differenziazione, il che suggerisce, una dose ferumoxtyol che non compromette la capacità di differenziazione delle cellule staminali può essere determinato anche 12, 13.
SPIOs di grandi dimensioni (diametro idrodinamico> 50 nm) sono stati applicati in precedenza per scopi di monitoraggio delle cellule seguente etichettatura delle cellule staminali attraverso tecniche di etichettatura diverse tra cui incubazione semplice e trasfezione con agenti elettroporazione o trasfezione come protamina, lipofectin e poli-L-lisina (PLL) 3 , 13-16., Anche se non sempre necessario per l'etichettatura delle cellule con SPIOs, i metodi di trasfezione per l'etichettatura delle cellule si sono dimostrate benefiche per facilitare l'etichettatura e aumentando l'efficienza di etichettatura 15. SPIOs che sono stati utilizzati per l'etichettatura delle cellule, tuttavia, non sono più in produzione per motivi commerciali. Ultrasmall SPIO (USPIO, diametro idrodinamico <50 nm), come ferumoxytol, d'altra parte sono ancora in produzionema richiedono l'aiuto di un agente di trasfezione per ottenere efficiente captazione cellulare 8. Solfato di protamina è un agente di trasfezione clinicamente applicabile che forma complessi con USPIOs per facilitare l'assorbimento dei fagociti del mezzo di contrasto da parte delle cellule staminali 17. La combinazione di FDA ha approvato solfato di protamina con l'FDA ha approvato USPIO, ferumoxytol, fornisce il potenziale per la traduzione clinica delle tecniche di cellule staminali attraverso il monitoraggio uso off-label di questo agente. Da segnalare, ferumoxytol ha dimostrato un eccellente profilo di sicurezza negli studi clinici 18. Visualizzazione diretta delle cellule trapiantate tramite una tecnica come quella dimostrata permetterebbe una migliore comprensione dei fattori che promuovono o mettere in pericolo il successo trapianti di cellule staminali e aiutare ad identificare le tecniche più promettenti per le applicazioni cliniche. Con l'uso di marcatori di cellule clinicamente applicabile e apparecchiature di imaging, questa tecnica di imaging è in linea di principio, facilmente accessibileai pazienti che si sottopongono a trapianti di cellule staminali.
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Disclosures
Tutti i collaboratori di questo studio non offrono informazioni.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della National Institute of Arthritis e muscolo-scheletrico e malattie della pelle: 3R01AR054458-02S2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | Or other base medium for desired stem cell line to be used |
| D-PBS (Ca++, Mg++ free) | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Invitrogen | 25300-120 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
Ferumoxytol (Feraheme) |
AMAG | 59338-0775-01 | |
| Protamine Sulfate | APP Pharmaceuticals | 22930 |
References
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