Summary
Bananfluga,
Abstract
Att studera neuronala nätverk i termer av deras funktion i beteende, måste vi analysera hur nervceller fungerar när varje beteendemönster genereras. Således samtidiga inspelningar av neuronal aktivitet och beteende är avgörande för att korrelera hjärnans aktivitet beteende. För sådana beteendemässiga analyser ger bananfluga, Drosophila melanogaster, oss för att införliva genetiskt kodade kalcium indikatorer såsom GCaMP 1, för att övervaka neuronal aktivitet och att använda avancerade genetiska manipulationer för optogenetic eller thermogenetic tekniker för att specifikt aktivera identifierade nervceller 2-5. Användning av en thermogenetic teknik har lett oss att hitta kritiska neuroner för utfodring beteende (Flood et al., Under revidering). Som en viktig del av ätbeteende, sträcker sig en Drosophila vuxen sina snabel för matning 6 (snabel förlängning svar; PER) som svar på en söt stimulans från sensoriska celler på sina snabel eller tarsi. Combining protokollet för PER 7 med en kalcium-bildteknik 8 med GCaMP3.0 1, 9, har jag etablerat ett experimentellt system där vi kan övervaka aktiviteten av nervceller vid utfodring Center - suboesophageal ganglion (SOG), samtidigt med beteendeobservationer av SNABEL. Jag har designat en apparat ("Fly hjärnan Live Imaging och elektrofysiologi Stage": "flyger") för att rymma en Drosophila vuxen, så att dess snabel att röra sig fritt medan dess hjärna utsätts för badet för Ca 2 + avbildning genom en nedsänkning i vatten objektiv . Flugorna är också lämplig för många typer av levande experiment på fly hjärnor som elektrofysiologiska inspelning eller tidsförlopp avbildning av synaptisk morfologi. Eftersom resultaten från Live avbildning kan direkt korrelerad med den samtidiga PER beteende, kan denna metod en utmärkt experimentellt system för att ta del av information behandling av neuronala nätverk och hur detta cellular aktivitet är kopplad till plast processer och minne.
Protocol
1. Konstruera FLUGOR
- Forma en plattform från locket av 35 mm Falcon skålen genom smältning av sidoväggen och tälja den för att bilda en lämplig vinkel och tjocklek (fig 1a, fig 2). Borra ett hål i plattformen för att acceptera fluga huvudet (figur 1a, b), så att mundelar fritt exponeras mot utsidan av kammaren (figur 1a). Skär i slutet av en Pipetman spets, med storleken matchande flugan skall beaktas. Limma spetsen till plattformen som visas i Figur 1a att slutföra FLUGOR (figur 2).
2. Förbereda Fly för observation
- Svälta en vuxen fluga under 24 timmar vid 25 ° C före experimentet genom att placera den i en ampull med endast en våt pappershandduk, om svält är nödvändigt.
- Bedöva flugan genom att placera den i en 15 ml plaströr som står på is.
- Använd pincett in en fluga i kammaren avFlyger, och tryck försiktigt flugan tills det inte kan röra sig. Sedan sätter i en stickkontakt att behålla flugan. (Figur 1 A, B).
- Täta de omgivande delarna av de proximala SNABEL (rostrum) till den inre kanten av hålet, på en liten mängd ljus-härdande lim (Tetric EvoFlow) åt sidorna och uppåt podiet från utsidan (pilar i fig 3). Också tillämpas limmet från insidan av flugorna till utrymmet mellan den dorsala delen av huvudet och den inre kanten av hålet (fig 1b). Om du vill att talarstolen att röra sig fritt, bör försiktighet iakttas för att förhindra lim från att röra talarstolen med hjälp av en ögonfrans (eller något motsvarande) för att sprida limmet. Slutligen, bota limmet med den svagaste belysning av blått ljus är tillräcklig för att bota för att undvika skador på farten från stark värme. Ta bort kontakten.
- En tråd för att hålla talarstolen partiellt upplyft (pilen i figur 3) kan användas för att stabilisera den fly "huvud genom att undvika bula i svalgets del SOG och att exponera den ventrala delen av SOG, särskilt för avbildning presynaptiska terminaler Gr5a nervceller 8, som omfattas av en del av svalget när snabel är helt indragen.
- Fylla på ytan av plattformen med ett sockerfritt saltlösning innehållande (i mM): NaCl, 140; KCl, 2; MgCl2, 4,5; CaCl2, 1,5; och HEPES-NaOH, 5 med ett pH av 7,1 10. Detta sackaros utan saltlösning har liknande tonicitet dem av gemensamt använda sackaros-innehållande Salines som HL3.1 11.
- Öppna huvudet kapseln med hjälp av en volfram blad och tång med vässade tips som saxar, vilket är en specialanpassad produkt och ursprungligen designad av Dr Kageyuki Yamaoka, Japan, att klippa på nagelbanden och luftstrupe att exponera SOG (Figur 4). Den ventrala kanten av huvudet nagelband klipptes så ventrala som möjligt medan ryggen kanten snittet var inte lika kritisk. Först gör ett snitt genombakre kant med användning av en volfram blad. Sedan skär genom sidan och främre kanterna med hjälp av skärpta pincett. Snittet nagelband delen bör lyftas med pincetten och tas bort. Antenner och antenn nerver bör skäras ut av skärpta pincett.
- För att undvika rörelse artefakter under inspelningar, måste hjärnan stabiliseras genom att undanröja vissa delar av flugan. Först selektivt avlägsna luft säckar mellan SOG och nagelband. Skär matstrupen vid slutet mot svalget och i slutet går in i SPM att avlägsna förbindelsen mellan svalget och hjärnan. Dra sedan ut Muscle 16 12, och slutligen, ta bort alla luftstrupen ansluter hjärnan och nagelband.
- Vi sätter våra flugor på scenen av en Olympus BX51WI mikroskop kopplad till en snurrande skiva konfokalmikroskop system (Improvision i PerkinElmer) (Figur 5). En nedsänkning i vatten lins, t.ex. 40X/0.8 NA nedsänktes i badet (figur 6
3. Ca 2 + avbildning av hjärnan
- Ca 2 + avbildning med GCaMP3.0 1, 9 utfördes genom den metod som fastställts genom Marella et al. 8 (figur 6). Med hjälp av en roterande skiva konfokalmikroskop (Improvision), ta en enda optisk sektion vid 4 Hz med en exponeringstid på 122ms med 491nm excitation laser, med fokus på regionen av intresse (en cell kropp av en motor neuron eller en interneuron, eller presynaptiska terminaler av smak sensoriska neuroner) med Velocity programvara, ver. 4,3 (Improvision).
4. Stimulering av de SNABEL
- Aspirera 100 mM vattenhaltig sackaroslösning i en hypodermisk nål med en liten veke (tillverkad av japanskt papper Washi, se tabell av specifika reagens) som skjuter ut från spetsen (fig 7).
- Urladda en liten droppe av sackaroslösning till veken, sedan aspireras det, omedelbart before applicera blötlagda Washi papper veke till spetsen av SNABEL. Den Washi papper Veken bör endast tillämpas för ett ögonblick för att undvika mättnad (Figur 8). Övervaka SNABEL Förlängning respons (PER) beteende med användning av en CCD-kamera ansluten till ett dissektionsmikroskop (figur 5) simultant med Ca 2 + avbildning. Data måste fattas inom en timme efter start av dissektion eftersom PER svar inte upprätthålls mer än en timme under dessa villkor.
5. Representativa resultat
Motoriska nervceller i talarstolen gradskiva, ett par stora muskler som svarar för att lyfta i talarstolen för snabel förlängning, har rapporterats visa robusta svar på söta stimuli 13. Figur 9 visar Ca 2 +-signaler via GCaMP3.0 1, 9 uttrycks av en Gal 4 förare, E49 13, från en cell kropp motorneuron. Som framgår av video, en robum PER observerades i synkronism med en ökning i Ca 2 +-signal.
Figur 1. Schematisk av Fly hjärnan Live Imaging och elektrofysiologi Stage (flugor). en är Flugorna byggd så att vinkeln hos väggen gör det möjligt att fly huvudet för att komma ut direkt. Tre segment av flugan snabel är färgkodade, i talarstolen är magenta. Flugan förs in i kammaren med pincett, och en bit skuren från slutet av en Pipetman tips är ansluten till baksidan av kammaren för att blockera flugan från att fly. B, Hålet borras för att anpassas till flugan huvud. De återstående luckorna tätas med ljushärdande lim som anges för att säkerställa att det inte finns några läckor. Efter att limmet har härdat, är Pipetman spetsen som en plug bort. Saltlösning hälls i de flugor, att ytan av hjärnan är helt täckt. Det bör säkerställas att det inte finns någon saltlösning läckagening ut på den främre änden av flugan huvudet. Det skuggade område som omges av den streckade linjen i panel b visar den del som skall skäras ut.
Figur 2. Fotografi av flugorna. Den halvmåneformade vägg lim (från en limpistol) är gjord för att styra flödet av saltlösning under perfusionen, och för att minska mängden saltlösning användes.
Figur 3. Frontal vy av en fluga monterad i flugorna. Denna bild visar hur en fluga ligger i flugor, och hur ljushärdande lim appliceras runt huvudet av flugan (pilar) för att skapa en saltlösning-bevis tätning. Om några saltlösning läcker igenom till snabel av flugan, då experimentet kommer att misslyckas. Gängan (pilhuvuden) bunden till steget är att hålla de snabel i läge, så att det inte är helt rullgardinsfunktion Ted. Annars skulle hindra den mer ventrala delen av SOG och orsaka rörelse artefakter.
Figur 4. Top-view of the Flies med en dissekerad fluga. Denna bild visar den exponerade SOG en fluga efter nagelband avlägsnande. Matstrupen, Muscle 16 och luftstrupama ansluten till hjärnan, samt valda luft-säckar har också tagits bort för att förhindra dem från att störa hjärnan, vilket kan leda till artefakter i kalcium-signaler.
Figur 5. Övervakningsapparaten. Denna anordning är sammansatt av en Olympus mikroskop BX51WI fäst till en roterande skiva konfokalt mikroskop system (Improvision), och en sidomonterad Nikon SMZ800 mikroskop. Denna setup gör det möjligt att live-avbildning av hjärnans aktivitet under PER beteende.
6 "src =" / files/ftp_upload/3625/3625fig6.jpg "/>
Figur 6. Fotografier för att visa sidan-bild av flugor. Det tunna skiktet av saltlösning kläms mellan 40X vatten nedsänkning linsen och flyga.
Figur 7. Schematisk för att göra Washi papperet veken. Gampi-Washi papper är en traditionell japansk pergament som är extremt tunn och smidig (Haibara, Japan). Det är också mycket stark och kan kvarhålla en stor mängd vätska. Den Washi papper måste skäras i en trapets med mycket speciella mått, 0,3 mm och 0,7 mm i bredd och 4-5 mm i längd (a). Detta trapetsoiden sedan införs från 0,7 mm sida i spetsen av en 23 G injektionsnål och kan även stabiliseras genom infogning av en insekt tapp, som är böjd till en V-form (b). C blir Washi papper transparent efter exponeringtill en vätska, vilket gör den idealisk för detta experiment.
Figur 8. Stimulering av snabel på flugor med Washi-veken. Den Washi papper veken på spetsen av en injektionsnål tillämpas för ett ögonblick med hjälp av en joystick manipulator med en hand. Nålen är ansluten via en böjlig slang till en injektor manipuleras med den andra handen, för att suga och urladdning sackaroslösning.
Figur 9. Representativa resultat. en, PER beteende spelas in via CCD-kameran installerad på stereomikroskop. Frontala vyer av en svältfödd fluga med förlängd SNABEL (pilar) före stimulering, vid stimulering, och efter stimulering med en veke som innehåller 100 mM lösning sackaros vattenhaltig (pilspets). Belysning åstadkommes genom en 491 används nm laserför GCaMP fluorescens. B, sackaros-inducerade GCaMP 3,0 respons i motorn neuron för gradskivan av talarstolen muskel i svalt tillstånd. Den övre panelen, före stimulering; bottenpanelen, omedelbart efter stimuleringen. Skalstrecket, 10 | im. C Kvantifiering av sackaros-inducerad GCaMP 3,0 respons. Motorneuronen svarar på en sackaros stimulus genom en skarp ökning i fluorescens följs av en återställande fas av flera sekunder till baslinjen.
Discussion
Flugorna tillåter samtidig inspelning av Ca 2 +-signaler och Per beteende. Även med hjärnan utsätts för saltlösning normalt PER beteende observerades. Använda Gampi-Washi veke istället för en Kimwipe veke som används i den ursprungliga kapillär method7 underlättar en mycket reproducerbar och stabil PER beteende och undviker behovet att bli skicklig i att göra och välja en bra Kimwipe veke. De experimentella tips ovan tillät oss att framgångsrikt undvika störningar genom rörelse av snabel, vilket leder till en mycket stabil inspelning av Ca 2 +-signaler med låg ljudnivå. Ibland var borttagande av vävnad inte tillräcklig för att exponera cellerna eller undertrycka rörelsen tillräckligt, vilket leder till dåliga resultat. Men när vi var skickliga, producerade mer än 80% av förberedelser goda resultat. Denna metod är inte bara för Ca 2 + avbildning, men kan också anpassas till varje levande avbildning medan du observerar PER beteende. Till exempel kan vi komma någon cell genomanvändning av en elektrod direkt registrera aktivitet. Kombineras med tvåfotonexcitering mikroskopi, är vi i stånd att utföra avbildning tidsförloppet av synaptisk struktur, som kan vara relaterad till förändringar av beteendet. Därför är denna metod för avbildning av hjärnan med beteendeobservationer inte bara värdefulla för den funktionella dissektion av det neuronala nätverket, men kan användas som ett kraftfullt verktyg för att korrelera synaptisk plasticitet 14 till mekanismerna bakom minnet.
Acknowledgments
Jag tackar L Watanabe, M Gorczyca och andra medlemmar av Yoshihara labbet för värdefulla kommentarer och diskussion. Jag tackar K. Scott och L. Looger för Fly bestånd, S Yokoyama för att visa experiment Shinya Iguchi för teknisk hjälp och Nobuko Yoshihara för väsentlig information. Detta arbete stöddes av National Institute of Mental Health Grants MH85958 och Worcester Foundation för MY
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tetric EvoFlow | Ivoclar vivadent | M04115 | Light-curing glue |
| BX51WI Microscope | Olympus Corporation | BX51WI | With 40X (N.A. 0.8) water immersion objective lens |
| Spinning disk confocal microscope system | PerkinElmer, Inc. | With 491 nm laser | |
| Stereomicroscope | Nikon Instruments | SMZ-800 | Attached to a swing arm. Stereo view is still available with video recording |
| Gampi-Washi paper | Haibara, Japan | A special kind of traditional Japanese paper | |
| CCD camera | Imaging Source | DFK41AU02 | 1/2" 1080 × 960 pixels SONY CCD |
| Joystick manipulator | Narishige International | MN-151 | |
| Injector | Narishige International | IM-5B |
References
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).
- Lima, S. Q., Miesenbock, G. Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons. Cell. 121, 141-152 (2005).
- Schroll, C. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).
- Hamada, F. N. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454, 217-220 (2008).
- Peabody, N. C. Characterization of the decision network for wing expansion in Drosophila using targeted expression of the TRPM8 channel. J. Neurosci. 29, 3343-3353 (2009).
- Dethier, V. G. Hungry Fly. , Harvard University Press. (1976).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. Proboscis Extension Response (PER) Assay in Drosophila. J. Vis. Exp. (3), e193-e193 (2007).
- Marella, S. Imaging taste responses in the fly brain reveals a functional map of taste category. 49, 285-295 (2006).
- Tian, L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
- Yoshihara, M., Suzuki, K., Kidokoro, Y. Two independent pathways mediated by cAMP and protein kinase A enhance spontaneous transmitter release at Drosophila neuromuscular junctions. J. Neurosci. 20, 8315-8322 (2000).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J. Neurogenet. 18, 377-402 (2004).
- Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. Biology of Drosophila. M, D. emerecm , John Wiley & Sons. 420-534 (1950).
- Gordon, M. D., Scott, K. Motor control in a Drosophila taste circuit. Neuron. 61, 373-384 (2009).
- Yoshihara, M., Adolfsen, B., Galle, K. T., Littleton, J. T. Retrograde signaling by Syt 4 induces presynaptic release and synapse-specific growth. Science. 310, 858-863 (2005).
