Summary
Die Fruchtfliege,
Abstract
Um neuronale Netze im Hinblick auf ihre Funktion im Verhalten zu studieren, müssen wir analysieren, wie Neuronen, wenn jedes Verhaltensmuster erzeugt betreiben. Damit sind simultane Aufnahmen von neuronaler Aktivität und Verhalten wesentlich für die Hirnaktivität, um das Verhalten korrelieren. Für solche Verhaltens-Analysen, ermöglicht die Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, uns genetisch kodierte Kalzium-Indikatoren wie GCaMP 1 integrieren, um neuronale Aktivität zu überwachen und zu anspruchsvoll für genetische Manipulationen oder optogenetische thermogenetisch Techniken verwenden, um speziell Neuronen identifiziert 5.2 aktivieren. Die Verwendung eines thermogenetisch Technik hat uns dazu veranlasst, kritisch Neuronen für Fressverhalten (Flood et al., In Überarbeitung) zu finden. Als Hauptteil des Fressverhalten, erstreckt sich ein Erwachsener Drosophila ihrem Rüssel für die Zuführung 6 (Proboscis Extension Response; PER), der einem süßen Reiz aus Sinneszellen auf ihrem Rüssel oder Tarsen. Combining das Protokoll für PRO 7 mit einem Kalzium-Imaging-Technik mit 8 GCaMP3.0 1, 9, habe ich ein experimentelles System, in dem wir Aktivität von Neuronen im Ernährungszentrum überwachen können etabliert - die Subösophagealen Ganglion (SOG), gleichzeitig mit Verhaltensbeobachtung des Rüssels. Ich habe ein Gerät ("Fly Gehirn Live-Imaging und Elektrophysiologie Stage": "fliegt") entwickelt, um eine Drosophila Erwachsenen unterbringen, so dass ihrem Rüssel, sich frei zu bewegen, während sein Gehirn ist mit dem Bad für die Ca 2 +-Imaging ausgesetzt durch ein Wasserbad Immersionslinse . Die Fliegen ist auch geeignet für viele Arten von Live-Experimente auf Fliegenhirn wie elektrophysiologische Ableitung oder Zeitraffer-Aufnahme von synaptischen Morphologie. Da die Ergebnisse von Live-Bildgebung kann direkt mit der gleichzeitigen PRO Verhalten korreliert werden, kann diese Methode eine ausgezeichnete experimentelles System zur Verarbeitung von Informationen in neuronalen Netzwerken zu untersuchen, und wie diese cextrazelluläres Tätigkeit sich auf Kunststoff-Prozesse und Speicher gekoppelt.
Protocol
1. Der Bau der Fliegen
- Gestalten Sie eine Plattform aus dem Deckel von 35 mm Falcon Gericht durch Schmelzen der Seitenwand und Carving es, einen geeigneten Winkel und Dicke (Abbildung 1a, Abbildung 2) zu bilden. Ein Loch in der Plattform, die Fliege Kopf (1a, b), so dass die Mundwerkzeuge frei nach außen von der Kammer (1a) ausgesetzt zu akzeptieren. Schneiden Sie das Ende einer Pipetman Spitze, mit der Größe passend zur Fliege zu beachten. Kleben Sie die Spitze an der Plattform, wie in Abbildung 1a dargestellt, um die Fliegen (Abbildung 2) zu vervollständigen.
2. Vorbereiten des Fly for Observation
- Hungern einen erwachsenen Fliege für 24 Stunden bei 25 ° C vor dem Experiment, indem Sie es in einem Fläschchen mit nur einem feuchten Papiertuch, wenn Hunger ist notwendig.
- Betäuben die Fliege, indem Sie es in einer 15ml Plastikröhrchen Stehen auf Eis.
- Mit einer Pinzette, legen Sie eine Fliege in der Kammer desFliegt, und schieben Sie die Fliege, bis sie unfähig sich zu bewegen ist. Dann wird ein Pfropfen, die Fliege zu behalten. (Abb. 1a, b).
- Versiegeln Sie die umliegenden Teile der proximalen Rüssel (Rostrum) bis zur Innenkante des Loches; Eine kleine Menge von lichthärtenden Klebstoff (Tetric EvoFlow) zu den Seiten und über dem Rednerpult von außen (Pfeile in Abb. 3). Auch den Leim von der Innenseite der Fliegen in den Raum zwischen den dorsalen Teil des Kopfes und dem inneren Rand des Loches (1b). Damit das Rednerpult frei zu bewegen, sollte darauf geachtet werden, keinen Leim von der Berührung der Tribüne mit der Wimper zu (oder etwas Vergleichbares), um den Kleber zu verbreiten verhindern. Schließlich heilen Sie den Kleber mit dem schwächsten Bestrahlung mit blauem Licht ausreichend für die Heilung nicht zu beschädigen die Fliege vor übermäßiger Hitze. Ziehen Sie den Netzstecker.
- Ein Thread auf die Tribüne teilweise angehoben (Pfeil in Abbildung 3) halten kann, um die Fliege zu stabilisieren "Kopf durch die Vermeidung des Bump-Rachen-Teil zu SOG und den ventralen Teil des SOG aussetzen, vor allem für die Bildgebung präsynaptischen Enden der Nervenzellen Gr5a 8, die durch einen Teil des Rachens, wenn der Rüssel vollständig eingefahren abgedeckt sind.
- Füllen der Oberfläche der Plattform mit einer zuckerfreien Salzlösung, enthaltend (in mM): NaCl, 140; KCl, 2, MgCl 2, 4,5; CaCl 2, 1,5 und HEPES-NaOH, 5 mit einem pH-Wert von 7,1 10. Das Saccharose-freie Kochsalzlösung hat ähnliche Tonus zu denen häufig verwendete Saccharose-haltige Salines wie HL3.1 11.
- Öffnen Sie den Kopf Kapsel mit einem Wolfram-Klinge und Pinzette mit scharfen Spitzen wie eine Schere, die eine Sonderanfertigung ist und ursprünglich von Dr. Kageyuki Yamaoka, Japan, entwickelt, um die Nagelhaut schneiden und in der Luftröhre, um die SOG (Abbildung 4) freizulegen. Die ventralen Rand des Kopfes Kutikula wurde als ventrale wie möglich geschnitten, während die dorsalen Kante geschnitten war nicht so kritisch. Erstens, stellen einen Einschnitt durch diehinteren Rand mit einem Wolfram-Klinge. Dann, in der Seite abgeschnitten und die vorderen Kanten mit Hilfe der Pinzette geschärft. Der Schnitt Nagelhaut Stück sollte mit der Pinzette angehoben und entfernt werden. Antennen und antennalen Nerven sollte von den geschärften Zange geschnitten werden.
- Um Bewegungsartefakte während Aufnahmen zu vermeiden, muss das Gehirn durch die Beseitigung von bestimmten Teilen der Fliege stabilisiert werden. Erstens, selektiv zu entfernen Luftsäcke zwischen der SOG und Nagelhaut. Schneiden der Speiseröhre am Ende in Richtung des Rachens und am Ende gehen in die SOG, um die Verbindung zwischen dem Pharynx und dem Gehirn zu entfernen. Dann ziehen Sie Muscle 16 12, und schließlich lösen keine Luftröhre verbindet das Gehirn und die Nagelhaut.
- Wir setzen unsere Fliegen auf der Bühne einer Olympus BX51WI Mikroskop verbunden mit einem Spinning-Disk-konfokalen Mikroskop-System (Improvision in PerkinElmer) (Abbildung 5). Ein Wasser-Immersionslinse, zB 40X/0.8 NA, wurde in das Bad (6 eingetaucht
3. Ca 2 +-Imaging of the Brain
- Ca 2 +-Imaging unter Verwendung GCaMP3.0 1, 9 wurde durch das Verfahren Marella et al errichtet wird. 8 (Abbildung 6). Mit einem Spinning-Disk-konfokalen Mikroskop (Improvision), nehmen Sie einen einzelnen optischen Schnitt bei 4 Hz mit einer Belichtungszeit von 122ms mit 491nm Anregungslasers, wobei der Schwerpunkt auf der Region of Interest (eine Zelle Körper eines motorischen Neurons, oder ein Interneuron oder präsynaptischen von Geschmacks-sensorischen Neuronen) mit Velocity Software, Ver. 4,3 (Improvision).
4. Stimulierung der Proboscis
- Aspirieren 100 mM wässrige Saccharoselösung in einer Injektionsnadel mit einem kleinen Docht (aus Japanpapier, siehe Tabelle der spezifischen Reagenzien), die von der Spitze (Abbildung 7).
- Entladen Sie einen kleinen Tropfen Zuckerlösung auf den Docht, dann absaugen es, unmittelbar vor deme Anwendung des getränkten Docht Washi-Papier an der Spitze des Rüssels. Die Washi-Papier Docht sollte nur für einen Augenblick bis zur Sättigung (Abbildung 8) zu vermeiden, angewendet werden. Überwachen Sie die Proboscis extension response (PER) Verhalten mit einer CCD-Kamera, die an einem Dissektionsmikroskop (Abbildung 5) gleichzeitig mit Ca 2 +-Imaging. Die Daten müssen innerhalb einer Stunde nach Beginn der Dissektion, weil die pro Antwort wird nicht mehr als eine Stunde unter diesen Bedingungen gehalten genommen werden.
5. Repräsentative Ergebnisse
Motoneuronen des Rostrum Winkelmesser, ein Paar wichtigen Muskeln verantwortlich für die Aufhebung der Tribüne für Proboscis Extension, wurde berichtet, dass robuste Reaktionen auf Reize süßen 13 zeigen. Abbildung 9 zeigt, Ca 2 +-Signale durch GCaMP3.0 1, 9, ausgedrückt durch ein Gal 4-Treiber, E49 13, aus einem Zellkörper der Motoneuronen. Wie im Video, ein Robu gezeigtRunde PRO wurde synchron mit einem Anstieg der Ca 2 +-Signal beobachtet.
Abbildung 1. Schematische Darstellung des Gehirns Fly Live-Imaging und Elektrophysiologie Stage (Fliegen). A: Der FLIEGEN so gebaut, dass der Winkel der Wand für die Fliege den Kopf zu kommen geraden ermöglicht. Drei Segmente der Fliege Rüssel sind farblich gekennzeichnet, die Tribüne ist Magenta. Die Fliege in der Kammer wird mit einer Pinzette eingelegt, und ein Stück vom Ende einer Pipetman Spitze abgeschnitten ist an der Rückseite der Kammer, die Fliege an der Flucht zu blockieren. B, wird das Loch gebohrt, um an der Fliege Kopf entsprechen. Die verbleibenden Lücken werden mit einem lichthärtenden Klebstoff abgedichtet wie angegeben um sicherzustellen, dass keine Lecks vorhanden sind. Nachdem der Kleber ausgehärtet ist, wird die Spitze Pipetman als Plug entfernt. Salzlösung wird in die FLIEGEN, dass die Oberfläche des Gehirns vollständig bedeckt gegossen. Es sollte sichergestellt werden, dass es keine Leckage Salzlösung werdenÝng hinaus auf das vordere Ende der Fliege Kopf. Der schraffierte Bereich durch die gestrichelte Linie im Diagramm b umgeben ist der Teil, um sich zu präparieren.
Abbildung 2. Foto der Fliegen. Die halbmondförmigen Wand Klebstoff (von einer Klebepistole) wird um den Strom von Kochsalzlösung während der Perfusion zu steuern, und die Menge an Salzlösung, zu verringern.
Abbildung 3. Frontansicht einer Fliege montiert in the Flies. Dieses Bild zeigt, wie eine Fliege in den Fliegen eingestellt ist, und wie die lichthärtende Kleber um den Kopf der Fliege (Pfeile), um eine Kochsalzlösung-Abdichtung schaffen wird. Wenn irgendwelche Lecks Kochsalzlösung durch den Rüssel der Fliege, dann das Experiment schlägt fehl. Das Gewinde (Pfeilspitzen) angebunden an der Bühne ist, um den Rüssel in Position zu halten, so dass es nicht vollständig Retraktion Ted. Sonst wäre es behindern die mehr ventralen Teil des SOG und verursachen Bewegungsartefakte.
Abbildung 4. Top-view of the Flies mit einer Fliege seziert. Dieses Bild zeigt den exponierten SOG einer Fliege folgenden Nagelhaut entfernen. Die Speiseröhre, Muskel 16 und Tracheen mit dem Gehirn verbunden, sowie ausgewählte Luft-Säcken wurden ebenfalls entfernt, um sie von Störung des Gehirns, die, um Artefakte in den Calcium-Signale führen kann verhindern.
Abbildung 5. Die Vorrichtung zur Überwachung. Dieses Gerät wird von einem Olympus Mikroskop BX51WI an einem Spinning-Disk-konfokalen Mikroskop-System (Improvision) montiert, und eine Nikon SMZ800 Mikroskop seitlich montierten. Dieser Aufbau ermöglicht die Live-Bildgebung von Hirnaktivität während PER Verhalten.
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Abbildung 6. Fotos, um die Seitenansicht der Fliegen zu zeigen. Die dünne Schicht von Kochsalzlösung wird zwischen dem Wasser-40X Immersionslinse und der Fliege eingeklemmt.
Abbildung 7. Schematische zur Herstellung des Washi-Papier Docht. Gampi-Washi-Papier ist ein traditionelles japanisches Pergament, die extrem dünn und glatt (Haibara, Japan) ist. Es ist auch sehr stark und kann eine große Menge an Flüssigkeit zu halten. Die Washi-Papier muss in ein Trapez mit sehr spezifischen Abmessungen geschnitten werden; 0,3 mm und 0,7 mm in der Breite und 5.4 mm in der Länge (a). Diese trapezförmige wird dann von der Seite 0,7 mm in die Spitze einer subkutanen Nadel 23 G eingesetzt und kann auch durch die Einfügung eines Insekts Stift, der mit einer V-Form (b) gebogen ist, stabilisiert werden. C wird das Papier Washi transparent nach Expositionzu einer Flüssigkeit, wodurch es ideal für dieses Experiment.
8. Die Stimulation des Rüssels an den Fliegen mit dem Docht-Washi. Die Washi Papier Docht an der Spitze einer subkutanen Nadel für einen Augenblick mit dem Joystick Manipulator mit einer Hand aufgebracht. Die Nadel wird durch einen Schlauch mit einem Injektor mit der anderen Hand manipuliert verbunden ist, zum Ansaugen und Abgeben Saccharoselösung.
Abbildung 9. Repräsentative Ergebnisse. ein, PER Verhalten durch die CCD-Kamera auf dem Stereomikroskop installiert aufgezeichnet. Frontalansicht eines verhungerten Fliege mit einem erweiterten Rüssel (Pfeile) vor der Stimulation, bei der Stimulation und nach der Stimulation mit einem Docht, der 100 mM Saccharose wässrigen Lösung (Pfeilspitze). Die Beleuchtung wird von einem 491-nm-Laser verwendet, erreichtfür GCaMP Fluoreszenz. b, 3,0 GCaMP Reaktion im motorischen Neurons für den Winkelmesser der Tribüne Muskel im ausgehungerten Zustand Saccharose-induziert. Die obere Platte, vor der Stimulation, die Bodenplatte, unmittelbar nach der Stimulation. Scale-Bar, 10 um. C, Quantifizierung des Saccharose-induzierte 3,0 GCaMP Antwort. Der Motor Neuron reagiert auf einen Saccharose-Stimulus von einem starken Anstieg in der Fluoreszenz durch eine Restaurierung Phase von mehreren Sekunden bis zur Grundlinie folgte.
Discussion
Die Fliegen ermöglicht die gleichzeitige Aufnahme von Ca 2 +-Signale und PRO Verhalten. Auch mit dem Gehirn ausgesetzt Kochsalzlösung normalen PRO wurde beobachtet. Verwenden des Gampi-Washi Docht anstelle von einem Kimwipe Docht in der ursprünglichen Kapillare verwendet method7 ermöglicht eine hoch reproduzierbare und stabile PRO Verhalten und vermeidet die Notwendigkeit, sich bei der Gestaltung und der Auswahl einer Kimwipe Docht Fachmann. Die experimentellen Spitzen oben erwähnt erlaubt es uns, erfolgreich zu vermeiden Störungen durch die Bewegung des Rüssels, was zu einer sehr stabilen Aufnahme von Ca 2 +-Signale mit geringer Geräuschentwicklung. Gelegentlich wurde Gewebeentfernung nicht ausreicht, um Zellen zu exponieren oder zu unterdrücken Bewegung ausreichend, was zu schlechten Ergebnissen. Allerdings, wenn wir qualifizierte waren, produzierte mehr als 80% der Präparate gute Ergebnisse. Diese Methode ist nicht nur für Ca 2 +-Imaging, kann aber auch zu jedem Live-Bildgebung angepasst werden unter Beachtung PRO Verhalten. Zum Beispiel können wir auf eine beliebige Zelle durch dieVerwendung einer Elektrode zur direkten Aufzeichnung Aktivität. Kombiniert mit zwei-Photonen-Anregung Mikroskopie, sind wir in der Lage, Zeitraffer-Aufnahme von synaptischen Struktur, die zu Verhaltensänderungen in den Bereichen durchführen können. Daher ist diese Methode der Bildgebung des Gehirns mit Verhaltensbeobachtung nicht nur wertvoll für die funktionale Zerlegung des neuronalen Netzes, könnten aber als ein mächtiges Werkzeug, um synaptische Plastizität 14 zu den Mechanismen, die hinter Speicher korrelieren verwendet werden.
Acknowledgments
Ich bedanke mich bei L Watanabe, M Gorczyca und andere Mitglieder der Yoshihara Labor für hilfreiche Kommentare und Diskussionen. Ich danke K. und L. Scott Looger für Fliegenfischer Aktien, S Yokoyama für den Nachweis der Experimente, Shinya Iguchi für technische Hilfe, und Nobuko Yoshihara für wesentliche Informationen. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Mental Health Grants MH85958, und der Worcester Foundation auf MY unterstützt
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tetric EvoFlow | Ivoclar vivadent | M04115 | Light-curing glue |
| BX51WI Microscope | Olympus Corporation | BX51WI | With 40X (N.A. 0.8) water immersion objective lens |
| Spinning disk confocal microscope system | PerkinElmer, Inc. | With 491 nm laser | |
| Stereomicroscope | Nikon Instruments | SMZ-800 | Attached to a swing arm. Stereo view is still available with video recording |
| Gampi-Washi paper | Haibara, Japan | A special kind of traditional Japanese paper | |
| CCD camera | Imaging Source | DFK41AU02 | 1/2" 1080 × 960 pixels SONY CCD |
| Joystick manipulator | Narishige International | MN-151 | |
| Injector | Narishige International | IM-5B |
References
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