Summary
De fruitvlieg,
Abstract
Om neuronale netwerken te bestuderen in termen van hun functie in het gedrag, moeten we analyseren hoe neuronen werken wanneer elke gedragspatroon wordt gegenereerd. Zo gelijktijdige opnames van neuronale activiteit en gedrag zijn essentieel om hersenactiviteit te correleren met gedrag. Voor dergelijke gedrags-analyses, de fruitvlieg, Drosophila melanogaster, laat ons toe om genetisch gecodeerd calcium indicatoren zoals GCaMP 1 te nemen, teneinde neuronale activiteit te controleren, en om geavanceerde genetische manipulaties te gebruiken voor optogenetic of thermogenetic technieken om specifiek te activeren geïdentificeerde neuronen 2-5. Het gebruik van een thermogenetic techniek heeft geleid tot kritische neuronen voor eetgedrag (Flood et al.., Wordt herzien) te vinden. Als een belangrijk onderdeel van voedingsgedrag, een Drosophila volwassen breidt zijn snuit voor de voeding van 6 (proboscis uitbreiding reactie; PER), als antwoord op een zoete prikkel van zintuigcellen op zijn snuit of tarsi. Combining het protocol voor PER 7 met een calcium-beeldvormende techniek 8 met behulp van GCaMP3.0 1, 9, ik heb opgericht een experimenteel systeem, waar we de activiteit van neuronen te volgen in het voedingscentrum - de suboesophageal ganglion (SOG), gelijktijdig met gedragsobservatie van de slurf. Intussen heb ik een apparaat ("Fly hersenen Live-Imaging en Elektrofysiologie Stage": "VLIEGEN") om een Drosophila volwassen tegemoet te komen, waardoor de slurf zich vrij te bewegen terwijl de hersenen worden blootgesteld aan het bad voor Ca 2 + beeldvorming door middel van een onderdompeling in water lens . De vliegen is ook geschikt voor vele soorten levende experimenten op fly hersenen, zoals elektrofysiologische opname of time lapse beeldvorming van synaptische morfologie. Omdat de resultaten van live-beelden kunnen direct worden gecorreleerd met de gelijktijdige PER gedrag, kan deze methodiek een uitstekend experimenteel systeem om informatie te verwerken van neuronale netwerken te bestuderen, en hoe dit cellular activiteit is gekoppeld met kunststof processen geheugen.
Protocol
1. De bouw van de VLIEGEN
- Vorm een platform van het deksel van 35 mm Falcon schaal door het smelten van de zijwand en snijwerk dat het een juiste hoek en de dikte (Figuur 1a; figuur 2) te vormen. Boor een gat in het platform om de vlieg kop (figuur 1a, b), zodanig dat de mondstukken vrij worden blootgesteld aan de buitenzijde van de kamer (figuur 1a) accepteren. Snij het einde van een Pipetman tip met de grootte overeenkomt met de vlieg te worden genomen. Lijm de tip om het platform, zoals aangegeven in figuur 1a om de vliegen (figuur 2) te voltooien.
2. Voorbereiden van de Fly voor observatie
- Verhonger volwassen vlieg gedurende 24 uur bij 25 ° C voorafgaand aan het experiment door het in een flesje met slechts een vochtige tissue indien uithongering noodzakelijk.
- Verdoof de vlieg door het in een 15 ml plastic buis staande op ijs.
- Met behulp van een tang, plaatst u een vlieg in de kamer van deVLIEGEN, en duw de vlieg in totdat het niet in staat is om te bewegen. Vervolgens plaatst u een stekker op de vlieg te behouden. (Figuur 1a, b).
- Sluit de aangrenzende delen van het proximale snuit (snuit) aan de binnenrand van de opening, toepassen een kleine hoeveelheid licht uithardende lijm (Tetric EvoFlow) aan de zijkanten en boven het podium van buitenaf (pijlen in figuur 3). Ook de lijm vanuit de binnenkant van de VLIEGEN de ruimte tussen de rug van de kop en de binnenrand van de opening (figuur 1b). Om het rostrum tot aan vrij bewegen, moet erop worden gelet dat de lijm te voorkomen dat het aanraken van het podium met behulp van een wimper (of iets vergelijkbaars) om de lijm te verspreiden. Tot slot, genezen de lijm met de zwakste verlichting van blauw licht voldoende is voor de genezing om te voorkomen dat schade aan de vlieg tegen overmatige hitte. Haal de stekker.
- Een thread op het podium gedeeltelijk heeft opgeheven (pijl in figuur 3) in het bezit kunnen worden gebruikt om de vlieg te stabiliseren 's hoofd door het vermijden van bump van de faryngeale deel aan SOG en het ventrale deel van de SOG bloot te leggen, in het bijzonder voor de beeldvorming presynaptische terminals van Gr5a neuronen 8, die worden gedekt door een deel van de keelholte als de proboscis volledig is ingetrokken.
- Vul het oppervlak van het platform met suikervrije zoutoplossing bevattende (in mM) NaCl, 140, KCl, 2, MgCl2, 4,5, CaCl2 1,5 en HEPES-NaOH, 5 met een pH van 7,1 10. Deze sucrose-vrije zoutoplossing heeft dezelfde tonus met die van veelgebruikte suikerhoudende Salines, zoals HL3.1 11.
- Open het hoofd capsule met een wolfraam mes en een tang met geslepen tips, zoals een schaar, dat is een op maat gemaakt apparaat en oorspronkelijk ontworpen door Dr Kageyuki Yamaoka, Japan, om de cuticula en de luchtpijp clip om de SOG (figuur 4) bloot te leggen. De ventrale van de kop cuticula werd doorgesneden ventrale mogelijk dat de dorsale zijde snede niet zo kritisch. Maak eerst een incisie door deachterste rand van het gebruik van een wolfraam mes. Daarna dwars door de zijkant en de voorste randen met behulp van de geslepen tang. De cut cuticula stuk moet worden opgeheven met de tang en verwijderd. Antennes en antennaal zenuwen moeten worden gesneden door de geslepen tang.
- Om bewegingsartefacten voorkomen tijdens opnames, moet de hersenen worden gestabiliseerd door de verwijdering van bepaalde delen van de vlucht. Ten eerste, selectief verwijderen van luchtzakjes tussen de SOG en de cuticula. Snij de slokdarm op het einde naar de keelholte en aan het einde gaat de SOG de verbinding tussen de keelholte en de hersenen verwijderd. Dan trek Muscle 16 12, en ten slotte, los een luchtpijp het aansluiten van de hersenen en de cuticula.
- Wij hebben onze VLIEGEN ingesteld op het podium van een Olympus BX51WI microscoop aangesloten op een draaiende schijf confocale microscoop systeem (Improvision in PerkinElmer) (figuur 5). Een onderdompeling in water lens, bijvoorbeeld 40X/0.8 NA, werd ondergedompeld in het bad (Figuur 6
3. Ca 2 + beeldvorming van de hersenen
- Ca 2 + beeldvorming met GCaMP3.0 1, 9 werd uitgevoerd door de werkwijze die door Marella et al.. 8 (fig. 6). Met behulp van een draaiende schijf confocale microscoop (Improvision), neem een enkele optische sectie op 4Hz met een belichtingstijd van 122ms gebruik van 491nm laser excitatie, met de nadruk op de regio van belang (een cel lichaam van een motor neuron, of een interneuron, of presynaptische terminals van smaak sensorische neuronen) met Velocity software, Ver. 4.3 (Improvision).
4. Het stimuleren van de Proboscis
- Zuig 100 mM waterige oplossing sucrose in een hypodermische naald met kleine kous (gemaakt van Japanse Washi papier zie tabel specifieke reagentia) uitsteekt vanaf het uiteinde (Figuur 7).
- Kwijting een kleine daling van sucrose oplossing op de pit, dan zuig het, onmiddellijk before de toepassing van de geweekte Washi papier lont aan het uiteinde van de slurf. De Washi papier lont mag alleen worden toegepast voor een moment om verzadiging (figuur 8) te voorkomen. Controleer de Proboscis Extension Response (PER) gedrag met behulp van een CCD-camera bevestigd aan een dissectie microscoop (figuur 5) gelijktijdig met Ca 2 + beeldvorming. De gegevens moeten worden genomen binnen een uur na aanvang van de dissectie, omdat de PER reactie niet gehandhaafd blijft meer dan een uur onder deze omstandigheden.
5. Representatieve resultaten
Motor neuronen van het rostrum gradenboog, een paar belangrijke spieren die verantwoordelijk zijn voor het opheffen van het podium voor de proboscis uitbreiding, is gemeld dat deze robuuste reacties op zoete prikkels 13 tonen. Figuur 9 toont Ca 2 +-signalen via GCaMP3.0 1, 9 uitgedrukt in een Gal 4-stuurprogramma, E49 13, uit een cellichaam van het motorneuron. Zoals getoond in de video een Robust PER waargenomen synchroon met een toename van Ca 2 + signaal.
Figuur 1. Schematische voorstelling van de Fly hersenen Live-Imaging and Elektrofysiologie Stage (vliegen). A wordt de VLIEGEN vervaardigd dat de hoek van de muur kan het vlieg hoofd rechte komen. Drie segmenten van de vlieg proboscis zijn kleurcode, het podium is magenta. De vlieg wordt in de kamer met een pincet, en een stuk gesneden uit het einde van een Pipetman tip is aangesloten op de achterkant van de kamer naar de vlieg te blokkeren ontsnappen. B, is het gat geboord om te voldoen aan het hoofd van de vlieg. De overige gaten zijn afgedicht met licht-uithardende lijm, zoals aangegeven ervoor te zorgen dat er geen lekken zijn. Nadat de lijm is uitgehard, wordt de Pipetman tip als een plug verwijderd. Saline wordt gegoten in de VLIEGEN zodanig dat het oppervlak van de hersenen geheel bedekt. Er moet worden gegarandeerd dat er geen zout lekIng uit op het voorste einde van de vlieg hoofd. Het gearceerde gebied omgeven door de stippellijn in paneel b toont het deel ontleed uit.
Figuur 2. Foto van de vliegen. De halvemaanvormige wand van lijm (van een lijmpistool) wordt de stroom van zoutoplossing bij perfusie te controleren en de hoeveelheid zoutoplossing gebruikt verminderen.
Figuur 3. Vooraanzicht van een vlieg gemonteerd in de vliegen. Dit plaatje laat zien hoe een vlieg is ingesteld in de vliegen, en hoe de licht-uithardende lijm wordt aangebracht rond het hoofd van de vlieg (pijlen) om een zout-proof afdichting te creëren. Als een zoutoplossing lekken tot en met de slurf van de vlieg, dan is het experiment mislukken. De draad (pijlen) bevestigd aan de fase is de snuit in positie, zodat het niet volledig uittrekken Ted. Anders zou het belemmeren van de meer ventrale deel van de SOG en veroorzaken bewegingsartefacten.
Figuur 4. Top-view of the Flies met een ontleed vlieg. Dit beeld toont de blootgestelde SOG van een vlieg volgende nagelriemen te verwijderen. De slokdarm, luchtpijp spier 16 en verbonden met de hersenen, en geselecteerde lucht zakken ook zijn verwijderd te verstoort de hersenen, wat kan leiden tot artefacten in de calcium signalen.
Figuur 5. De bewakingsinrichting. Deze inrichting is opgebouwd uit een Olympus microscoop BX51WI aan een draaiende schijf confocale microscoop systeem (Improvision) en een zijkant gemonteerde Nikon SMZ800 microscoop. Deze opzet maakt het mogelijk om live-beeldvorming van de hersenactiviteit tijdens PER gedrag.
6 "src =" / files/ftp_upload/3625/3625fig6.jpg "/>
Figuur 6. Foto de zijaanzicht van de vliegen vertonen. De dunne laag zoutoplossing wordt ingeklemd tussen de 40X water ondergedompeld lens en de vlieg.
Figuur 7. Schema voor het maken van de Washi papier lont. Gampi-Washi papier is een traditioneel Japans perkament, dat is extreem dun en glad (Haibara, Japan). Het is ook zeer sterk en kan steeds een grote hoeveelheid vloeistof. De Washi papier moet worden gesneden een trapezium met zeer bepaalde afmetingen, 0,3 mm en 0,7 mm breedte en 4-5 mm (a). Deze trapeziumvormige wordt ingebracht vanaf de 0,7 mm kant in het uiteinde van een 23 G injectienaald en kunnen ook gestabiliseerd door toevoeging van een insect pen, die gebogen is een V-vorm (b). C de Washi papier wordt transparant na blootstellingtot een vloeistof, waardoor het ideaal is voor dit experiment.
Figuur 8. Stimulatie van de proboscis op de vliegen met de Washi-lont. De Washi papier lont aan het uiteinde van een injectienaald wordt toegepast voor een moment met behulp van een joystick manipulator met een hand. De naald is via een slang naar een injector gemanipuleerd met de andere kant, voor opzuigen en afvoeren sucrose-oplossing.
Figuur 9. Representatieve resultaten. a, PER gedrag opgenomen via de CCD-camera geïnstalleerd op de stereomicroscoop. Vooraanzichten van een uitgehongerde vlieg met een uitgebreide slurf (pijlen) voor de stimulatie van de stimulatie en na stimulatie met een koord 100 mM sucrose waterige oplossing (pijlpunt). De verlichting wordt bereikt door een 491 nm laser gebruiktvoor GCaMP fluorescentie. b, sucrose-geïnduceerde GCaMP 3,0 respons in de motor neuron voor de gradenboog van het rostrum spier in het uitgehongerde toestand. Het bovenste paneel voor het stimuleren; het bodempaneel, onmiddellijk na de stimulatie. Schaal bar, 10 pm. C, Kwantificering van de sucrose-geïnduceerde GCaMP 3,0 reactie. De motor neuron reageert op een sucrose stimulans door een sterke toename van de fluorescentie, gevolgd door een herstel fase van enkele seconden aan de basislijn.
Discussion
De VLIEGEN maakt gelijktijdig opnemen van Ca2 +-signalen en PER gedrag. Zelfs met de hersenen blootgesteld aan fysiologische zoutoplossing normale PER gedrag waargenomen. Met behulp van de Gampi-Washi pit in plaats van een Kimwipe lont gebruikt in de originele capillaire method7 maakt een zeer reproduceerbare en stabiele PER gedrag en voorkomt de noodzaak om ervaren te worden in het maken en het kiezen van een goede Kimwipe lont. De experimentele uiteinden bovengenoemde konden we succes verstoringen door beweging van de snuit, waardoor een zeer stabiele opname van Ca2 + signalen met een lage ruis. Af en toe weefsel verwijderen was niet voldoende om cellen bloot te leggen of voldoende te onderdrukken beweging, wat leidt tot slechte resultaten. Wanneer we echter bekwaam waren, meer dan 80% van de voorbereiding goede resultaten opgeleverd. Deze methode is niet alleen voor Ca2 + imaging, maar kan ook worden aangepast aan elke beeldvormende levende inachtneming PER gedrag. Zo kunnen we toegang krijgen tot een van de cellen door middel van deGebruik van een elektrode om rechtstreeks activiteit. In combinatie met twee foton excitatie microscopie, kunnen we tijdsverloop beeldvorming synaptische structuur, die kan worden gerelateerd aan gedragsveranderingen voeren. Daarom is deze methode van beeldvorming van de hersenen met een gedragsobservatie is niet alleen waardevol voor de functionele ontleding van het neuronale netwerk, maar kan worden gebruikt als een krachtig hulpmiddel om synaptische plasticiteit 14 correleren met de mechanismen achter geheugen.
Acknowledgments
Ik dank L Watanabe, M Gorczyca en andere leden van de Yoshihara lab voor nuttige opmerkingen en discussie. Ik dank K. Scott en L. Looger voor het vliegvissen voorraden, S Yokoyama voor het aantonen van experimenten, Shinya Iguchi voor technische hulp, en Nobuko Yoshihara voor materiaal informatie. Dit werk werd ondersteund door de National Institute of Mental Health Grants MH85958, en de Worcester Stichting MY
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tetric EvoFlow | Ivoclar vivadent | M04115 | Light-curing glue |
| BX51WI Microscope | Olympus Corporation | BX51WI | With 40X (N.A. 0.8) water immersion objective lens |
| Spinning disk confocal microscope system | PerkinElmer, Inc. | With 491 nm laser | |
| Stereomicroscope | Nikon Instruments | SMZ-800 | Attached to a swing arm. Stereo view is still available with video recording |
| Gampi-Washi paper | Haibara, Japan | A special kind of traditional Japanese paper | |
| CCD camera | Imaging Source | DFK41AU02 | 1/2" 1080 × 960 pixels SONY CCD |
| Joystick manipulator | Narishige International | MN-151 | |
| Injector | Narishige International | IM-5B |
References
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).
- Lima, S. Q., Miesenbock, G. Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons. Cell. 121, 141-152 (2005).
- Schroll, C. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).
- Hamada, F. N. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454, 217-220 (2008).
- Peabody, N. C. Characterization of the decision network for wing expansion in Drosophila using targeted expression of the TRPM8 channel. J. Neurosci. 29, 3343-3353 (2009).
- Dethier, V. G. Hungry Fly. , Harvard University Press. (1976).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. Proboscis Extension Response (PER) Assay in Drosophila. J. Vis. Exp. (3), e193-e193 (2007).
- Marella, S. Imaging taste responses in the fly brain reveals a functional map of taste category. 49, 285-295 (2006).
- Tian, L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
- Yoshihara, M., Suzuki, K., Kidokoro, Y. Two independent pathways mediated by cAMP and protein kinase A enhance spontaneous transmitter release at Drosophila neuromuscular junctions. J. Neurosci. 20, 8315-8322 (2000).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J. Neurogenet. 18, 377-402 (2004).
- Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. Biology of Drosophila. M, D. emerecm , John Wiley & Sons. 420-534 (1950).
- Gordon, M. D., Scott, K. Motor control in a Drosophila taste circuit. Neuron. 61, 373-384 (2009).
- Yoshihara, M., Adolfsen, B., Galle, K. T., Littleton, J. T. Retrograde signaling by Syt 4 induces presynaptic release and synapse-specific growth. Science. 310, 858-863 (2005).
