Summary
Плодовой мухи,
Abstract
Для изучения нейронных сетей с точки зрения их функции в поведении, мы должны проанализировать, как нейроны работают, когда каждая модель поведения создается. Таким образом, одновременная запись нейронной активности и поведения, необходимых для деятельности мозга коррелирует с поведением. Для такого поведенческого анализа, плодовой мухи, дрозофилы MELANOGASTER, позволяет включать генетически закодированы кальция такие показатели, как GCaMP 1, для контроля активности нейронов, а также использовать сложные генетические манипуляции по optogenetic или thermogenetic методы конкретно определены активировать нейроны 2-5. Использование техники thermogenetic привело нас найти критические нейронов для пищевого поведения (Flood и соавт., В процессе пересмотра). В основную часть пищевого поведения, взрослые Drosophila расширяет хоботок для питания 6 (хоботок расширение реагирования; PER), отвечая на сладкий стимул сенсорные клетки на его хоботок или лапки. Соmbining протокол за 7 с техникой визуализации кальция 8, используя GCaMP3.0 1, 9, я создал экспериментальную систему, где мы можем контролировать активность нейронов в питании центре - подглоточный ганглий (SOG), одновременно с наблюдения за поведением хоботка. Я разработал аппарат ("Fly мозга Онлайн изображений и электрофизиологии этап": "мухи") для размещения взрослых дрозофил, позволяя своим хоботком свободно перемещаться в то время как его мозг подвергается ванны для Са 2 + изображения через линзу погружением в воду . МУХИ также подходит для многих видов живых экспериментов на лету мозга, таких как электрофизиологические записи или промежуток времени изображение синаптической морфологии. Поскольку результаты от живого изображения могут быть непосредственно связаны с одновременным НА поведения, эта методика может обеспечить отличную экспериментальной системы для изучения обработки информации нейронных сетей, и как это сellular деятельность связана с пластические процессы и память.
Protocol
1. Построение МУХИ
- Форма платформы крышкой 35 мм блюдо Сокол путем плавления боковин и разрезал его, чтобы сформировать соответствующий угол и толщину (рис. 1а, 2). Просверлите отверстие в платформе принять лету головы (рис. 1а, б), что ротовые свободно подвергаться за пределами камеры (рис. 1а). Отрежьте конец наконечника Pipetman, с размерами соответствующий лету быть соблюдены. Клей наконечник на платформу, как показано на рисунке 1а завершить мух (рис. 2).
2. Подготовка Fly для наблюдения
- Голодать взрослых мух в течение 24 часов при 25 ° С до эксперимента, поместив его в сосуд с только влажное бумажное полотенце, если голод не требуется.
- Обезболить лету, поместив его в 15 мл пластиковая трубка стояла на льду.
- Используя щипцы, вставьте муха в камеруМух, и аккуратно вставьте в лету, пока он не может двигаться. Затем вставьте вилку, чтобы сохранить лету. (Рис. 1а, б).
- Печать окружающие части проксимального отдела хоботка (трибуны) до внутреннего края отверстий, нанесите небольшое количество света отверждения клея (Tetric EvoFlow) по бокам и над трибуной извне (стрелки на рисунке 3). Также применяется клей изнутри мух в пространство между спинной части головы и внутренние края отверстия (рис. 1б). Чтобы трибуны свободно передвигаться, следует проявлять осторожность, чтобы предотвратить любой клей от прикосновения к трибуне с помощью ресниц (или что-то сопоставимы) распространять клея. И наконец, вылечить клея с самым слабым освещением синим светом достаточной для лечения, чтобы избежать повреждения лету от чрезмерного тепла. Выдерните штепсель из розетки.
- Нить провести трибуны частично снимается (стрелка на рисунке 3) могут быть использованы для стабилизации лету "голова, избегая удара в глотки частично SOG и разоблачить вентральной части SOG, особенно для работы с изображениями пресинаптические терминалы Gr5a нейронов 8, на которые распространяется части глотки, когда хоботок полностью убирается.
- Заполните поверхности платформы без сахара солевой содержащий (в мМ): NaCl, 140, KCl, 2, 2 MgCl, 4.5, 2 CaCl, 1,5 и HEPES-NaOH, 5 с рН 7,1 10. Это сахарозы без солевой имеет аналогичные тонус тем, наиболее часто используемых содержащие сахарозу, таких как солонцы HL3.1 11.
- Откройте головной капсулы помощью лезвия вольфрама и пинцет с заостренными советы, как ножницы, которые на заказ устройства и первоначально разработана доктором Kageyuki Ямаока, Японии, обрезать кутикулу и трахеи, чтобы разоблачить SOG (рис. 4). Нижний край головы кутикула была сокращена, как вентральный возможно в то время как спинной среза было не так критично. Во-первых, сделать надрез черезЗадний край помощью вольфрама лезвие. Затем разрезать сбоку и передние края, используя заостренные щипцы. Отрезанный кусок кутикула должны быть сняты с щипцами и удалить. Антенны и усиков нервы должны быть вырезаны заостренной щипцами.
- Для того чтобы избежать артефактов движения во время записи, мозг должен быть стабилизирован путем удаления некоторых частей лету. Во-первых, выборочно удалить воздух мешков между ГСК и кутикулы. Вырезать пищевода в конце к глотке и в конце вдаваясь в SOG, чтобы удалить связь между глоткой и мозга. Затем потяните мышцы из 16 12 и, наконец, отделить любой трахеи подключения мозга и кутикулы.
- Мы ставим мух на стадии микроскоп Olympus BX51WI связана с вращающимся диском конфокальной микроскопии системы (Improvision в PerkinElmer) (рис. 5). Объектив погружения в воду, например, 40X/0.8 Н.А., был погружен в ванну (рис. 6
3. Са 2 + изображений мозга
- Са 2 + визуализации с использованием GCaMP3.0 1, 9 было выполнено с помощью метода установленном Marella и соавт. 8 (рис. 6). С помощью вращающихся дисков конфокальной микроскопии (Improvision), принять единую оптическую часть на 4 Гц с выдержкой 122ms использованием 491nm лазерного возбуждения, сосредоточив внимание на области, представляющие интерес (клетки тела двигательных нейронов, или интернейронов или пресинаптические терминалы вкусовых сенсорных нейронов) со скоростью программного обеспечения, версии. 4.3 (Improvision).
4. Стимулирование Хоботок
- Аспирируйте 100mM водный раствор сахарозы в шприц с небольшой фитиль (из японской бумаги васи, см. таблицу конкретных реагентов) торчащие из наконечника (рис. 7).
- Разряд небольшую каплю раствора сахарозы на фитиль, то, аспирации, немедленно ДОприменение электронной бумаги пропитанной Васи фитиль на кончике хоботка. Фитиль Васи бумаги следует применять только на мгновение, чтобы избежать насыщения (рис. 8). Следить за ответ Хоботок Extension (PER) поведение с помощью камеры CCD придает рассечение микроскоп (рис. 5) одновременно с Са 2 + изображения. Данные должны быть приняты в течение одного часа после начала вскрытия, так как PER ответ не поддерживается более одного часа в таких условиях.
5. Представитель Результаты
Моторные нейроны трибуны транспортир, пара крупных мышц, ответственных за снятие трибуны для расширения хоботок, были зарегистрированы, чтобы показать надежный ответ на сладкое стимулы 13. Рисунке 9 показано, Ca 2 + сигналов через GCaMP3.0 1, 9 выраженные Гал 4 водителя, E49 13, от тела клетки нейрона двигатель. Как показано на видео, Робуул НА наблюдается синхронно с увеличением Ca 2 + сигнала.
Рисунок 1. Схема Fly мозга Онлайн визуализации и электрофизиологии этап (мухи). , мух построена таким образом, чтобы угол наклона стен позволяет лету головы, чтобы выйти прямо. Три отрезка лету хоботком имеют цветовую маркировку, трибуны является пурпурный. Муха вставляется в камеру с пинцета, и кусок вырезан из конца наконечник Pipetman подключен к задней части камеры, чтобы блокировать лету убежать. Б, отверстие скучно, чтобы они соответствовали голову мухи. Оставшиеся пробелы уплотнены светоотверждаемых клей, как показано, чтобы нет утечек. После того, как клей вылечил, кончик Pipetman как плагин будет удален. Соленая заливается в мух, что поверхность головного мозга была полностью закрыта. Следует обеспечить, что нет утечки солевойПроисходит как бы на переднем конце лету головы. Затененные области, окруженной пунктирной линии на панели б показана часть будет иссекали.
Рисунок 2. Фотография мух. Полумесяца стене клеем (с клеевой пистолет) состоит, чтобы управлять потоком физиологического раствора во время перфузии, а также уменьшить количество физиологического раствора используется.
Рисунок 3. Фронтальный вид мухи установлен в мух. Это изображение показывает, как муха находится в мух, и, как светоотверждаемых клей наносится вокруг головы муха (стрелки), чтобы создать физиологическим раствором доказательство печатью. Если солевой утечки до хоботок мухи, то эксперимент не удастся. Нить (стрелки) привязаны к стадии проведения хоботок в положении, так что это не совсем retrac Тед. В противном случае он будет препятствовать более брюшной части SOG и вызывает движение артефакты.
Рисунок 4. Топ-вид мух с расчлененным мухи. Это изображение показывает открытые SOG из мухи после удаления кутикулы. Пищевода, мышц 16 и трахеи связаны с мозгом, а также отдельных воздушных мешков, также были удалены, чтобы не допустить их нарушения головного мозга, что может привести к артефактам в кальциевых сигналов.
Рисунок 5. Аппаратура контроля. Этот аппарат собран из микроскоп Olympus BX51WI прикреплены к вращающимся диском конфокальной микроскопии системы (Improvision), а также боковыми Nikon SMZ800 микроскопом. Эта установка позволяет живого изображения мозговой деятельности при PER поведения.
6 "SRC =" / files/ftp_upload/3625/3625fig6.jpg "/>
Рисунок 6. Фотографии, чтобы показать вид сбоку от мух. Тонкий слой физиологического раствора зажат между 40X воды погружения линз и лету.
Рисунок 7. Схема для изготовления фитиля Васи бумаги. Gampi-Васи работы является традиционной японской пергамент, что является чрезвычайно тонкой и гладкой (Haibara, Япония). Кроме того, очень сильны и могут сохранить большое количество жидкости. В статье Васи должны быть обрезаны в трапеции с очень специфическими размерами, 0,3 мм и 0,7 мм в ширину и 4-5 мм в длину (а). Это трапеции затем вставляется в 0,7 мм в сторону кончика иглы 23 G подкожный, а также может быть стабилизирована путем включения насекомых вывод, который наклонился, чтобы V-образную форму (б). С, бумаги Васи становится прозрачными в результате воздействияв жидкости, что делает его идеальным для этого эксперимента.
Рисунок 8. Стимуляция хоботком на мух Васи-фитиль. Фитиль Васи бумагу на кончике иглы подкожно применяется для мгновенной помощи джойстика манипулятор с одной стороны. Иглы соединены через гибкую трубку с инжектором манипулировать с другой стороны, для аспирационных и выгрузки раствора сахарозы.
Рисунок 9. Представитель результаты. , PER поведение записываемого с помощью ПЗС-камеры установлены на стереомикроскопа. Фронтальный вид голодных мух с расширенным хоботок (стрелки) до стимуляции, при стимуляции, и после стимуляции с фитилем, содержащего 100 мМ сахарозы водном растворе (стрелки). Подсветка осуществляется с помощью 491 нм лазер, используемыйдля GCaMP флуоресценции. б, сахароза-индуцированной GCaMP 3,0 ответ в двигательный нейрон для транспортир с трибуны мышц голодного государства. На верхней панели, перед стимуляцией, нижняя панель, сразу после стимуляции. Шкала бар, 10 мкм. С, количественная оценка сахарозы вызванного ответа GCaMP 3.0. Двигательный нейрон реагирует на сахарозу стимул к резкому увеличению флуоресценции сопровождается восстановлением фазы от нескольких секунд до базовой линии.
Discussion
МУХИ позволяет одновременную запись Са 2 + и сигналы НА поведения. Даже мозг воздействию солевой нормальный НА поведение не наблюдалось. Использование Gampi-Васи фитиль вместо Kimwipe фитиль, используемых в оригинальной капиллярной method7 обеспечивает высокую воспроизводимость и стабильное поведение PER и избавляет от необходимости, чтобы стать специалистом в выборе решений и хорошей фитиль Kimwipe. Экспериментальные советов указанных выше позволило нам успешно избежать нарушения движением хобота, что приводит к очень стабильной записи Са 2 + сигналы с низким уровнем шума. Иногда ткань удаление было недостаточно, чтобы подвергать клетки или подавлять движения адекватно, что приводит к плохим результатам. Однако, когда мы были опытные, более 80% препаратов дает хорошие результаты. Эта методика предназначена не только для Са 2 + изображения, но также может быть адаптирована для любого живого изображения при наблюдении НА поведения. Например, мы можем получить доступ к любой ячейке черезИспользование электродов непосредственно записывать активность. В сочетании с двухфотонного возбуждения микроскопии, мы в состоянии выполнить промежуток времени изображение синаптической структурой, которая может быть связана с поведенческими изменениями. Таким образом, этот метод визуализации головного мозга с наблюдения за поведением не только ценный для функциональной вскрытия нейронной сети, но может быть использована в качестве мощного инструмента соотнести синаптической пластичности в 14 механизмы, лежащие в памяти.
Acknowledgments
Я благодарю L Ватанабе, M Gorczyca и другие члены Yoshihara лаборатории за полезные замечания и обсуждения. Я благодарю К. Скотт Л. Looger на лету запасы, S Йокояма для демонстрации опытов, Shinya Игучи для технической помощи, и Нобуко Yoshihara для информационных материалов. Работа выполнена при поддержке Национального института психического здоровья MH85958 Гранты и Вустер Фонда MY
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tetric EvoFlow | Ivoclar vivadent | M04115 | Light-curing glue |
| BX51WI Microscope | Olympus Corporation | BX51WI | With 40X (N.A. 0.8) water immersion objective lens |
| Spinning disk confocal microscope system | PerkinElmer, Inc. | With 491 nm laser | |
| Stereomicroscope | Nikon Instruments | SMZ-800 | Attached to a swing arm. Stereo view is still available with video recording |
| Gampi-Washi paper | Haibara, Japan | A special kind of traditional Japanese paper | |
| CCD camera | Imaging Source | DFK41AU02 | 1/2" 1080 × 960 pixels SONY CCD |
| Joystick manipulator | Narishige International | MN-151 | |
| Injector | Narishige International | IM-5B |
References
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).
- Lima, S. Q., Miesenbock, G. Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons. Cell. 121, 141-152 (2005).
- Schroll, C. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).
- Hamada, F. N. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454, 217-220 (2008).
- Peabody, N. C. Characterization of the decision network for wing expansion in Drosophila using targeted expression of the TRPM8 channel. J. Neurosci. 29, 3343-3353 (2009).
- Dethier, V. G. Hungry Fly. , Harvard University Press. (1976).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. Proboscis Extension Response (PER) Assay in Drosophila. J. Vis. Exp. (3), e193-e193 (2007).
- Marella, S. Imaging taste responses in the fly brain reveals a functional map of taste category. 49, 285-295 (2006).
- Tian, L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
- Yoshihara, M., Suzuki, K., Kidokoro, Y. Two independent pathways mediated by cAMP and protein kinase A enhance spontaneous transmitter release at Drosophila neuromuscular junctions. J. Neurosci. 20, 8315-8322 (2000).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J. Neurogenet. 18, 377-402 (2004).
- Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. Biology of Drosophila. M, D. emerecm , John Wiley & Sons. 420-534 (1950).
- Gordon, M. D., Scott, K. Motor control in a Drosophila taste circuit. Neuron. 61, 373-384 (2009).
- Yoshihara, M., Adolfsen, B., Galle, K. T., Littleton, J. T. Retrograde signaling by Syt 4 induces presynaptic release and synapse-specific growth. Science. 310, 858-863 (2005).
